Способ определения гомоцистеина в пробе и набор для его осуществления

 

Способ предназначен для определения гомоцистеина в пробе и может быть использован для диагностики и лечения в медицине и биотехнологии. Пробу контактируют с ферментом S-аденозилгомоцистеингидролазой ( SAH-аза) в присутствии субстрата, отличного от гомоцистеина. После завершения ферментативной реакции аналит оценивают без хроматографического разделения продуктов реакции. В качестве аналита используют немеченный аналит, выбранный из аденозина, аналога аденозина и S-аденозилгомоцистеина. Способ не требует использования дорогостоящего и трудоемкого хроматографического разделения и позволяет проводить определение в клинической лаборатории. 2 с. и 38 з.п. ф-лы.

Изобретение касается способа определения гомоцистеина в пробе и набора для его осуществления.

Гомоцистеин представляет собой промежуточную аминокислоту, образующуюся при метаболизме метионина до цистеина. Обычно гомоцистеин, продуцируемый в теле, быстро метаболизируется по одному из двух путей: [1] конденсации с серином с образованием цистатиона или [2] превращения в метионин, и его концентрация/ и концентрация его окисленной формы, гомоцистеина в живом теле при нормальных условиях практически незначительна.

Однако уровни гомоцистеина в биологических пробах могут иметь клиническое значение в ряде ситуаций, т.к. гомоцистеин играет важную роль в сложном ряду биохимических путей, которые пополняют метаболизм содержащих сульфгидрильные группы аминокислот, и его накопление может свидетельствовать о различных нарушениях, происходящих в этих метаболических путях, в том числе, в частности, о врожденных отклонениях метаболизма. Так, например, известно, что гомоцистинурия (аномальное образование гомоцистеина в моче) является нарушением аминокислотного метаболизма, вызываемым недостаточностью ферментов цистатион-β-синтетазы или метилтрансферазы метилтетрагидрофолиевой кислоты, которая катализирует метилирование гомоцистеина до метионина/.

Метаболизм содержащих сульфгидрильные группы аминокислот тесно связан с метаболизмом фолиевой кислоты и витамина B₁₂ /кобаламина/, которые функционируют в качестве субстратов или кофакторов в различных превращениях. По этой причине было предложено также считать накопление гомоцистеина индикатором нарушения функции кобаламина или фолат-зависимых ферментов или других нарушений или заболеваний, связанных с метаболизмом кобаломина или фолата.

Кроме того, поскольку превращение гомоцистеина в метионин основано на реакции, требующей участия S-метилтетрагидрофолата в качестве донора метила, на метаболизм гомоцистеина могут также влиять антифолатные лекарственные средства, такие как метотрексат, введенные для борьбы с другими нарушениями, в том числе с раком. Поэтому предлагалось наблюдать за уровнем гомоцистеина при проведении лечения злокачественного заболевания антифолатными лекарственными средствами.

Позднее было показано, что повышенные уровни гомоцистеина в крови коррелируют с развитием атеросклероза (см. Clarke, et al., New Eng. J. Med. 324: 1149-1155 /1991/, и даже умеренная гомоцистеинемия рассматривается в настоящее время как фактор риска для сердечных и сосудистых заболеваний. Таким образом, измерение уровней гомоцистеина в плазме или в крови имеет также значение в диагностике и лечении сосудистых заболеваний.

Хотя иммунологические способы прямого определения гомоцистеина недоступны в связи с отсутствием доступных антител к гомоцистеину, был предложен ряд других способов определения гомоцистеина в клинических пробах. Все они предусматривают хроматографические разделения и обычно основаны на одном из следующих принципов: (1) классический хроматографический анализ аминокислот, (2) реакция гомоцистеина в пробе с ферментом S-аденозил-L-гомоцистеингидролазой в присутствии радиоактивно или иным способом меченого S-аденозина в качестве субстрата с последующим разделением и количественным определением образовавшегося продукта /S-аденозил-L-гомоцистеина, SAN/. Как правило, применяют хроматографическое разделение /ЖХВР или тонкослойную хроматографию/ и измерения радиоактивности /см. Refsum et al., Clin. Chem. 31:624-628 /1985/; Kredich et ai., Anal. Biochem. 116:503-510 /1981/; Chui. Am. J. Clin. Path. 90 /4/: 446-449 /1988/; Totani et al., Biochem. Soc. 14/6/:1172-9 /1988/; и Schimizu et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 8:153-159 /1986// (3) реакция гомоцистеина в пробе с флуорофором с последующим разделением при помощи ЖХВР и флуорометрии /см. Refsum. et al., Clin. Chem, 35 (9): 1921-1927 (1989)).

Эти способы трудоемки, занимают много времени и основаны на непосредственном количественном определении. Более конкретно, хроматографическое разделение является общей чертой способов, применяемых ранее, и требует высокоспециализированного и сложного в обращении оборудования.

Применение такого оборудования обычно не приветствуется, в рутинной практике клинической лаборатории и поэтому подобные способы, как правило, не поддаются автоматизации в типичных клинических лабораторных процедурах.

Поэтому существует необходимость разработки улучшенного теста на гомоцистеин, который был бы простым, специфичным, быстрым в проведении, легко приспосабливаемым для применения в клинических лабораториях и, что важнее всего, не требовал бы дорогостоящего и длительного хроматографического разделения. Данное изобретение представляет собой попытку обеспечения такого теста. Таким образом, одним аспектом данного изобретения является обеспечение способа определения гомоцистеина в пробе, предусматривающего стадии контактирования пробы с превращающим гомоцистеин ферментом, например, S-аденозилгомоцистеин /SAH/-гидролазой, и по меньшей мере, одним субстратом для этого фермента, иным, чем гомоцистеин, и оценку /предпочтительно фотометрическую/ без хроматографического разделения реагентов или продуктов реакции немеченного аналита, выбранного из ко-субстрата гомоцистеина и продуктов ферментативного превращения гомоцистеина вышеупомянутым ферментом.

После контактирования пробы с превращающим гомоцистеин ферментом и субстратом ее предпочтительно инкубируют не менее 30 секунд, в частности, по меньшей мере, 5 минут перед проведением последующих стадий.

В качестве превращающего гомоцистеин фермента, применяемого в тесте изобретения, особенно предпочтительна SAH-гидролаза, но можно применять и другие ферменты. Такими ферментами могут быть, например, бетаин-гомоцистеинметилтрансфераза и другие ферменты, участвующие в превращениях гомоцистеина, как описано, например, Graham b Trends Cardiovasc. Med. 1:244 - 249 /1991//.

Ко-субстрат гомоцистеина, подвергаемый оценке в способе по изобретению, представляет собой соединение, которое реагирует с гомоцистеином в катализируемой ферментом, например, SAH-гидролазой, реакции превращения гомоцистеина.

Подразумевается, что применяемый здесь термин "оценка" означает как количественное, так и качественное определение в смысле получения абсолютной величины для количества или концентрации аналита, например, присутствующего в пробе ко-субстрата гомоцистеина, но также в смысле получения показателя, отношения, процента, визуальной или иной величины, свидетельствующей об уровне аналита в пробе. Оценка может быть непосредственной или косвенной, и фактически определяемые химические молекулы, конечно, не должны быть обязательно самим аналитом, а могут быть, например, его производным или каким-либо иным веществом, что обсуждается ниже.

В способе по изобретению применяют либо ферментные, либо иммунологические способы для оценки аналита. В одном из предпочтительных ферментных способов аналит приводят в контакт с ферментом, для которого он является субстратом, и оценивают либо ко-субстрат, либо прямой или непрямой продукт реакции ферментативного превращения аналита этим ферментом. В предпочтительном иммунологическом способе аналит оценивают при помощи процедуры, предусматривающей конкурентное связывание с антителами аналита и другого гаптена /например, полигаптена или меченого аналога аналита/ и оценку связавшегося или несвязавшегося гаптена.

Предпочтительным превращением гомоцистеин ферментом в соответствии с данным изобретением является S-аденозилгомоцистеингидролаза /SAH-гидролаза/, которая катализирует реакцию аденозин + гомоцистеин ⇄ S -аденозилгомоцистеин /SAH/. Реакция имеет константу равновесия K 10⁶ М^-1.

Реакция может протекать в любом направлении в зависимости от условий реакции, концентрации реагирующих веществ и т.д.

В представленной схеме реакции аденозин представляет собой ко-субстрат гомоцистеина. Однако в тест-способе изобретения можно применять и другие ко-субстраты, такие как аналоги аденозина или близкие им соединения.

Изобретение имеет особенное преимущество в том, что гомоцистеин действует как ингибитор SAH-гидролазы, подавляя реакцию гидролиза, в результате которой образуются гомоцистеин и аденозин, и сдвигая равновесие реакции в пользу синтеза SAH.

Таким образом, количество гомоцистеина в пробе косвенно влияет на образование или использование ко-субстрата гомоцистеина, например, аденозина, SAH-гидролазой и тем самым на его конечную концентрацию в реакционной смеси. В изобретении конечную концентрацию или изменение концентрации ко-субстрата гомоцистеина, например, аденозина, в реакционной смеси можно использовать в качестве индикатора исходной концентрации гомоцистеина в пробе. Так, если аналитом является ко-субстрат, то способ по изобретению отличается от известных способов тем, что вместо прямой оценки гомоцистеин оценивают косвенно путем определения концентрации его ко-субстрата при его катализируемом ферментом превращении. Это дает прямое преимущество, заключающееся в том, что могут быть применены способы детектирования, которые пригодны для типичных клинических лабораторных процедур, но не могут применяться в прежних тестах на гомоцистеин, например, фотометрические способы, что делает определение гомоцистеина в соответствии с данным изобретением особенно пригодным для рутинного клинического применения.

В предпочтительном варианте способа по изобретению, SAH-гидролазная реакция может проводиться в любом направлении. Так, если тест-проба контактирует с аденозином и SAH-гидролазой, количество потребленного аденозина, соответствующее количеству потребленного гомоцистеина, и количество гомоцистеина в пробе можно, следовательно, определить по изменению концентрации аденозина. Вместо аденозина можно применять аналоги и /или/ гетерирующие аденозин соединения.

В других предпочтительных вариантах можно использовать противоположное направление реакции. Тест-проба может контактировать с SAH /обычно в избытке/ и SAH-гидролазой. Тогда в результате гидролиза SAH образуются гомоцистеин и аденозин. Любой гомоцистеин, присутствующий в тест-пробе, будет противодействовать нетто-реакции и, следовательно, ингибировать образование аденозина, за количеством которого наблюдают.

Субстратами SAH-гидролазы, применяемыми в способе изобретения, могут, следовательно, быть SAH или аденозин или его аналоги и предшественники.

Многие ферменты участвуют в сложном ряду биохимических путей метаболизма, содержащих сульфгидрильные группы аминокислот в теле. Эти пути и реакции хорошо изучены и исследована регуляторная роль участвующих в них ферментов. Роль одного из таких ферментов, SAH-гидролазы обсуждается в обзоре Ueland в Pharmacological Rewiews 34:223-253 /1982/. Trewyn et al., в J. Biochem. Biophys. Met. 4:299-307 /1981/ описывают исследование регуляторной роли SAH-гидролазы и предлагают тест на SAH-гидролазную ферментативную активность. Carras et al., в Analytical Biochem., 199: 112 - 118 /1991/ описали другие реакционные пути с участием гомоцистеина и, в частности, обеспечили тест на медиированное метионинсинтазой превращение гомоцистеина. Ко-субстраты и продукты превращения этих различных реакций можно применять в качестве аналитов в тесте данного изобретения, в частности, при применении иммунологических средств оценки.

Клинические пробы для тестирования в соответствии с данным изобретением могут быть получены из любой биологической жидкости или экстракта ткани и могут быть предобработаны перед тестированием. Однако, как правило, применяют пробы плазмы крови или пробы мочи.

В плазме крови или в моче значительная часть присутствующего гомоцистеина может быть связана дисульфидными связями с циркулирующими белками, такими как альбумин, и гомоцистеин может также присутствовать в форме других дисульфидных производных /обычно в форме коньюгатов гомоцистеин-цистеин/. Для оценки общего количества присутствующего в пробе гомоцистеина может быть желательным обработать пробу восстанавливающим агентом для расщепления дисульфидных связей и высвобождения свободного цистеина.

Дисульфиды легко и специфически восстанавливаются тиолами /например, дитиотреитолом /ДТТ/, дитиоэритритом (ДТЭ), 2-меркаптоэтанолом, тиогликолевой кислотой, глютатионом и подобными соединениями/. Прямое химическое восстановление может быть достигнуто с применением боргидридов /например, боргидрида натрия/ или амальгам /например, амальгамы натрия/ или более специализированных реагентов, таких как фосфины или фосфоротиоаты. Восстановление дисульфидов рассмотрено в обзоре Jocelyn в Methods of Enzymology 143: 243 - 256 /1987/, где приведен широкий диапазон подходящих восстанавливающих агентов.

Аденозин или другие ко-субстраты гомоцистеина могут быть оценены известными способами. Как правило, предпочтительны способы, основанные на фотометрическом /например, колориметрическом, спектрофотометрическом или флуорометрическом/ детектировании, а также иммунологические способы, т.к. они могут быть легко приспособлены для применения в клинических лабораториях. Особенно предпочтительны способы, основанные на ферментной реакции или реакции с моно- или поликлональными антителами, т.к. они являются простыми, быстрыми и относительно недорогими. Так, например, аналит может быть оценен путем мониторинга реакции с ферментами, которые превращают его прямо или опосредованно в продукты, которые могут обнаруживаться фотометрически, например, спектрофотометрически. Подходящими для этого ферментами, которые, разумеется, не должны реагировать с другими субстратами превращающего гомоцистеин фермента, в частности, с гомоцистеином, являются аденозиндеаминаза /превращающая аденозин в инозин/ и аденозинкиназа /превращающая аденозин и АТФ в АДФ и фосфорилированный аденозин/. Такие ферменты могут сочетаться с другими ферментами, которые превращают образовавшиеся продукты в дальнейшие детектируемые продукты.

Примеры иммунологических способов включают в себя способы, предусматривающие реакцию аналита с антителами, специфическими для него, которые либо могут быть сами детектированы, либо могут реагировать далее с образованием детектируемых продуктов, например, в сэндвич-анализе. Однако один особенно привлекательный способ предусматривает применение меченого флуорофором аналога аналита, предпочтительно ко-субстрата, например, меченого флуоросцеином аденозина, который вместе с немеченым аналитом может быть приведен в контакт с антителами к аналиту. Если образующийся продукт подвергают флуоресцентному поляризационному анализу с применением поляризованной возбуждающей радиации, то показания о концентрации немеченого аналита могут быть произведены затем из степени деполяризации флуоресцентного излучения. Антитела к аденозину коммерчески доступны /например, у Paessel & Lorei GmbH, Frankfurt, Germany and Serotech Ltd., Oxford, United Kingdom/, а флуоресцентный поляризационный иммуноанализ /FPIA/ хорошо разработан /см. например, US-А-4420568 и US-А-4593089 и другие публикации Abbot Laboratories, относящиеся к их TDX технологии/.

Таким образом, примеры схем детектирования, применяемых в тесте данного изобретения, включают реакции или с меченым флуорофором аденозином, который конкурирует за АТФ /аденозинкиназу, с оценкой, проводимой при помощи измерения поляризации флуоресценции.

Что касается схем /2/ и /3/, то инозин и мочевая кислота имеют характерные особенности поглощения УФ и поэтому могут прослеживаться спектрофотометрически путем кинетических измерений.

Однако применение УФ-детектирования мочевой кислоты или инозина имеет некоторые ограничения, заключающиеся в том, что чувствительность способа довольно низка и он требует источника УФ-света и наличия прозрачного для УФ контейнера для пробы. Поэтому более удобно полагаться на колориметрическое детектирование или электронные датчики, тем более, что такие способы, в частности, колориметрия, как правило, предпочитаются в клинических лабораториях.

В этой связи особенно применима реакция схемы /2/, в которой генерируемый аденозиндеаминазной реакцией аммиак можно легко детектировать известными колориметрическими способами. Так, например, аммиак, генерируемый в пробе, может реагировать с образованием окрашенных продуктов, образование которых можно детектировать спектрофотометрически. Один из таких способов, описанный в Methods of Enzymatic Analysis /Bergmeyer/ Volume 1: 1049-1056 /1970/ основан на реакции аммиака с фенолом в присутствии гипохлорита в щелочных условиях с образованием окрашенного красителя индофенола В качестве катализатора можно использовать нитропруссид натрия. Можно применять также модификации этого способа, например, с использованием различных производных фенола.

Окрашенный конечный продукт образуется в количествах, прямо пропорциональных концентрации аммиака и, следовательно, аденозина в пробе.

В схеме /3/ реакция ксантиноксидазы пригодна для детектирования при помощи флуорогенов или хромогенов, например, редокс-индикаторов, путем оценки окислительно-восстановительного потенциала или путем измерения потребления O₂ или образования H₂O₂, например, с использованием электронных датчиков. Для этой цели можно применять различные редокс-индикаторы и в литературе описан широкий диапазон способов для оценки H₂O₂ и O₂ в растворе. На практике H₂O₂ часто детектируется в клинических тестах.

Пригодными для этих целей редокс-индикаторами являются метиленовый синий, 2,6-дихлорфенол, индофенол и различные редокс-индикаторы, перечень которых дан в таблице 1 Kodak Laboratory Research Products, Catalog N 53, хотя, конечно, можно применять и другие. Для ускорения редокс-реакций могут быть добавлены ферменты с пероксидазной активностью, например, пероксидаза хрена.

Если желателен осаждающийся хромоген, можно использовать МТТ тетразолий в сочетании с ксантиноксидазой или иными подобными ферментами. Путем применения осаждающегося хромогена или флуорогена можно получить показание иммобилизованной окраски или флуоресценции для визуальной оценки концентрации гомоцистеина.

В схеме /4/ для оценки концентрации аденозина применяют хемилюминесцентную АТФ-реакцию. Основанные на хемилюминесценции тесты обладают высоким потенциалом вследствие низких лимитирований детектирования и относительной простоты необходимого оборудования. Хемилюминесцентные реакции можно применять для детектирования таких аналитов, как АТФ или H₂O₂ и одной из наиболее эффективных и наиболее известных подобных реакций является реакция биолюминесценции светлячка.

Люциферин светлячка имеет бензотиазольную структуру, но доступны люциферины из других биологических источников, имеющие другие структуры. Для аналитических целей АТФ, люциферин или люцифераза могут быть определены непосредственно при помощи этой реакции. Можно использовать другую хемилюминесцентную реакцию, при которой образуется H₂O₂, например, как в схеме /3/. Такой реакцией является реакция люминола /5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона/ с гидрогенпероксидазным катализатором, которая приводит к эмиссии света при 425 нм.

Пероксид водорода, например из схемы /3/, может быть также оценен при помощи неферментативных хемилюминесцентных реакций пероксиоксалата и эфиров акридиния, последних - в водном растворе при нейтральном pH.

Применение меченого флуорофором аденозина в схеме /4/ и оценки при помощи измерения поляризации флуоресценции возможно вследствие относительно широкой субстратной специфичности аденозинкиназы. Кроме того, эта широкая специфичность может быть использована для компенсации эндогенного аденозина /или иных нуклеозидных субстратов аденозинкиназы/ путем добавления аденозинкиназы к пробе в виде предобработки, предпочтительно в сочетании с восстанавливающим агентом /например, ДДТ/.

Такая ферментативная обработка пробы желательна, т.к. во многих вариантах изобретения аналит /например, аденозин/ уже присутствует в пробе в вариирующих количествах, обеспечивая, таким образом, потенциальный источник ошибки в тесте. Фоновое содержание аналита может быть компенсировано проведением теста на части пробы без применения превращающего гомоцистеин фермента /например, SAH-гипролазы/; однако такая процедура требует времени и делает тест более громоздким. Альтернативой является предобработка пробы агентом, служащим для превращения или удаления эндогенного аналита, например, ферментом, таким как аденозиндеаминаза, удаляющим фоновый аденозин. Как было упомянуто выше, во избежание необходимости увеличения требуемого для теста времени такую обработку пробы удобно проводить во время предобработки пробы восстанавливающим агентом для высвобождения гомоцистеина.

Кроме применения спектрофотометрического или колориметрического способов для оценки аналита, можно применять и другие фотометрические способы. Среди наиболее применимых способов, которые могут быть применены, находятся агглютинация частиц и способ иммунопреципитации. При применении поликлональных антител можно использовать прямую агглютинацию частиц или прямую иммунопреципитацию, хотя при использовании SAH-гидролазы в качестве превращающего гомоцистеин фермента это обычно не является предпочтительным. Однако в этом случае можно использовать способы ингибирования преципитации и ингибирования агглютинации частиц. Они основаны на применении комбинаций антитело/гаптен, приводящих к преципитации /осаждению/ или агглютинации частиц, что может быть детектировано путем турбидиметрического или нефелометрического измерения. При ингибировании образования комплекса антитело/гаптен аналитом, например, SAH, содержание SAH можно оценить исходя из уменьшения преципитации/агрегации. Реакцию можно выразить следующим образом:
При выполнении теста изобретения с применением SAH-гидролазы в качестве превращающего гомоцистеин фермента предпочтительно либо хранить SAH-гидролазу в присутствии восстанавливающего агента, либо обрабатывать ее восстанавливающим агентом перед ее применением в тесте. Было обнаружено, что хранение ее в других условиях инактивирует фермент и применение восстанавливающего агента предотвращает инактивацию во время хранения или обусловливает реактивацию перед использованием.

Можно применять различные восстанавливающие реагенты /например, ДТТ, цистеин, меркаптоэтанол, дитиоэритрит, боргидрид натрия и т.д./, однако особенно пригоден ДДТ, например, в концентрации 5 мМ. Сам ДТТ должен храниться при низком pH и поэтому тест-набор включает раствор ДТТ при низкой pH /например, около 3/, но с низкой буферной емкостью и отдельный раствор SAH-гидролазы, которая может быть частично или полностью неактивной, при нейтральном pH и в присутствии буфера. При объединении этих растворов фермент реактивируется при нейтральном pH. Это объединение растворов можно, если желательно, проводить в присутствии тест-пробы или при добавлении тест-пробы вскоре после этого, так что одновременно происходит высвобождение гомоцистеина. Как для стабилизации /активации SAH-гидролазы, так и для восстановления пробы для высвобождения гомоцистеина можно применять и другие упомянутые выше восстанавливающие агенты.

Использование восстанавливающих агентов для реактивации инактивированной SAH-гидролазы составляет следующий аспект данного изобретения. Еще одним аспектом изобретения является обеспечение набора, содержащего в первом отделении неактивную SAH-гидролазу, а во втором отделении - восстанавливающий агент, например, ДТТ в кислой среде /например, с pH 3/. С применением этого набора SAH-гидролазу можно смешивать с восстанавливающим агентом и таким образом реактивировать непосредственно перед использованием в тесте.

Другие добавки можно также использовать для усиления стабильности SAH-гидролазы во время хранения и в самом тесте. Такими вспомогательными веществами являются НАД⁺, глютатион, многоатомные спирты и сахара /например, инозит, сорбит, ксилит, эритрит, глицерин, этиленгликолъ, сахарозу, лактит и т. д. /, растворимые полимеры, такие как некоторые декстраны, и белки /например, белки-носители/.

В случае применения в способе по изобретению антител, они могут быть, поликлональными, но предпочтительно являются моноклональными. Если коммерческие антитела не доступны, их можно получить стандартными способами. Так, антитела можно получить в животных или в гибридомах, либо моноклональные, либо поликлональные, например, как описано James Gooding в "Monoclonal antibodies, principle and practice", Academic Press, London, 1983, Chapter 3. Моноклоны должны быть подвергнуты сортировке для отбора клонов, которые различают целевой гаптен среди других субстратов для фермента /ферментов/, например, которые различают аденозин и SAH. Поликлональные антитела, реактивные только с данным аналитом /например, с SAH/ должны быть очищены для удаления перекрестно реагирующих антител, т.е. антител, реактивных с другими субстратами, кроме аналита, например, как с аденозином, так и с SAH. Это можно сделать при помощи афинной хроматографии, например, при помощи аденозина в случае, если аналитом является SAH.

При получении антител применяют в качестве гаптена либо сам аналит, либо другую молекулу, содержащую часть аналита, оцениваемую как наиболее подходящую область связывания, например, область, удаленную от областей участвующих в ферментативной реакции. Гаптен конъюгирован подходящим образом с макромолекулой, такой как бычий сывороточный альбумин /BSA/ или гемоцианин. Для SAH целевой эпитоп находится предпочтительно у тиоэфирного мостика или вблизи его и, следовательно, хотя и можно использовать сам SAH

конъюгированный с макромолекулой, но все-таки предпочтительнее применять "упрощенную" молекулу, такую как молекула формулы I

где
R₁ и R₂ которые могут быть одинаковыми или различными, обозначают атомы водорода или OR₄-группы /где R₄ обозначает низшую, например, C_1-6, в частности, C_1-6, алифатическую группу, такую как алкил, предпочтительно метил или этил/ или R₁ и R₂ вместе обозначают атом кислорода, а R₃ обозначает амино- или карбоксигруппу/ или его соль или эфир /например, с C_1-4-алканолом, также соединенные с макромолекулой.

Примерами соединений формулы I, которые можно использовать в качестве гаптенов, являются






Такие "упрощенные" структуры могут быть также заимствованы для вышеупомянутых меченых аналогов, применимых в текстах, в которых аналит и меченый аналог участвуют в реакции конкурентного связывания с антителами. Так, дающая сигнал часть, молекулы R^*, которая может быть выбрана из флуорофоров, хромофоров, радиоактивных меток, ферментных, хемилюминесцентных и других меток, обычно применяемых в иммуноанализе, может быть конъюгирована с аналитом как например, R^* - SAH, были с упрощенной содержащей эпитоп молекулой, такой как

Подобные меченые части молекул могут быть, разумеется, соединены с частицами, полимерами, белками или иными материалами, если желательно.

Меченые 6-тиоэфиры фуранозы и соединения формулы I являются новыми и представляют собой дальнейшие аспекты данного изобретения.

В связи со следующим аспектом данное изобретение обеспечивает способ получения соединения формулы I, предусматривающий, по меньшей мере, одну из следующих стадий:
/а/ реакцию соединения формулы II

в которой
R₁ и R₂ имеют описанные выше значения, а каждый R₅ обозначает защищенную гидроксигруппу или оба R₅ вместе обозначают алкилендиоксигруппу /т.е. защищенную биогидроксигруппу, такую как -OC(CH₃)₂O-/ с пропилгалогенидом формулы III
R₆(CH₂)₃Hal
в которой
R₆ обозначает R₃-группу или защищенную R₃-группу, а Hal обозначает атом галогена, например, атом брома/, с последующим удалением любых защитных групп, если это желательно;
/b/ для получения соединения формулы I, в котором R₃ обозначает аминогруппу /реакцию соединения формулы II с акрилонитрилом и восстановление и удаление защитных групп полученного цианопропилового тиоэфира;
/c/ этерификацию соединения формулы I, в которой R₃ обозначает карбоксигруппу.

Исходные продукты формулы III могут быть получены стандартными способами или известны из литературы. Исходные продукты формулы II могут быть получены из соответствующих 1-гидроксиметилфураноз путем защиты цис-гидроксигрупп, бромирования и последующей реакцией с тиомочевиной и гидролизом. Цис-гидроксигруппы 1-гидроксиметилфураноз могут быть защищены при помощи реакции с обычными защищающими гидроксигруппы агентами, например, с ацетоном.

Примерами схем реакций для получения соединений формулы I являются /соединения /1/ и /3/ коммерчески доступны/











Поглощение УФ, поглощение видимого света или флуоресценция веществ в реакционной смеси, иногда осажденных или иным образом отделенных от реакционной смеси, могут быть измерены в конечной точке реакции /когда сигнал является стабильным/ или в одной или нескольких фиксированных временных точках или, альтернативно, может проводиться кинетическое измерение, при котором в разные точки времени проводят несколько измерений.

Для проведения теста изобретения необходимые реагенты можно добавлять к реакционной смеси последовательно или одновременно. Однако во многих предпочтительных вариантах одна или несколько реакций могут предпочтительно идти в течение некоторого времени перед добавлением реагентов для последующей реакции /реакций/.

Например, при реакции тест-пробы с аденозином и SAH-гидролазой образование SAH из гомоцистеина и аденозина должно происходить в течение некоторого времени перед процедурой оценки аденозина.

В клиническом химическом анализе стандартной практикой является применение стандартных кривых для калибровочных целей. Так, при проведении способа данного изобретения можно использовать пробы с известным содержанием гомоцистеина вместо клинических проб для построения стандартной кривой для измеряемого ответа/сигнала. Содержание гомоцистеина неизвестных проб можно затем рассчитать путем интерполяции из стандартной кривой. Таким образом, точное определение количества образующих сигнал молекул или редокс-потенциалов не является необходимым.

Тест-способ данного изобретения можно применять для диагностики или наблюдения патологических или потенциально патологических состояний, которые связаны с содержанием гомоцистеина или проявляются в определенном содержании гомоцистеина в жидкостях тела или тканях. К таким состояниям относятся атеросклероз, заболевания крови, витаминная недостаточность и /или/ врожденные нарушения метаболизма. Его можно применять также для оценки действия фармацевтических веществ, таких как антифолатные лекарственные средства.

В другом аспекте изобретение обеспечивает аналитический продукт, иногда в форме набора /кита/, для применения в определении гомоцистеина в пробе, содержащий превращающий гомоцистеин фермент, субстрат для этого фермента, иной, чем гомоцистеин, генерирующий сигнал агент и иногда средства для оценки сигнала.

В одном из предпочтительных вариантов аналитический продукт содержит: превращающий гомоцистеин фермент, например, S-аденозилгомоцистеингидролазу; один или несколько субстратов для этого фермента, иных, чем гомоцистеин; средства для генерирования детектируемого производного аналита, выбранного из ко-субстрата гомоцистеина и продуктов ферментативного превращения гомоцистеина; и иногда средства для спектрофотометрической или колориметрической оценки детектируемого производного для обеспечения показателя содержания гомоцистеина в пробе.

В другом варианте продукт содержит: аденозин; S-аденозилгомоцистеингидролазу; превращающий аденозин фермент; иногда ко-субстрат для превращающего аденозин фермента и средства для генерирования фотометрически детектируемого ответа из ко-субстрата или из продукта ферментативного превращения аденозина превращающих аденозин ферментом. Так, например, превращающий аденозин ферментом может быть аденозинкиназа, а средства для генерирования детектируемого ответа могут содержать АТФ, люциферин и люциферазу. Альтернативно, превращающим аденозин ферментом может быть аденозиндеаминаза, а средства для превращения могут содержать нуклеозидфосфорилазу, ксантиноксидазу и пероксидазу.

Еще в одном варианте кит содержит аденозин; S-аденозилгомоцистеин; иногда связанные с частицами матрикса антитела против S-аденозилгомоцистеина; полигаптен для этих антител и иногда средства для фотометрической оценки агглютинации или преципитации комплексов антитело:полигаптен. В этом варианте в качестве удобного полигаптена может быть применен каркасный полимер, с которым конъюгировано множество 6-тиоэфиров фуранозы, например, оставляющий баковые остатки формулы

Они могут быть получены, например, реакцией карбоновой кислоты формулы I /или ее ангидрида или галогенангидрида/ с полимером, имеющим множество остатков аминосоединений в качестве боковых цепей /например, полилизин/ или амин формулы I с полимером, имеющий боковые карбоксигруппы.

В наборах все или часть реагентов могут присутствовать в сухом виде, такие как матрикс для процессинга реакций реакционной среды. Подобным образом набор может содержать, как указано выше, в качестве средств для оценки детектируемого аналита или производного относительно недорогое спектрофотометрическое или колометрическое устройство, например, источник света и детекторное устройство, предназначенное для детектирования интенсивности света при длине волны, характерной для детектируемого аналита, и т.д. или даже простую колометрическую калибровочную диаграмму.

Далее данное изобретение будет описано при помощи следующих не ограничивающих изобретение примеров. Особенно предпочтителен тест по примеру 19.

Пример 1. Пробу /водный раствор гомоцистеина для калибровки или плазму или мочу для клинического анализа/ предобрабатывали восстанавливающим агентом /например, 10 мМ дитиотреитолом/. Эту пробу добавляли, предпочтительно до конечной концентрации гомоцистеина в диапазоне 10^-6 - 10^-5 моль/л, к раствору при 37^oC, содержащему кроличьи IgG (5 мг/мл), аденозиндеаминазу (20 мЕ/мл), нуклеозидфосфорилазу (20 мЕ/мл), ксантиноксидазу (20 мЕ/мл), пероксидазу хрена (500 мЕ/мл), 10 ммоль/л дитиотреитола, 10 ммоль/л фосфата натрия, доводили pH до 7,4 и добавляли 100 мЕ S-аденозил-1-гомоцистеингидролазы. Одновременно или последовательно, но предпочтительно после 10 минут инкубации для того, чтобы произошло превращение аденозина внутри пробы, добавляли аденозин в конечной концентрации 5·10^-6 моль/л. УФ-поглощение измеряли в течение периода 10 мин и ответную реакцию измеряли при 292 нм кинетически, после чего рассчитывали
Для клинических тестов концентрацию гомоцистеина можно рассчитать путем интерполяции по стандартной кривой, полученной с использованием известных стандартов.

Пример 2. Пробу /как и для примера 1/ предобрабатывали восстанавливающим агентом /например, 10 мМ дитиотреитолом/. Эту пробу добавляли, предпочтительно, до конечной концентрации гомоцистеина в диапазоне 10^-6 - 10^-5 моль/л, к раствору при 37^oC, содержащему кроличьи IgG (5 мг/мл), аденозиндеаминазу (20 мЕ/мл), ксантиноксидазу (20 мЕ/мл), нуклеозидфосфорилазу (20 мЕ/мл), пероксидазу хрена (500 мЕ/мл), 10 ммоль/л дитиотреитола и 100 ммоль/л фосфата натрия, доводили pH до 7,4, и добавляли 20 мЕ S-аденозил-1-гомоцистеингидролазы. Затем, предпочтительно после 10 минут инкубации для завершения превращения аденозина внутри пробы добавляли S-аденозил-1-гомоцистеин до конечной концентрации 5·10^-5 моль/л измеряли поглощение УФ в течение периода 10 минут, рассчитывали при 292 нм кинетическим способом.

Для клинических тестов концентрацию гомоцистеина можно рассчитать путем интерполяции по стандартной кривой, полученной с применением известных стандартов.

Пример 3.

Тест-буфер:
0,1 М фосфатный буфер pH 7,4, содержащий 1 мг/мл кроличьих IgG и 10 ммолей/л дитиотреитола.

Методика теста:
К 150 мл тест-буфера добавляли 3 мЕ S-аденозил-1-гомоцистеигидролазы и пробу/ предпочтительно предобработанную как описано в примерах 1 и 2. Ферментативную реакцию начинали добавлением аденозина, растворенного в тест-буфере, до конечной концентрации 2,5·10^-5 моль/л. После 10 мин инкубации добавляли 750 мкл раствора тест-буфера, содержащего 20 мЕ аденозиндеаминазы, 20 мЕ нуклеозидфосфорилазы, 20 мЕ ксантиноксидазы и 375 мЕ пероксидазы хрена. Поглощение УФ при 292 нм измеряли в течение 5 мин кинетических способом. Рассчитывали Параллельно повторяли тест, но без добавления S-аденозил-1-гомоцистеингидролазы. Определяли разность между двумя величинами и концентрацию гомоцистеина рассчитывали путем интерполяции при помощи стандартной кривой.

Пример 4. Методику теста выполняли, как описано в примере 3, вплоть до первой инкубации. Затем после 10 мин инкубации добавляли тест-раствор, содержащий меченый флуоросцеином аденозин и моноклональные антитела против аденозина. Оставшийся аденозин и меченый флуоресцином аденозин конкурируют за связывание с антителами. Количество связанного с антителами меченого аденозина оценивают при помощи обычного флуоресцентного поляризационного способа и концентрацию гомоцистеина рассчитывают путем интерполяции с применением стандартной кривой.

Пример 5.

Тест-буфер:
0,1 М фосфатный буфер, 7,4, содержащий 1 мг/мл кроличьих IgG и 10 ммоль/л дитиотреитола.

Раствор SAH-гидролазы:
40 мЕ/мл S-аденозил-1-гомоцистеингидролазы растворяют в тест-буфере.

Раствор аденозина:
5·10^-8 моль/мл аденозина растворяют в тест-буфере.

Раствор аденозиндеаминазы:
200 мЕ/мл аденозиндеаминазы растворяют в тест-буфере.

Раствор фенола нитропруссида:
10 мг/мл фенола и 50 мкг/мл нитропруссида натрия растворяют в воде.

Раствор гипохлорита:
11 моль/л NaOCl растворяют в 125 мм NaOH.

Методика теста:
1. 75 мкл раствора аденозина и 75 мкл раствора SAH-гидролазы смешивают с пробой /предпочтительно предобработанной, как описано в примерах 1 - 4/ и выдерживают при 37^oC в течение 10 мин.

2. Добавляют 100 мкл раствора аденозиндеаминазы и смесь выдерживают при 37^oC в течение 5 минут.

3. Добавляют 750 мкл раствора фенола/нитропруссида и 750 мкл раствора гипохлорита. После 30 мин при 37^oC измеряют экстинкцию при 628 нм. Параллельно повторяют тест, но без добавления SAH-гидролазы. Определяют разность между двумя величинами экстинкции при 628 нм и концентрацию гомоцистеина, рассчитывают путем интерполяции этой разности в стандартную кривую, полученную при помощи известных стандартов.

Пример 6.

Получение меченого флуорофором SAH.

Готовят раствор /10 ммоль/л/ раствор SAH в диметилформамиде и затем разбавляют его в фосфатном буфере /100 ммоль/л/ с pH 7,5. К этому раствору добавляют изотиоцианат флуоресцеина до конечной концентрации 1 ммоль/л. После 60 минут инкубации при температуре окружающей среды конъюгат SAH-флуоресцеин очищают при помощи ЖХВР с применением колонки Chromasil C-18 при 260 нм с использованием градиентной смеси 25 мМ ацетата аммония /pH 7,0/ и метанола.

Пример 7.

Получение антител против SAH.

а/ Получение антигена:
К раствору 1 ммоль/л SAH в фосфатном буфере /25 ммолей/л/ с pH 7,4, содержащим 125 ммоль/л NaCl, добавляют бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 5 мг/мл. К этой смеси добавляют бис/сульфосукцинимидил/суберинат до конечной концентрации 1 ммоль/л и смесь оставляют для прохождения реакции на 60 минут. /pH в этой реакции конъюгирования поддерживают на низком уровне для стимуляции конъюгирования у аминогруппы аденозила, но не у аминогруппы гомоцистеина/. Белковую фракцию этого раствора, которая также содержит конъюгаты между BSA и SAH, выделяют при помощи гель-фильтрации с применением колонки Pharmacia Superose 12 с содержащим фосфат в качестве буфера солевым раствором в качестве элюанта.

b/ Получение гибридом:
С описанным антигеном получают гибридомы в соответствии с методикой, описанной James W. Gooding b "Monoclomal antibodies: Principle and Practice", Academic Press, London 1983. Chapter 3.

c/ Отбор гибридом:
/i/ Гибридомы, продуцирующие антитела против SAH, идентифицируют следующим образом, содержание IgG отстоявшейся жидкости гибридом измеряют при помощи ELISA /твердофазного иммуноферментного анализа/. Затем отстоявшуюся жидкость смешивают в кювете с буфером, содержащим фосфат /50 ммоль/л/, NaCl /120 ммоль/л/ с pH = 7,4 и кроличьи антитела /0,1 мг/мл до конечной концентрации 0,1 мкмолей/л мышиных IgG. Меченый флуоресцеином SAH, полученный согласно примеру 6, добавляют до конечной концентрации 0,02 мкмоль/л. После 10 минут инкубации измеряют степень поляризации при помощи спектрофлуорометра, снабженного устройством для поляризации флуоресценции, путем измерения А = интенсивности флуоресценции, когда плоскость поляризации падающего света параллельна плоскости поляризации фильтра, применяемого для фильтрации испускаемого света, B = интенсивности флуоресценции, когда плоскость поляризации падающего света перпендикулярна плоскости поляризации фильтра, применяемого для фильтрации испускаемого света. При этом длина волны возбуждающего света равна 494 нм, а испускаемый свет детектируют при 517 нм. Степень поляризации рассчитывают по формуле (А - B)/(А + B). Низкая степень поляризации свидетельствует о том, что моноклональные мышиные антитела не связывают SAH.

/ii/ Из гибридов, отобранных согласно /i/, продуцирующие антитела гибридомы, реактивные относительно аденозина и /или/ гомоцистеина, идентифицируют следующим образом, моноклональные антитела против SAH из отстоявшейся жидкости гибридом наносят на поверхности микротитровальных ячеек, как описано в примере 9 ниже. ¹⁴C-аденозин /или меченый ¹⁴C-гомоцистеин/ Amercham Ltd, UK в буфере, содержащем фосфат /25 ммолей/л, NaCl /120 ммолей/л/ и 1 мг/мл кроличьих IgG, с pH 7,4 добавляют к микротитровальным ячейкам. После 60 минут инкубации ячейки промывают тем же буфером /не содержащим, конечно, аденозина или гомоцистеина/. Высокие величины радиоактивности, удерживающиеся в ячейках, свидетельствуют о том, что гибридомы продуцируют антитела, которые связываются с аденозином /или гомоцистеином/ сами по себе. Эти антитела не применяют в тесте.

/iii/ Получение моноклональных IgG: Гибридомы, продуцирующие антитела, которые связываются с SAH в соответствии с /i/, но не связываются с аденозином или гомоцистеином в соответствии с /ii/, отбирают для получения моноклональных IgG. Отобранные гибридомы применяют для получения асцитов в мышах или получения клеточных культур in vitro в соответствии с обычными способами. Моноклональные антитела затем выделяют из асцитов или культуральных сред обычными способами, См. James W. Gooding "Monoclonal antibodies" Principle and practice", Academic Press, London 1983.

Пример 8.

Флюоресцентный поляризационный иммуноанализ L-гомоцистеина
Раствор фермента:
Фосфатный буфер /50 ммолей/л/ с pH 7,4, содержащий 0,2 мг/мл кроличьих IgG, 120 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л дитиотреитола, 10 E/л S-аденозил-1-гомоцистеингидролазы и 0,1 ммоль/л аденозина.

Меченый флюоресцеином раствор SAH:
SAH, конъюгированный с флюоресцеином, полученный в соответствии с примером 6, растворяют до конечной концентрации 1 мкмоль/л в фосфатном буфере /50 ммоль/л/ с pH, 7,4 с NaCl /125 ммолей/л и 0,2 мг/мл кроличьих IgG.

Раствор антител:
Моноклональные антитела против SAH /не реактивные относительно аденозина и предпочтительно в отношении гомоцистеина/, например, полученные согласно примеру 7, растворяют до конечной концентрации 0,1 мкмоль/л в фосфатном буфере /50 ммоль/л/ с pH 7,4, содержащем 125 ммоль/л NaCl и 0,2 мг/мл кроличьих IgG.

Проведение теста:
В кювете 15 мкл плазмы /исходно серию проб с известным содержанием гомоцистеина/ смешивают со 100 мкл раствора фермента и выдерживают при 37^oC в течение 15 мин. Добавляют 100 мкл раствора меченого флуоресцеином SAH с последующим добавлением 1,0 мл раствора антител. При помощи спектрофлурометра, оборудованного устройством для поляризации флуоресценции, измеряют степень поляризации, как описано в примере /c/ /i/ и строят кривую зависимости поляризации от концентрации гомоцистеина. Тест можно также проводить с применением меченых гаптенов и антител из примеров 11 и 13 или 15 и 17 вместо предлагаемых в примерах 6 и 7.

Пример 9.

Микротитровальный иммуноферментный анализ.

/a/ Применяют раствор фермента из примера 8.

/b/ Раствор меченого пероксидазой SAH:
0,5 мг пероксидазы хрена растворяют в 1 мл очищенной воды. 200 мкл раствора 0,02 моль/л периодата натрия добавляют, смесь перемешивают 20 минут при температуре окружающей среды и диализуют в течение ночи против 10 мM буфера, приготовленного из ацетата натрия, с pH 4,4. Добавляют SAH до конечной концентрации 0,1 ммоля/л и pH доводят до 6,0. Раствор перемешивают 4 ч при температуре окружающей среды. Добавляют 100 мкл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия /4 мг/мл/ и раствор инкубируют при 4^oC в течение 2 ч. Пероксидазу и ее конъюгаты с SAH выделяют при помощи гель-фильтрации на колонке Superose 6 /Pharmacia, Sweden/.

/c/ Антитела против SAH, нанесенные на микротитровальные ячейки:
Поликлональные овечьи IgG, полученные из овцы, иммунизированной мышиными IgG, растворяют до конечной концентрации 1 мг/мл в боратном буфере /100 ммоль/л/ с pH 9,0. 300 мкл этого раствора вносят в каждую ячейку полистироловых микротитровальных пластинок. После 120 минут инкубация при 37^oC ячейки промывают 5 раз содержащим фосфат солевым раствором. После этого моноклональные мышиные IgG антитела против SAH, полученные согласно примеру 7, растворяют в содержащем фосфат солевом растворе до конечной концентрации 50 мкг/мл. 200 мкл этого раствора моноклоналъных IgG добавляют к каждой ячейке и инкубируют 120 минут при 37^oC. Затем ячейки промывают 5 раз содержащим фосфат солевым раствором, содержащим 0,1 мг/мл кроличьих IgG.

/d/ Проведение теста:
25 мкл пробы плазмы /сначала серии проб с известной концентрацией гомоцистеина/ смешивают с 500 мкл раствора фермента и выдерживают при 37^oC в течение 15 мин. Добавляют 50 мкл раствора меченого пероксидазой SAH и после перемешивания 250 мкл этой смеси добавляют к каждой из покрытых антителами против SAH микротитровальных ячеек, полученных по п. /c/, доведенных до pH 7,4. После 60 мин инкубации при 37^oC ячейки промывают 3 раза забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим 0,1 мг/мл кроличьих IgG. 100 мкл раствора о-фенилендиамина /1 мг/мл/ в цитратном буфере /0,1 моль/л/ с pH 6,0, содержащего 0,015% пероксида водорода, добавляют к каждой ячейке. После 10 - 30 мин измеряют поглощение света при 450 нм каждой ячейкой. Строят кривую зависимости поглощения от концентрации гомоцистеина.

Пример 10.

Получение гаптена.

3-S-(1-ангидро-D-рибофуразинол)-тиопропиламин

/a/ Активированный гидроксизащищенный меркаптан /Соединение /8/ в схеме /E/ выше/.

Один эквивалент метилрибофуранозида /Соединение /1/ выше, которое коммерчески доступно/ реагирует со смесью 5 эквивалентов триметилсилилметансульфоната и 1 эквивалента эфирата трифторила бора по методике Jun et al. /Carb. Res. 163: 247 - 261 /1987///. 0,5 эквивалента продукта 1-ангидридо-D-рибозы /Соединение 2/ в мелкоизмельченном виде малыми порциями при непрерывном перемешивании добавляют к смеси ацетон/серная кислота, полученное путем медленного добавления 6,3 мл концентрированной серной кислоты к 100 мл свежеперегнанного ацетона на бане со льдом. Баню со льдом удаляют и реакцию проводят при температуре окружающей среды в течение 8 часов. Полученную белую кристаллическую массу растворяют в хлороформе, промывают водным гидроксидом натрия, разбавляют соляной кислотой и в конце водой, высушивают и упаривают, получая производное 2,3-изопропилиден-D-рибоновой кислоты 1-ангидро-D-рибозу /Соединение 2/. Один эквивалент этого соединения и два эквивалента тетрабромида углерода растворяют в сухом эфире и охлаждают на льду. При постоянном перемешивании и охлаждении на льду медленно добавляют два эквивалента трифенилфосфина. Баню со льдом удаляют, давая смеси нагреться до температуры окружающей среды, при которой начинается реакция и равномерно выделяется бромид водорода. После завершения реакции избыток реагента гасят добавлением метанола. Бромидное производное /Соединение /6// выделяют путем фильтрования и выпаривания фильтрата. К бромидному производному добавляют один эквивалент тиомочевины, растворенной в теплой воде и разбавленной очищенным спиртом. Смесь подвергают дефлегмации и периодически хорошо встряхивают, продолжая эту операцию приблизительно 30 минут после растворения бромидного производного. Реакционную смесь охлаждают на льду и фильтруют, получая твердое вещество, которое обрабатывают щелочной водой с образованием гидроксизащищенного меркаптана /Соединение /7// в органической фазе. Его превращают в активированную форму /Соединение /8// обработкой метоксидом в метаноле. Активированный меркаптан реагирует далее, как описано ниже.

/b/ 3-S-(1-ангидро-D-рибофуранозил)тиопропиламин
Один эквивалент свежеприготовленного соединения примера 10 /a/ /Соединения /8// реагирует с одним эквивалентом акрилонитрила с образованием тиоэфира /Соединение /9//. Затем его восстанавливают обработкой LiAIH₄ в сухом эфире и свободный незащищенный амин /Соединение /10// выделяют обработкой водной соляной кислотой. Соответствующие аминопропиловые эфиры, в которых R₁ и R₂ иные, чем водород, получают аналогично, например, с применением коммерчески доступных соединений /1/ и /3/ в качестве исходных материалов.

Пример 11.

Мечение гаптена.

Раствор 50 ммоль/л соединения примера 10 в диметилформамиде /DMF/ разводят 1:5 /по объему/ в 0,1 М растворе бикарбоната /pH 9,2/. К этому раствору добавляют изотиоцианат флуоресцеина до конечной концентрации 12 ммоль/л. После 60 минут инкубации при температуре окружающей среды конъюгат флуоресцеина с соединением примера 10 очищают хроматографией с обращенной фазой /RPC/ с применением колонки Kromasil и градиентной смеси 20 мМ ацетата аммония /pH 7,0/ и метанола.

Пример 11.

Получение антигена.

К раствору 1 ммоль/л соединения примера 10 в фосфатном буфере (50 ммоль/л), содержащем 12 ммоль/л NaCl /pH 7,4/ добавляют бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 5 мг/мл. К этой смеси добавляют бис(сульфосукцинимидил)суберинат до конечной концентрации 1,2 ммоль/л и смесь оставляют реагировать в течение 60 мин. Белковую фракцию, содержащую конъюгат гаптен-BSA, выделяют при помощи гель-фильтрации с применением колонки Pharmacia Superose 12 с содержащим фосфат солевым раствором в качестве элюанта.

Пример 13.

Получение антител.

Антитела к соединению примера 10 получают аналогично примеру 7 с использованием антигена примера 12. Антитела, не реагирующие с SAH, и антитела, реактивные в отношении аденозина, отбрасывают, как и предпочтительно антитела, реактивные в отношении гомоцистеина.

Пример 14.

Получение гаптена.

N-гидроксисукцинимидил-З-S-(1-ангидро-D-рибофуранозил)тио- бутаноат

Один эквивалент соединения примера 10 /a/, свежеприготовленного, реагирует с 1 эквивалентом этил-4-бромбутирата с образованием эфирного соединения /11/. Его гидролизуют по свободной кислоты при помощи щелочного гидролиза водных гидроксидом натрия в диоксане и удаляют защитные группы обработкой водной соляной кислотой с образованием незащищенной свободной кислоты /Соединение /12//. Один эквивалент этого соединения смешивают с двумя эквивалентами N-гидроксисукцинимида в ледяном диметилформамиде и к смеси добавляют 1,2 эквивалента дициклогексилкарбодиимида при постоянном перемешивании. Реакция протекает при температуре окружающей среды 18 часов, после чего смесь охлаждают и добавляют охлажденный на льду эфир. Осажденный NHS-эфир /Соединение /13// перекристаллизуют из смеси диметилформамида с эфиром, высушивают и затем хранят при 4^oC над дессикантом.

Соответствующие NHS-эфиры, в которых R₁ и R₂ иные, чем водород, получают аналогично, например с применением коммерчески доступных соединений /1/ и /3/ в качестве исходных материалов.

Пример 15.

Мечение гаптена.

Раствор 50 ммоль/л соединения примера 14 в диметилформамиде //DMF/ разбавляют 1:5 /по объему/ в 0,1 М бикарбонатном буфере /pH 9,2/. К этому раствору добавляли 5-аминоацетамидофлуоресцеин /амид флуоресцеинилглицина/ по конечной концентрации 12 ммоль/л. После 60 мин инкубации при температуре окружающей среды конъюгат флуоресцеина с 3-S-(1-ангидро-D-рибофуранозил)-тиомасляной кислотой очищали хроматографией с обращенной фазой с применением колонки Kromasil C-18 и градиентной смеси 20 мМ ацетата аммония и метанола.

Пример 16.

Получение антигена.

К раствору BSA (5 мг/л в фосфатном буфере (50 ммоль/л), содержащем 125 ммоль/л NaCl pH 7,4// добавляют соединение примера 14 до конечной концентрации 1 ммоль/л. Смесь оставляют реагировать в течение 60 мин и белковую фракцию, содержащую конъюгат BSA-гаптен, выделяют при помощи гель-фильтрации с применением колонки Pharmacia Superose 12 с содержащим фосфат солевым раствором в качестве элюанта.

Пример 17.

Получение антител.

Антитела к соединению примера 14 получают аналогично примеру 7 с применением антигена примера 12. Антитела, не реагирующие с SAH, и антитела, реактивные с аденозином, отбрасывали как антитела, реактивные в отношении гомоцистеина.

Пример 18.

Флуоресцентный поляризационный иммуноанализ
Раствор фермента:
50 ммоль/л фосфатного буфера /pH 7,4/, содержащего 4 мг/мл казеина, 120 ммолей NaCl и 10 E/л S-аденозил-L-гомоцистеингидролазы.

Раствор дитиотреитола /ДДТ/:
Дитиотреитол растворяют в воде до концентрации 50 ммоль/л и доводят pH до 3,0 соляной кислотой.

Раствор аденозина:
1,8 ммоль/л аденозина в 50 ммоль/л фосфатного буфера /pH 7,4/.

Раствор меченого флуоресцеином SAH:
50 ммоль/л фосфатный буфер /pH 7,4/, содержащий SAH, конъюгированный с флуоресцеином, образованный согласно примеру 6.

Раствор антител:
Моноклональные антитела против SAH /например, в соответствии с примером 7/, растворенные до конечной концентрации 0,1 мкмоля/л в фосфатной буфере /50 ммоль/л/ /pH 7,4/, содержащею 120 ммоль/л NaCl и 1 мг/мл казеина.

Проведение теста.

Стадия 1:
В кювете 15 мкл пробы, 10 мкл раствора фермента и 10 мкл раствора аденозина смешивают с 10 мкл кислого раствора ДТТ и выдерживают при 37^oC в точение 15 мин.

Стадия 2:
К кювете добавляют 100 мкл раствора меченого флуоресцеином SAH и 1,0 мл раствора антител. При помощи спектрофлуорометра, снабженного устройством для поляризации флуоресценции, измеряют степень поляризации, как описано в примере 7 /c/ выше и строят кривую зависимости степени поляризации от концентрации гомоцистеина.

Пример 19.

Флуоресцентный поляризационный иммуноанализ.

Раствор фермента:
Фосфатный буфер /50 ммоль/л/ с pH 7,4, содержащий 1 мг/мл казеина, 120 ммолей/л NaCl и 10 E/л S-аденозил-L-гомоцистеингидролазы.

Раствор дитиотреитола /ДДТ/:
Дитиотреитол растворяют в воде до концентрации 50 ммоль/л и pH доводят до 3,0 соляной кислотой.

Раствор меченого флуоресцеином SAH /раствор аденозина:
Фосфатный буфер /50 ммоль/л/ с pH 7,4, содержащий 10 мкмолей/л конъюгированного с флуоресцеином SAH, полученного согласно примеру 6, и 1,8 ммоль/л аденозина.

Раствор антител:
Моноклональные антитела против SAH /например, в соответствии с примером 7/, растворенные до конечной концентрации 0,1 ммоль/л в фосфатном буфере /50 ммоль/л/ с pH 7,4, содержащем 120 ммоль/л NaCl и 1 мг/мл казеина.

Проведение теста.

В кювете 10 мкл плазмы, 100 мкл раствора фермента и 10 мкл раствора меченого SAH аденозина смешивают с 30 мкл кислого раствора ДДТ и выдерживают при 37^oC в течение 15 мин. После инкубации добавляют 1,0 мл раствора антител. При помощи спектрофлуорометра, снабженного устройством для поляризации флуоресценции, измеряют степень поляризации, как описано в примере 7/c/ /i/ и строят кривую зависимости степени поляризации от концентрации гомоцистеина.

Тесты примеров 18 и 19 можно выполнять также с применением меченых гаптенов и антител примеров 11 и 13 или 15 и 17, вместо представленных в примерах 6 и 7.

Пример 20.

Люминесцентный тест.

Тест-буфер I:
50 мМ Pipes-буфер /pH 6,6/, содержащий 1 мг/мл казеина, 10 мМ ДТТ, 0,5 мМ MgCl₂ и 30 мМ KCl.

Тест-буфер II:
40 мМ Hepes-буфер /pH 7,75/, содержащий 4 ммоль/л ЭДТА, 20 мМ MgCl₂ и 0,36 ммоль/л ДТТ.

Тест-буфер III:
40 мМ Hepes-буфер /pH 6,75/, содержащий 1,6 мкг/мл люциферазы /из Photinus pyralis/, 700 ммоль/л D-люциферина, 20 ммоль/л MgCl₂, 4 ммоль/л ЭДТА, 0,36 ммоль/л ДТТ и 0,3 ммоль/л АМФ.

Проведение теста.

К 130 мкл тест-буфера 1 добавляют 3 E S-аденозил-1-гомоцистеингидролазы, 20 мкл пробы добавляют к этой смеси и инкубируют ее 15 мин при 37^oC. После этого добавляют аденозин, растворенный в тест-буфере 1, до конечной концентрации 5·10^-6 ммоль/л. После 5 мин инкубации при 37^oC добавляют 750 мкл тест-буфера 1, содержащего 0,7·10^-5 ммоль/л АТФ и 1 мЕ аденозинкиназы и полученный раствор инкубируют далее при 37°^oC 5 мин. Этот раствор разбавляют 1: 100 /по объему/ тест-буфером II и 500 мкл разбавленного раствора сразу же добавляют к 500 мкл тест-буфера III. Оба буфера II и III уравновешивают до температуры окружающей среды /21^oC/. Люминесценцию считывают в фотометре при 550 нм.

Параллельно тест проводят без S-аденозил-1-гомоцистеингидролазы. Для клинических тестов концентрации гомоцистеина могут быть рассчитаны путем интерполяции в стандартную кривую разности в люминесценции, продуцируемой в присутствии S-аденозил-L-гомоцистеингидролазы и без нее.

Пример 21.

Получение поликлональных антител.

Кроличьи поликлональные антитела к антигенам примеров 12 и 16 получали согласно протоколу Dako Corporation, Copenhagen, Denmark. Поликлональные IgG очищают из собранной антисыворотки по тому же протоколу. Поликлональные антитела очищают от антител, реактивных с остатками аденозина и гомоцистеина perse, прохождением антител через колонки Racti-Gel с иммобилизованными остатками аденозина и гомоцистеина /гель и протокол Pierce Chemical Company, Belgium/. Антитела, не реагирующие с SAH, также отбрасывают. Отобранные антитела можно применять в тестах описанных выше примеров.

Формула изобретения

1. Способ определения гомоцистеина в пробе, включающий контактирование пробы с ферментом S-аденозилгомоцистеингидролазой (SAH-аза) в присутствии субстрата, отличного от гомоцистеина, и оценку аналита, отличающийся тем, что в качестве аналита используют немеченный аналит, выбранный из аденозина, аналога аденозина и S-аденозилгомоцистеина (SAH), и оценивают аналит методами, отличными от хроматографических.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пробу после завершения ферментативной реакции с SAH-гидролазой контактируют с антителом к аналиту в присутствии гаптена для антитела, отличного от указанного немеченного аналита, при этом оценку аналита осуществляют по количеству гаптена, связанного или несвязанного с антителом.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что гаптен представляет собой полигаптен.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что гаптен представляет собой меченую молекулу, имеющую эпитопную структурную единицу, аналогичную эпитопной структурной единице немеченого аналита.

5. Способ по любому из пп. 2 - 4, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.

6. Способ по любому из пп. 2 - 5, отличающийся тем, что антитело связано с носителем-матрицей.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пробу после завершения ферментативной реакции с участием SAH-гидролазы контактируют со вторым ферментом, который превращает указанный аналит, при этом оценку указанного аналита осуществляют по количеству субстрата второго фермента, отличного от указанного аналита или образовавшегося продукта превращения аналита.

8. Способ по п. 1 или 7, отличающийся тем, что аналит представляет собой аденозин.

9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что аденозинпревращающий фермент представляет собой аденозинкиназу.

10. Способ по п. 7, отличающийся тем, что аденозин подвергают ферментативному превращению в присутствии аденозинкиназы и АТФ не менее 1 мин, затем добавляют люциферин и люциферазу и регистрируют генерируемый свет.

11. Способ по п. 7, отличающийся тем, что аденозинпревращающий фермент представляет собой аденозиндезаминазу.

12. Способ по п. 7, отличающийся тем, что аденозин оценивают в присутствии аденозиндезаминазы, нуклеозидфосфорилазы, ксантиноксидазы и пероксидазы по поглощению УФ.

13. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что аналит представялят собой S-аденозилгомоцистеин.

14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оценку осуществляют в присутствии меченого 6-тиоэфира фуранозы или SAH, меченого хромофором или флуорофором.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пробу после завершения ферментативной реакции с участием SAH-гидролазы контактируют с меченным флуорофором SAH или меченным флуорофором 6-тиоэфиром фуранозы, затем добавляют моноклональное антитело к SAH, при этом связанное или несвязанное с антителом меченое флуорофором соединение оценивают по поляризации флуоресценции.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пробу после завершения ферментативной реакции с участием SAH-гидролазы контактируют с меченным SAH или меченным 6-тиоэфиром фуранозы, затем добавляют моноклональное антитело к SAH, связанное с матрицей-носителем, матрицу-носитель с антителами промывают, связанное с антителами меченое соединение оценивают фотометрически.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что метку связанного с антителами меченого соединения подвергают ферментативной реакции для генерирования хромофора и оценивают его фотометрически.

18. Способ по п. 3, отличающийся тем, что оценку осуществляют по осаждению или агглютинации конъюгатов антитело-полигаптен.

19. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве гаптена используют соединение формулы I или его соль, или сложный эфир.

где R₁ и R₂ одинаковые и обозначают атомы водорода или OR₄ группы или вместе атом кислорода, или разные и обозначают атом водорода и OR₄, R₄ обозначает C_1-6-алифатическую группу, а R₃-амино- или карбоксигруппу.

20. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве гаптена используют меченый 6-тиоэфир фуранозы, при этом меченая часть представляет собой хромофор или флуорофор или радиоактивный атом, тиоэфирная часть представляет собой триметилентиогруппу.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что в качестве меченого тиоэфира используют соединение формулы I по п. 19.

22. Способ по п. 8, отличающийся тем, что SAH-гидролазу используют в инактивированной форме, при этом активирование проводят восстанавливающим агентом.

23. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проба представляет собой пробу крови, плазмы или мочи, предварительно обработанную восстанавливающим агентом.

24. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оценку аналита осуществляют фотометрически.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что оценку осуществляют спектрофотометрически или колориметрически.

26. Способ по п. 24, отличающийся тем, что оценку осуществляют турбидиметрически или нефелометрически.

27. Способ по п. 24, отличающийся тем, что оценку осуществляют по поляризации флуоресценции.

28. Аналитический набор для определения гомоцистеина в пробе по п. 1, включающий SAH-азу и субстрат, отличающийся тем, что дополнительно содержат агент, образующий сигнал, а в качестве субстрата - аденозин или аналог аденозина, или S - аденозилгомоцистеин.

29. Набор по п. 28, отличающийся тем, что дополнительно содержит средства для оценки сигнала.

30. Набор по п. 28, отличающийся тем, что в качестве агента, образующего сигнал, содержит меченый SAH и необязательно связанное с матрицей-носителем антитело к SAH.

31. Набор по п. 29 или 30, отличающийся тем, что в качестве средства для оценки сигнала содержит средство для фотометрической оценки меченого SAH или его производного.

32. Набор по п. 28, отличающийся тем, что в качестве субстрата содержит аденозин.

33. Набор по п. 32, отличающийся тем, что дополнительно содержит связанное с матрицей антитело к SAH и полигаптен для антитела к SAH.

34. Набор по любому из пп. 29 - 32, отличающийся тем, что средство для оценки сигнала представляет средство для фотометрического определения агглютинации или преципитации комплексов антитело-полигаптен.

35. Набор по п. 29, отличающийся тем, что в качестве субстрата содержит аденозин, в качестве агента, образующего сигнал, аденозинпревращающий фермент, отличный от SAH-азы, а средство для оценки сигнала представляет собой средство для генерирования фотометрически определяемого ответа.

36. Набор по п. 35, отличающийся тем, что дополнительно содержит ко-субстрат к аденозинпревращающему ферменту.

37. Набор по п. 35, отличающийся тем, что фермент представляет собой аденозинкиназу, а средство для генерирования ответа содержит АТФ, люциферин и люциферазу.

38. Набор по п. 35, отличающийся тем, что фермент представляет собой аденозиндезаминазу, а средство для генерирования ответа содержит нуклеозидфосфорилазу, ксантиноксидазу и пероксидазу.

39. Набор по п. 28, отличающийся тем, что содержит неактивную SAH-азу, а в качестве активатора - восстанавливающий агент.

40. Набор по п. 39, отличающийся тем, что содержит дитиотреитол в кислой среде.

Приоритет по пунктам:
22.01.92 по пп. 1, 7, 8, 11, 12, 13, 23, 24, 25, 27, 28, 29;
10.02.92 по пп. 30, 31;
22.01.93 по пп. 32 - 40.