Способ получения субкомпонента c1g комплемента человека

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии и может быть использовано в медицине и биохимии для создания тест-систем, а также для исследовательных целей. Способ осуществляется последовательным осаждением С1q из сыворотки крови путем диализа в присутствии ЭДТА против растворов с низкой ионной силой, содержащих δ-аминокапроновую кислоту при первом осаждении и гексаметилендиамин - при втором, окончательное осаждение сульфатом аммония приводит к получению препарата С1q. Технический результат: препарат не содержит примесей и является высокоактивным.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к области получения высокоочищенных и высокоактивных препаратов белков иммунной системы организма, которые могут быть использованы в медицине и биохимии для создания тест-систем, а также для исследовательских целей.

Препараты субкомпонента C1q первого компонента комплемента человека используются для создания тест-систем для определения циркулирующих иммунных комплексов, содержания анти-C1q в крови больных ревматическими заболеваниями, а также для создания гемосорбентов для удаления иммунных комплексов из кровотока.

В большинстве методов получения C1q используются хроматографические и аффиннохроматографические методы, что является часто сложным, дорогим и не обеспечивает, тем не менее, достаточную чистоту препаратов. Наиболее близким к предлагаемому способу выделения и очистки является метод Yonemasu K., Stroud R.M. [1], состоящий из трех последовательных осаждений выделяемого из сыворотки C1q с помощью диализа против раствора ЭГТА (со сменой буфера) и дважды против растворов ЭДТА. К недостаткам метода следует отнести большой расход дефицитного и дорогого ЭГТА, а также наличие примесей в конечном продукте, о чем указывалось в работе Conradi J.D., Volanakis J.F., Stroud R. M. [2].

Нами разработан способ, позволяющий простыми средствами получить препарат субкомпонента C1q комплемента человека, не содержащий примесей.

Способ осуществляется следующим образом: проводят последовательные осаждения C1q из сыворотки крови диализом в присутствии ЭДТА против растворов с низкой ионной силой, содержащих ε -аминокапроновую кислоту при первом осаждении и гексаметилендиамин - при втором, окончательное осаждение сульфатом аммония приводит к получению препарата C1q, который по данным иммуноэлектрофореза не содержит примесей, а по данным определения функциональной активности C1q является высокоактивным.

Пример. К 100 мл нормальной донорской сыворотки добавляют 1 мл 0,1 М ε -аминокапроновой кислоты и 2,06 мл 0,5 М ЭДТА. Доводят pH сыворотки до 8,8 (8,6 или 9,0) с помощью 0,15 М NaOH и проводят диализ против 10 л 0,01 М мединалового буфера, pH 8,8, содержащего 1 мМ ε -аминокапроновую кислоту и 1 мМ ЭДТА, 20 ч при +4^oC. Осадок промывают 10 мл дистиллированной воды и осаждают центрифугированием при 10000 об./мин, +4^oC. Процедуру отмывки повторяют трижды. Осадок растворяют в 2 мл буферного раствора состава: 0,05 М ЭДТА, 0,75 М NaCl, pH 7,5 (7,0 или 8,0), и диализуют против 1 л 5 мМ гексаметилендиамина, pH 7,5 (7,0 или 8,0). Осадок трижды промывают дистиллированной водой, каждый раз отделяя его центрифугированием. Осадок растворяют в 2 мл буферного раствора, pH 7,5, содержащего 1 мМ ЭДТА и 1 М NaCl. К раствору после центрифугирования добавляют 0,44 мл насыщенного раствора сульфата аммония до 18% насыщения и оставляют на 12 ч при +4^oC. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и трижды промывают дистиллированной водой. Выход C1q из 100 мл сыворотки по белку составляет 6,5 мг, что составляет 80%. По данным иммуноэлектрофореза с антисыворотками против IgG, IgM и всех белков плазмы крови человека дает только одну линию преципитации, соответствующую C1q, против антисыворотки ко всем белкам.

Источники информации 1. Yonemasu K., Stroud R.M. C1q: rapid purification method for preparation of monospecific antisera and for biochemical studies//J. Immunol. 1971. V. 106, P. 304 -314.

2. Conradi J.D., Volanakis J.F., Stroud R.M. Evidence for serum inhibitor of C1q//Immonochemistry. 1975. V. 12. P. 967 - 971.

Формула изобретения

Способ получения субкомпонента C1q комплемента человека, включающий последовательное осаждение его из сыворотки крови диализом против растворов с низкой ионной силой в присутствии ЭДТА, отличающийся тем, что в качестве растворов с низкой ионной силой используют для первого осаждения 1мМ раствор ε-аминокапроновой кислоты, рН 8,6 - 9,0, а для второго осаждения 5 мМ гексаметилендиамин, рН 7,0 - 8,0.