Способ получения микролуковиц тюльпанов из изолированных зародышей в условиях in vitro

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, предназначено для выполнения работ по селекции и семеноводству тюльпанов. Изолированные зародыши сначала культивируют на агаризованной среде Ван-Гофа, затем на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, дополнительно содержащей азотнокислый никель 2,5 мг/л и хлорид алюминия 2,5 мг/л. В качестве регуляторов роста поочередно используют 6-бензиламинопурин, α-нафтилуксусную кислоту, β-индолилмасляную кислоту при последовательной смене температурного и светового режимов. Способ позволяет улучшить развитие гибридных зародышей от межвидовых скрещиваний, увеличить выход луковичек более чем в 74 раза по сравнению с условиями in vivo. 5 табл.

Способ относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к способам культивирования изолированных зародышей растений, и может быть использован для выполнения работ по селекции и семеноводству тюльпанов.

При получении гибридов от отдаленных и разногеномных скрещиваний тюльпанов образуются маложизненные или нежизнеспособные семена и растения, при этом наблюдается медленное нарастание вегетативной массы и слабое размножение луковичек в ювенильном периоде, что затягивает селекционный процесс до 20 и более лет.

Известно, что повысить результативность селекционной работы возможно при использовании метода изолированных зародышей в условиях in vitro.

Аналоги способа получения посадочного материала из изолированных зародышей тюльпанов нам не известны. Имеющиеся сведения о размножении сортов тюльпанов из эксплантов различных органов in vitro - цветоноса, базальной части чешуек луковиц, верхушечных почек (C.M. Baker, P.D. Asher, H.F. Wilkins, 1989, A. G. Taeb and P.G. Alderson. 1990) не дают цельного представления о сроках изоляции, режимах выращивания и составе питательных сред на разных этапах культивирования эксплантов от вычленения на искусственную питательную среду до образования микролуковиц, что сдерживает применение метода изолированных зародышей в условиях in vitro в селекционном процессе тюльпанов.

Цель изобретения - улучшение развития и повышение жизнеспособности зародышей межвидовых и полиплоидных гибридов, получение микролуковиц из изолированных зародышей в условиях in vitro с одновременным увеличением коэффициента размножения тюльпанов в ювенильной стадии.

Поставленная цель достигается культивированием изолированных зародышей тюльпанов в условиях in vitro в 4 этапа, каждый из которых отличается использованием определенной питательной среды, температурным и световым режимом.

Исходный материал в виде неполностью вызревших зародышей размером 3-5 мм изолируют от материнского растения и культивируют на питательной среде Ван-Гофа до развития зародышей 6-7 мм; образовавшиеся проростки переносят на питательную среду Мурасиге и Скуга модифицированную, содержащую никель азотнокислый 2,5 мг/л и алюминий хлористый 2,5 мг/л, дополненную регуляторами роста 6-бензиламинопурином (6 БАП) 3 мг/л и α- нафтилуксусной кислотой (НУК) 0,15 мг/л, с увеличением концентрации сахарозы до 60000 мг/л. Культивируют при температуре 23 - 25^oC и освещенности 2-3 тыс. люкс до развития достаточного количества вегетативной массы (образования дополнительных побегов). Через 12 - 32 недели (около 8 месяцев) в зависимости от генотипа (комбинации скрещивания, от которой были изолированы зародыши) вегетирующие растения переносят на ту же питательную среду (Мурасиге и Скуга модифицированную) с 6%-ной сахарозой, содержащей в качестве регулятора роста β-индолилмасляную кислоту (ИМК) 0,5 мг/л. Растения культивируют при температуре 4 - 9^oC в условиях темноты в течение 9 - 12 недель до закладки микролуковиц (бульбообразующих побегов). В дальнейшем полученные растения с зачатками микролуковиц оставляют на той же среде при исходном световом и температурном режиме до полного формирования микролуковиц, которое продолжается в течение 30 - 150 дней в зависимости от генотипа зародышей.

Пример получения микролуковиц тюльпанов из изолированных зародышей в условиях in vitro, осуществляемый в 4 этапа, показан на комбинации Айсберг х св.опыление ((Лавли Серпрайз х Т. Кауфмана х св.опыление).

1 Этап - изоляция зародышей размером 3 - 5 мм от материнского растения на 8 питательных сред и культивирование при температуре 23 - 25^oC, освещенности 2 - 3 тыс. люкс. После культивирования в течение 2 - 3 недель степень активности органогенеза устанавливали по характеру образования морфогенных зон и дифференцированной ткани (табл. 1).

Лучшей питательной средой для введения зародышей оказался вариант 8 (среда Ван-Гофа).

2 Этап - перенос развивающихся зародышей 6 - 7 мм на питательную среду Мурасиге и Скуга модифицированную, содержащую азотно-кислый никель 2,5 мг/л, хлорид алюминия 2,5 мг/л, с регуляторами роста 6-БАП от 2 до 3 мг/л и НУК от 0,1 до 0,2 мг/л, с увеличением сахарозы до 4 - 6%, при исходном световом и температурном режиме. Наилучшее нарастание вегетативной массы и образование дополнительных побегов получено с регуляторами 6 БАП 3 мг/л плюс НУК 0,15 мг/л при содержании сахарозы 6% (табл. 2 и 3).

3 Этап - перенос образовавшейся вегетативной массы на свежую среду Мурасиге и Скуга того же состава, содержащей в качестве регулятора β-индолилмасляную кислоту (ИМК) в концентрации 0,2 - 1,0 мг/л. Наибольшее число зачатков микролуковиц (бульбообразующих побегов) в течение около 12 недель получено при ИМК 0,5 мг/л (табл. 4).

4 Этап - продолжение культивирования растений на той же среде, при исходном температурном и световом режимах, до полного формирования микролуковиц.

Предложенный способ дает возможность улучшить развитие гибридных зародышей от межвидовых и разногеномных скрещиваний и увеличить выход луковичек более чем в 74 раза по сравнению с условиями in vivo, намного повысив таким образом эффективность селекционного процесса (табл. 5).

Формула изобретения

Способ получения микролуковиц тюльпанов из изолированных зародышей в условиях in vitro, заключающийся в том, что неполностью вызревшие зародыши размером 3 - 5 мм предварительно культивируют на питательной среде Ван Гофа при температуре 23 - 25^oC и освещенности 2 - 3 тыс.люкс до развития зародышей 6 - 7 мм, затем переносят на модифицированную среду Мурасиге и Скуга, дополнительно содержащую азотнокислый никель 2,5 мг/л, хлорид алюминия 2,5 мг/л, регуляторы роста 6-бензиламинопурин 3 мг/л, α-нафтилуксусную кислоту 0,15 мг/л и увеличенное до 60000 мг/л количество сахарозы, культивируют при том же температурном и световом режимах до развития вегетативной массы, переносят на среду Мурасиге и Скуга того же состава, содержащую в качестве регулятора роста β-индолилмасляную кислоту 0,5 мг/л и продолжают культивировать в темноте при температуре 4 - 9^oC до закладки микролуковиц и затем культивируют в исходном температурном и световом режимах до полного формирования микролуковиц.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2