Штамм escherichia coli - продуцент l-гистидина

 

Предлагается новый штамм Escherichia coli ВКПМ В-7270-продуцент L-гистидина. Штамм получен путем отбора новой мутации в гене his G гистадиенового оперона и последующего введения в него внеоперонных мутаций, повышающих экспрессию гистадинового оперона. Указанный штамм устойчив к сульфагуанидину, D, L - 1,2,4 - триазол-3-аланину и стрептомицину и позволяет получать 16 - 17 г/л L-гистидина. Степень конверсии глюкозы в гистидин 24 - 26%. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм бактерии Escherichia coli, продуцирующих аминокислоту гистидин. L-гистидин - незаменимая аминокислота, используемая в качестве компонента питательных смесей медицинского назначения и ростового фактора для ряда продуцентов первичных метаболитов. В химической и фармацевтической промышленности гистидин используется для получения препаратов гистамина и урокановой кислоты.

Известны штаммы-продуценты гистидина, принадлежащие к различным видам микроорганизмов (Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium acetoacidophilum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Arthrobacter citreum, Nocardia globerula, Bacillus subtilis, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens) (патент США 37136977; патент США 3716453; патент США 5294547; патент Японии 61 - 41554; патент США 4388405; Sigiura M. , Kisumi M., 1984, Appl. Environ. Microbiol. v. 48, p. 43 - 49; Mizukami T., Hamu A., Ikeda M., Oka T., Katsumata R. , 1994, Bioscience, Biotech. Biochem., v. 58, p. 635 - 638). Наиболее эффективными продуцентами гистидина являются плазмидные штаммы Serratia marcescens (патент Японии 61-271981). Эти продуценты содержат мутантный гистидиновый оперон или его фрагмент в составе низкокопийной плазмиды и способны накапливать за 120 ч до 45 г/л гистидина. Однако недостатками плазмидных штаммов - продуцентов гистидина является необходимость добавления антибиотиков в ферментационную среду для поддержания плазмиды с клонированным геном, замедленный рост плазмидных продуцентов и вследствие этого увеличение продолжительности ферментации. До настоящего времени не были получены эффективные продуценты гистидина среди представителей E. coli. Известен бесплазмидный штамм E. coli 24 (патент РФ 2003677), продуцирующий 10 - 12 г/л гистидина за 72 ч ферментации в лабораторных условиях. Этот штамм выбран нами в качестве прототипа. Недостатком штамма-прототипа является его низкая продуктивность и низкая конверсия глюкозы в гистидин, которая составляет 18 - 20%.

Задачей изобретения является создание бесплазмидного штамма E. coli с более высокой продуктивностью и повышенной конверсией глюкозы в L-гистидин. Задача достигается созданием нового штамма E. coli 80, который за 68 ч ферментации в лабораторных условиях накапливает в среде 16 - 17 г/л гистидина, конверсия глюкозы в гистидин составляет 25%.

Штамм E. coli 80 получен путем направленной селекции с применением N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина в качестве мутагенного фактора. В качестве исходного штамма использован штамм E. coli CC14, описанный нами ранее (Чахмахчян С.С., Клячко Е.В., Шакулов Р.С., Домкин В.Д., 1992, Молек. генетика, микробиология и вирусология, с. 15 - 18). Этот штамм содержит гистидиновый оперон дикого типа и не продуцирует гистидин. Новый штамм E. coli 80 отличается от исходного тремя особенностями: мутацией в гене hisG, обуславливающей резистентность первого фермента пути биосинтеза гистидина АТФ-фосфорибозилтрансферазы к смеси гистидина и сульфагуанидина, усилением транскрипции гистидинового оперона, а также внесением рибосомной мутации, обеспечивающей резистентность к стрептомицину.

Для получения E. coli 80 исходный штамм Escherichia coli CC14 обрабатывают N-метил-N'-нитро-N- нитрозогуанидином по стандартной методике (Миллер Дж. , Эксперименты в молекулярной генетике. - М.: Мир, 1976). Среди штаммов, резистентных к 500 мкг/мл гистидина и 50 мкг/мл сульфагуанидина, отбирают штаммы, способные к накоплению гистидина в культуральной жидкости. В один из них названный E. coli 70 с помощью фага P1 из E. coli CP 78 (Fiil N., Friesen J. D., 1968, J. Bacteriol., v. 95, p. 729 - 731) переносят дикий аллель гена purF. Используя штамм E. coli 70 (purF+) в качестве родительского, получают клоны, резистентные к аналогу гистидина D,L-1,2,4-триазол-3-аланину (TPA) и стрептомицину. Среди этих клонов отбирают штамм с повышенной способностью продуцировать гистидин, названный E. coli 80.

Новый продуцент гистидина E. coli 80 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ B-7270.

Новый штамм E. coli ВКПМ B-7270 имеет следующие культурально-морфологические и биохимические признаки.

Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательная слабоподвижная палочка с закругленными концами длиной 1,5 - 2,0 мкм. Спор не образует.

На полноценной агаризованной среде (агар Луриа, агар Хоттингера) через 48 ч, а на синтетической среде через 72 ч инкубации при 30^oC образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 2 мм. Поверхность колоний гладкая, края ровные, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируются.

На синтетической среде клетки продуцента требуют витамин B1, а также L-пролин.

Штамм поддерживают на чашках с плотной синтетической солевой средой следующего состава, г/л: Глюкоза - 10,0 Трис-(оксиметил)-аминометан - 6,05 Сульфат аммония - 2,0 Сульфат магния - 0,2 Цитрат натрия - 1,0 Калий хлористый - 2,0 Калий фосфорно-кислый однозамещенный - 0,028 Тиамин - 0,002 Пролин - 0,1
Стрептомицин - 1,0
Агар - 20
Вода дистиллированная до 1 л pH - 7,4 - 7,6
Физиолого-биохимические признаки. Штамм является ауксотрофом по пролину.

Факультативный анаэроб. При посеве уколом в полноценный агар хороший рост по всему уколу. Желатину не разжижает. Усваивает глюкозу, мальтозу, маннит, галактозу, сорбит, глицерин. Не потребляет сахарозу, лактозу, рафинозу.

Устойчив к стрептомицину.

Содержит мутацию по гену hisG, следствием которой является десенсибилизация АТФ-фосфорибозилтрансферазы в отношении гистидина.

Усваивает азот в форме аммония, нитратов, а также азот некоторых органических соединений.

Растет при температуре 43^oC и ниже. Оптимальной для роста является температура 37^oC, а для продукции гистидина - 29 - 30^oC.

Растет на жидких средах с pH от 6,0 до 8,0. Оптимальное значение pH 7,0.

Штамм за 68 ч ферментации накапливает 16 - 17 г/л гистидина.

Хранение штамма. Посевной материал смешивают с равным объемом 80% глицерина и хранят при -70^oC.

Пример 1. Культуры штаммов E. coli 80 и E. coli 24 выращивают на минимальной агаризованной среде при 29^oC в течение 65 ч. Для получения посевного материала культуры засевают в пробирки объемом 50 мл, содержащие 2 мл посевной среды следующего состава, г/л:
Глюкоза - 56
Аммоний серно-кислый - 28
Калий фосфорно-кислый однозамещенный - 2,25
Магний серно-кислый, 7-водный - 1,125
Железо (II) серно-кислое, 7-водное - 0,01
Марганец (II) серно-кислый, 4-водный - 0,01
Тиамин - 0,001
Автолизат дрожжей - 2,8
Пролин - 0,3
Стрептомицин - 1,0
Вода дистиллированная до 1 л pH - 6,0
Культивирование проводят в течение 20 ч на термостатируемой круговой качалке (200 - 240 об./мин) при 20^oC.

Выращенный посевной материал в количестве 5 об.% вносят в ферментационную среду. Ферментационная среда имеет следующий состав, г/л:
Глюкоза - 92
Аммоний серно-кислый - 28
Калий фосфорно-кислый однозамещенный - 2,25
Магний серно-кислый, 7-водный - 1,125
Железо (II) серно-кислое, 7-водное - 0,01
Марганец (II) серно-кислый, 4-водный - 0,01
Тиамин - 0,001
Автолизат дрожжей - 2,8
Пролин - 1,0
Стрептомицин - 1,0
Мел - 65
Вода дистиллированная до 1 л pH - 6,0
Культивирование проводят в микробиологических пробирках объемом 50 мл, содержащих 2 мл ферментационной среды. Через 68 ч культивирования на круговой качалке (350 об./мин) при 29^oC в культуральной среде определяют содержание гистидина методом бумажной хроматографии с последующим окрашиванием нингидрином.

Результаты ферментации приведены в таблице.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ B-7270 - продуцент L-гистидина.

РИСУНКИ

Рисунок 1