Способ получения сыворотки растительного белка, обогащенной изофлавонами аглюкона (варианты), способ извлечения белка сыворотки

 

Способ предназначен для получения обогащенной изофлавоном аглюкона сыворотки соевого белка и белка сыворотки. В сыворотке соевого белка, содержащей изофлавоны глюкона, проводят реакцию изофлавоном глюкона с ферментом бета - глюкосидазой и эстеразой или с кислотой. Реакцию проводят с ферментами при температуре 40-60^oC, pH 4-8 в течение 2-48 ч. Реакцию с кислотой проводят при pH 1-2, температуре 80-90^oC 30-180 мин. Белок извлекают из сыворотки. Количество изофлавонов аглюкона составляет как минимум 50% от изофлавонов, содержащихся в сыворотке. Способ позволяет преобразовать большинство изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона, которые используют при лечении раковых заболеваний. 3 с. и 27 з.п. ф-лы, 6 табл.

Настоящее изобретение относится к получению обогащенной изофлавоном аглюкона сыворотки растительного белка и белка сыворотки путем реакции сыворотки растительного белка, содержащей белок и изофлавоны, с одним или большим числом ферментов бета-глюкосидазы или кислотой для преобразования в принципе всех изофлавонов глюкона в аглюконы с получением обогащенной аглюконом сыворотки. Обогащенный аглюконом белок сыворотки также получается извлечением белка из обогащенной сыворотки. Это частичное продолжение заявки на патент США N 08/135.192, поданной 12 октября 1993 г.

Изофлавоны встречаются в разнообразных бобовых растениях, включая такие материалы растительного белка как соевые бобы. Эти соединения включают в себя даидзин, 6''-OAc даидзин, 6''-OMal даидзин, даидзеин, генистин, 6''-OAc генистин, 6''-OMal генистин, генистеин, глицитин, 6''-OAc-глицитин, 6''-OMal глицитин, глицитеин, биоханин A, формононетин и коуместрол. Обычно эти соединения ассоциируются с горьким привкусом, присущим соевым бобам, и в производстве коммерческих продуктов, таких как выделенные вещества и концентраты, внимание фокусировалось на удалении этих материалов. Например, в обычном процессе получения выделенного вещества белков сои, в котором хлопья сои экстрагируются водной щелочной средой, большинство изофлавонов переводится в экстракте в растворимую форму и остается переведенным в растворимую форму в сыворотке, которая обычно выбрасывается после кислотного осаждения белка для образования выделенного вещества.

Остаточные изофлавоны, покинувшие выделенное вещество белка, осажденное в кислоте, обычно удаляются исчерпывающей промывкой выделенного вещества.

Недавно было признано, что изофлавоны, содержащиеся в растительных белках, такие как соевые бобы, могут замедлить рост раковых клеток человека, таких как раковые клетки в груди и раковые клетки предстательной железы, как описано в следующих статьях: "Замедление генистеином роста раковых клеток в груди человека, независимость от рецепторов эстрогена и ген многолекарственного сопротивления" Питерсона и Барнса, Biochemical and Biophysical Research, Communications, Vol. 179, N 1, стр. 661-667, 30 авг. 1991; "Генистеин и Биоханин А замедляют рост раковых клеток предстательной железы человека, но не эпидермический фактор роста рецептора автофосфорилации тирозина" Питерсона и Барнса. The Prostate, Vol.22, стр. 335-345 (1993); и "Соевые бобы замедляют рост опухоли грудной железы в моделях рака груди" Барнса и др., "Мутагены и карциногены в питании", стр. 239-253 (1990).

Из указанных изофлавонов несколько существуют как глюкосиды или как глюконы с молекулой глюкозы, прикрепленной к 7 позициям, как показано в формуле ниже. Некоторые из глюконов, такие как 6''-OAc генистин, содержат группу ацетата, прикрепленную к 6 позиции самой молекулы глюкозы. Хотя все изофлавоны, включая глюкосиды, представляют интерес для медицинской оценки, конкретные наиболее интересные изофлавоны - это аглюконы, когда молекула глюкозы не прикреплена. Эти изофлавоны не так растворимы в воде, как глюконы или глюкосиды. Конкретные изофлавоны в этой категории - это даидзеин, генистеин и глицитеин.

Эти аглюконы имеют следующую общую формулу: где R₁, R₂, R₃ и R₄ могут выбираться из группы, состоящей из H, OH и OCH₃.

Поэтому настоящее изобретение направлено на аглюконы и обогащение сыворотки растительного белка или белка сыворотки этими материалами.

В технике известны способы преобразования изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона, такие как описанные в заявке на патент Японии N 01258.669 на имя Обаты и др. Такие процессы позволяют достигать только умеренной степени преобразования и потому нежелательны, особенно для широкомасштабных коммерческих операций. Кроме того, известные процессы, такие как описаны в заявке 669, описывают удаление изофлавонов из материала белка и не описывают, как приготовить обогащенную изофлавоном аглюкона сыворотку белка. Таким образом, существует потребность в процессе преобразования как минимум большинства и предпочтительно в принципе всех изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона и для получения обогащенной изофлавоном аглюкона сыворотки и белка сыворотки.

Поэтому целью настоящего изобретения является создание обогащенной изофлавоном аглюкона сыворотки белка, белка сыворотки и процесс получения их. Эта и другие цели конкретно достигаются в подробном описании настоящего изобретения, изложенном ниже.

Настоящее изобретение обеспечивает процессы получения обогащенной изофлавоном аглюкона сыворотки растительного белка, включающие в себя получение сыворотки растительного белка, содержащей изофлавоны глюкона и реакцию изофлавонов глюкона с достаточным количеством одного или большего числа ферментов бета-глюкосидазы в течение времени, при температуре и значении pH, достаточных для преобразования как минимум большинства изофлавонов глюкона в сыворотке в изофлавоны аглюкона с получением обогащенной изофлавоном аглюкона сыворотки. Это изобретение также создает способы получения такой сыворотки, когда дополнительная бета-глюкосидаза добавляется в сыворотку для получения обогащенной изофлавоном аглюкона сыворотки. Это изобретение также создает способы получения такой сыворотки путем обработки одной или несколькими кислотами. Кроме того, это изобретение обеспечивает получение обогащенной изофлавоном аглюкона сыворотки растительного белка и продуктов сыворотки. Кроме того, это изобретение также создает способы извлечения, в относительно высоких пропорциях, изофлавонов в сыворотке и белке сыворотки из материалов растительного белка.

Хотя это изобретение будет описано в отношении продуктов из соевых бобов и хотя процесс особенно пригоден для получения обогащенной изофлавоном аглюкона сыворотки из материала соевых бобов, тем не менее этот процесс в общем применим для получения обогащенных аглюконом сывороток из резных источников растительного белка, содержащих изофлавоны. Полимер такого источника - это материал растительного белка, содержащий сою или материалы соевых бобов. Термин "материал соевых бобов", как он здесь используется, означает соевые бобы или производную соевых бобов.

Исходный материал в соответствии с предпочтительными примерами осуществления - это хлопья соевых бобов, из которых масло было удалено экстракцией в растворителе. Хлопья экстрагируются водным экстрагирующим веществом, имеющим pH выше приблизительно изоэлектрической точки материала белка, предпочтительно pH приблизительно 6,0-10,0 и наиболее предпочтительно pH приблизительно 6,7-9,7. При желании можно применять обычные щелочные реагенты для повышения pH водного экстрагирующего вещества, такие как гидроокись натрия, гидроокись калия и гидроокись кальция. Желаемые соединения изофлавона обычно делаются растворимыми в водном экстракте.

Также желательно для повышения извлечения этих соединений в водном экстракте, чтобы весовое отношение хлопьев соевых бобов к экстракту контролировалось до конкретных уровней, чтобы сделать растворимыми как можно больше изофлавонов, присущих материалу белка.

Экстракцию белков и изофлавонов можно проводить многими способами, включая экстракцию противотоком хлопьев при весовом отношении водного экстрагирующего вещества к хлопьям приблизительно от 8:1 до 16:1, в котором начальный экстракт используется для экстрагирования хлопьев и для получения водного экстракта белка и изофлавонов. В качестве альтернативы, можно использовать двухэтапный процесс экстракции, в котором весовое отношение экстрагирующего вещества к хлопьям на начальном этапе составляет около 10:1, и затем имеет место вторая экстракция хлопьев со свежим экстрагирующим веществом при весовом отношении экстрагирующего вещества к хлопьям около 6:1, так что комбинированное весовое отношение экстрагирующего вещества к хлопьям на обоих этапах не превышает общего весового отношения экстрагирующего вещества к хлопьям около 16:1.

Значение pH полученного экстракта белка со ставшими растворимыми изофлавонами затем устанавливается на примерно изоэлектрическую точку белка, чтобы осадить белок.

Значение pH устанавливается на приблизительно изоэлектрической точке белка путем добавления столовой кислоты, например уксусной, серной, фосфорной, соляной или любого другого пригодного реагента. Изоэлектрическая точка для соевого белка - это обычно около 4,4-4,6. Материал белка осаждается в виде творогообразной массы, которую можно отделить от водного экстракта. Остающийся водный экстракт исходного материала называется "сывороткой" любого источника растительного белка, который используется в качестве исходного материала. Изофлавоны в большинстве своем остаются способными к растворению в сыворотке и для повышения извлечения в сыворотке может быть желательным дополнительное промывание осажденного белка для обеспечения полного извлечения изофлавонов.

Изофлавоны глюкона в сыворотке преобразуются в изофлавоны аглюкона посредством реакции с ферментом или реакции с кислотой. Преобразование с использованием фермента следующее. Изофлавоны глюкона в сыворотке реагируют с достаточным количеством одного или нескольких ферментов бета-глюкосидазы для преобразования, как минимум, большинства, и предпочтительно в принципе всех, изофлавонов в виде глюкона в аглюконы.

Фермент бета-глюкосидазы может естественно присутствовать в материале соевых бобов или присутствовать из-за роста микробов, что называется здесь "остаточным" ферментом, или же он может добавляться к сыворотке. Добавленный фермент называется здесь "дополнительным ферментом". В общем случае, если концентрация остаточного фермента в сыворотке недостаточна для преобразования большинства (предпочтительно в принципе всех) изофлавонов в форме глюкона в форму аглюкона, то нужно добавить дополнительный фермент.

Количество фермента, достаточное для осуществления преобразования изофлавонов, меняется от многих факторов, включая виды присутствующих ферментов, распределение концентраций ферментов, значение pH системы и активность присутствующих ферментов. Если достаточные концентрации ферментов имеются, либо посредством остаточных ферментов, либо посредством дополнительных ферментов, либо посредством обоих, сыворотка со способными растворяться изофлавонами реагирует с ферментами бета-глюкосидазы в течение периода времени, при температуре и pH достаточными, чтобы преобразовать как минимум большинство изофлавонов глюкона, и предпочтительно в принципе их всех, содержащихся в сыворотке, в форму аглюкона.

К числу предпочтительных дополнительных ферментов бета-глюкосидазы относятся биопектиназа 100L и 300L, биопектиназа OK 70L, лактаза F и лактозим. Лактаза F поставляется фирмой Amano International Enzyme Co., Inc., а/я 1000, Трой, Вирджиния 22974, она имеет оптимальный диапазон pH приблизительно 4-6, а лактозим поставляется фирмой Novo Industries. Enzyme Division. Ново Алле, DK-2880, Багсвэрд, Дания, и имеет оптимальный диапазон pH около 7. Биопектиназа 100L, биопектиназа 300L и биопектиназа OK 70L поставляются фирмой Quest International. Сарасота, Флорида. Дополнительные ферменты добавляются в количествах, достаточных для преобразования как минимум большинства изофлавонов глюкона, содержащихся в сыворотке, и предпочтительно в принципе их всех, в аглюконы. В тех случаях, когда необходимо добавить дополнительные ферменты, количество добавляемого фермента составляет приблизительно 0,5-5% по весу от твердых веществ сыворотки на сухой основе.

Другой класс пригодных ферментов для добавления в качестве дополнительных ферментов - это класс ферментов эстеразы.

Считается, что эти ферменты хорошо подходят для процессов предпочтительных примеров осуществления, описанных здесь, так как они преобразуют сопряжения ацетата и малоната в изофлавоны глюкона путем удаления групп ацетата и малоната из сопряжений изофлавона. В большинстве предпочтительных примеров используются оба типа ферментов, ферменты глюкосидазы и эстеразы.

Процессы в предпочтительных примерах осуществления - это предпочтительно одноэтапные процессы и они достигают очень высоких степеней преобразования изофлавонов (из формы глюкона в форму аглюкона) за относительно короткое время и с относительной легкостью и экономичностью. Используемый здесь термин "одноэтапный" процесс реакции означает процесс реакции, в котором определенные значения параметров процесса обычно поддерживаются в ходе процесса реакции. К числу этих параметров процесса относятся pH и температура.

Очень высокие степени преобразования это такие, что как минимум большинство изофлавонов в форме глюкона, и предпочтительно в принципе все они, присутствующие в сыворотке, преобразуются в форму аглюкона. Термин "как минимум большинство" обозначает степень преобразования изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона как минимум около 50%. Термин "в принципе все" обозначает степень преобразования изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона как минимум 80% и наиболее предпочтительно как минимум около 90%.

Хотя мы не хотим связывать себя с какой-либо конкретной теорией, считается, что удивительно и неожиданно высокие степени преобразования в описанных здесь процессах возникают из комбинации параметров процесса, используемых в течение процесса одноэтапной реакции.

Предпочтительно, чтобы pH системы реакции поддерживался, или приблизительно поддерживался, на значении приблизительно 4 - 8 и наиболее предпочтительно на значении, при котором фермент(ы) наиболее активны до реакции с сопряжением (сопряжениями) изофлавона во время процесса одноэтапной реакции. Значение pH сыворотки обычно устанавливается примерно в диапазоне pH, в котором конкретный фермент наиболее активен до реакции с ферментом. Предпочтительно, чтобы температура реакционной системы поддерживалась, хотя бы приблизительно, приблизительно от 40^oC до 60^oC и наиболее предпочтительно около 60^oC во время процесса одноэтапной реакции. В общем случае, периоды времени, необходимые для достижения преобразования в принципе всех изофлавонов глюкона в аглюконы описанными здесь одноэтапными процессами, составляют приблизительно 2 - 24 часа. В некоторых случаях может быть желательно использовать периоды времени более 24 часов, например 48 часов.

Альтернативная процедура для целей этого изобретения для преобразования изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона - это реакция сыворотки с одной или большим числом столовых кислот при значениях pH, времени и температуры, достаточных для преобразования как минимум большинства и в принципе всех, изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона. Это также обычно делает белок нерастворимым, что позволяет отделять белок от оставшейся сыворотки. Предпочтительный диапазон pH для этой процедуры составляет приблизительно 1,0 - 2,0, температуры обычно приблизительно 80 - 90^oC или выше, и обычные промежутки времени приблизительно 30 - 160 минут или дольше. Преобразование изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона может также происходить при более высоком pH.

Эффективные реакции могут иметь место при таких высоких значениях pH как приблизительно 4,5. Но реакция проходит намного медленней и требует значительно большего времени. Например, при pH 4,5 и температуре 50^oC необходим период времени около 24 часов.

После преобразования изофлавонов глюкона в изофлавоны аглюкона жидкую сыворотку можно использовать при желании без высушивания или удаления белка или, как альтернативы, белок сыворотки можно извлечь для концентрирования изофлавонов аглюкона в белке, поскольку изофлавоны аглюкона менее растворимы, чем изофлавоны глюкона. Извлечение белка сыворотки, обогащенного изофлавонами аглюкона, можно осуществлять обычными процедурами, включая обезвоживание, коагуляцию при нагревании и ультрафильтрацию. Получившийся обогащенный белок сыворотки можно обезвоживать и высушивать обычными способами, чтобы получить высушенный белок сыворотки, обогащенный изофлавонами аглюкона. Пример растительного белка, сыворотки обогащенного изофлавоном аглюкона, в соответствии с предпочтительным примером осуществления имеет содержание генистеина с сухой основой приблизительно 2,6 - 8,7 мг/г и содержание даидзеина с сухой основой приблизительно 2,5 - 6,0 мг/г.

Настоящее изобретение также предусматривает способы извлечения изофлавонов в сыворотке и белке сыворотки в очень высоких пропорциях из материала растительного белка, такого как материал соевых бобов. Уровни извлечения, получаемые описанными здесь процессами, обычно составляют как минимум 50%, предпочтительно 65% и наиболее предпочтительно 80% на основании суммы всех видов конкретного изофлавона в исходном материале растительного белка. Хотя мы не желаем быть связанными какой-либо конкретной теорией, считается, что высокие уровни извлечения являются результатом описанных здесь реакций преобразования в сочетании с также описанными разными операциями обработки. Путем преобразования сопряжений изофлавона аглюкона, которые относительно растворимы, в менее растворимые виды аглюкона на конкретном этапе обработки можно извлечь в получающийся продукт высокую процентную составляющую изофлавона из подаваемого материала.

Следующие примеры описывают конкретные, но не являющиеся ограничительными, примеры осуществления этого изобретения.

Образцы 16% водных суспензий высушенной распылением сыворотки приготовлялись в буфере 0,02 N фосфата (pH 7) и выдерживались в термостате 0, 3 и 24 часа при 45^oC с добавками препаратов фермента и без этих добавок. Образцы, в которые добавлялся дополнительный фермент, получили биопектиназу 100L в концентрации 0,4% по весу. Все образцы анализировались на содержание изофлавона. Процентное распределение изофлавонов, обнаруженное в ходе эксперимента, указано в табл. 1 (см. в конце описания).

Концентрация изофлавона аглюкона образцов, в которых не добавлялось фермента, после 24 часов выдержки была относительно низкой, например, генистеин 10%, даидзеин 6% и глицитеин 8%. Полезное влияние добавления дополнительного фермента демонстрируется значительно более высокими концентрациями генистеина и даидзеина, например 70 и 66% соответственно. Концентрация каждого вида описанного здесь изофлавона основана на общей сумме всех форм этого вида изофлавона.

В другом эксперименте значение pH образцов сыворотки устанавливалось на 7. Образцы выдерживались при 45^oC. После 24 часов выдержки в половину всех образцов добавлялись достаточные количества дополнительного фермента бета-глюкосидазы биопектиназы 100L. Все образцы помещались при 45^oC и выдерживались дополнительно 22 часа. Подобразцы брались при t=0, 5, 24 и 46 часах и анализировались. Все образцы анализировались на содержание изофлавона. Процентное содержание каждого изофлавона, обнаруженного в ходе эксперимента, указано в таблицах 2A и 2B в конце описания. В таблице 2A подытоживается содержание изофлавона в образцах, в которые не добавляло дополнительного фермента бета-глюкосидазы. В таблице 2B показано распределение изофлавона в образцах, которые вначале выдерживались 24 часа без добавки дополнительного фермента и в котором затем добавлялось достаточное количество биопектиназы 100L. Таким образом, значения времени, указанные в таблице 2B, относятся к моменту добавления в образцы дополнительного фермента. Например, образцы, указанные для t= 0 часов в таблице 2B, на деле выдерживались 24 часа без фермента.

А образцы, перечисленные в таблице 2B при t=22 часа, выдерживались 22 часа после добавления дополнительного фермента и выдерживались 24 часа до добавления дополнительного фермента.

Данные в таблице 2A показывают образцы, имеющие едва достаточные концентрации остаточных ферментов, т.к. концентрации генистеина, даидзеина и глицитеина после выдержки 24 и 46 часов менее 50%. Данные в таблице 2B показывают полезность добавления дополнительного фермента, т.к. после добавления фермента преобразование было 100% для генистеина и даидзеина и 87% для глицитеина.

В другой серии экспериментов значение pH сыворотки устанавливалось на 4,5, и они выдерживались с дополнительным ферментом лактазой F. Концентрация лактазы F была 0,02 г на 100 г сыворотки. Образцы брались при t=0; 1,5; 5 и 17 часов во время выдержки при 52^oC. В таблице 3 показано изменение и распределение изофлавонов в ходе эксперимента (см. в конце описания).

Данные в таблице 3 показывают значительное преобразование в глицитеин после 17 часов.

В другом эксперименте образцы сыворотки хранились в автоклаве для разрушения остаточных ферментов и микробов-загрязнителей, значение pH устанавливалось на 4,5, образцы разделялись на 2 группы и фермент добавлялся следующим образом. В 1-ую группу образцов добавлялось 0,1 г препарата дополнительного фермента на каждый 100 г первичной сыворотки в образцах. Во 2-ую группу добавлялось 0,001 г препарата дополнительного фермента на каждый 100 г сыворотки (для этого фермента разбавлялся 1 к 100). Образцы сыворотки выдерживались либо при 40^oC, либо при 60^oC в течение 23 часов. Подобразцы удалялись при t=0, 1, 2, 4, 6 и 23 часах. Дополнительный фермент биопектиназа 300L поставлялся фирмой Quest International. Все образцы анализировались на содержание изофлавона. Распределение изофлавонов, найденное в ходе эксперимента, показано в таблице 4 в конце описания. Биопектиназа 300L преобразовывала сопряжения изофлавона в аглюконы до 90% генистеина, 86% даидзеина и 60% глицитеина при pH 4,5, 60^oC после 23 часов с использованием 0,1 г препарата энзима на 100 г сыворотки. Значительное преобразование произошло только после 1 часа при 60^oC с биопектиназой 300L, как показано 70% генистеина, 62% даидзеина и 44% глицитеина. Скорость преобразования и уровень дозы 0,1 г препарата фермента на 100 г сыворотки были эффективны как при 40^oC, так и при 60^oC. Уровень дозы дополнительного фермента в 100 раз более разбавленного (0,001 г на 100 г первичной сыворотки) не был в 100 раз медленнее.

Данные в таблице 4 показывают значительную степень преобразования, достижимую процессами согласно этому изобретению.

В другой серии экспериментов значение pH сыворотки устанавливалось на 7 и на 8, и добавлялось 0,05 г лактазы F или лактозима на 5 г первичной сыворотки (5% фермента по весу приблизительно подсчитанных 2% твердых веществ в первичной сыворотке). Образцы выдерживались при 40^oC и при 60^oC .Образец удалился до добавления фермента (t=0) и после 24 часов выдержки при нужных температурах. Препарат фермента готовился следующим образцом. Контрольными были образцы, выдержанные без добавления фермента. Все образцы анализировались на содержание изофлавона. Изменение процентного распределения изофлавона в сыворотке после 24 часов выдержки либо с лактозой F, либо с лактозимом показано в таблице 5 в конце описания. Образцы не стерилизовались до добавления ферментов и рост микробных примесей ни коим образом не задерживался.

Как видно из таблицы 5, повышение преобразования в генистеин от 40% до 79% произошло при pH 7 и после 24 часов выдержки при повышении температуры выдержки от 40^oC до 60^oC. Аналогичным образом, еще большие степени преобразования можно получить путем повышения pH, например от 7 до 8. В отношении генистеина преобразование увеличивалось с 79% до 93% при этом изменении pH при температуре 60^oC и за период времени 24 часа.

В другой серии экспериментов процент извлечения генистеина и даидзеина в белке сыворотки, полученном из соевых бобов, был подвергнут исследованию. Процент извлечения находился определением количества генистеина (или даидзеина) в белке сыворотки и выражением этого количества как процентного состава на основе общего количества всех форм генистеина (или даидзеина) в исходном материале соевых бобов.

100 г обезвоженной соевой муки экстрагировалось 1000 г воды при 32^oC в течение 15 минут. Значение pH суспензии было 6,7. Это создавало отношение экстрагирующего вещества к муке 10:1. Затем суспензия центрифугировалась 5 минут для удаления израсходованной муки. Использованная мука экстрагировалась 2-ой раз 600 г воды при 32^oC в течение 5 минут. Это давало отношение экстрагирующего вещества к муке 6: 1. Второй экстракт также отделялся от израсходованной муки центрифугированием в течение 5 минут, 1-ый и 2-ой водные экстракты комбинировались. Значение pH комбинированных экстрактов устанавливалось на 4,5 добавлением HCl для осаждения белка из соевой сыворотки. Соевая сыворотка высушивалась распылением и снова суспензировалась в воде до уровня 20% твердых веществ. Значение pH суспензии сыворотки устанавливалось на 4,5 и температура поддерживалась при 50^oC. Добавлялся 1% по весу твердых веществ сыворотки лактазы F, фермента с активностью бета-глюкосидазы, и проводилась реакция в течение 20 часов при 50^oC для обеспечения полного преобразования изофлавонов глюкона в форму аглюкона. После реакции суспензия сыворотки нагревалась до 95^oC в течение 1 минуты, чтобы сделать нерастворимыми белки сыворотки. Нерастворимый белок сыворотки, содержащий изофлавоны аглюкона, извлекался центрифугированием. Количество генистеина, извлеченного в белке сыворотки, составляло 81% от общей суммы всех форм генистина и генистеина в исходном материале соевых бобов (обезжиренной соевой муки). Аналогичным образом, количество даидзеина, извлеченное в белке сыворотки, составляло 69%.

Содержание изофлавона квантифицировалось следующим образом. Изофлавоны экстрагируются из соевых продуктов путем перемешивания 0,75 7 образца (высушенного распылением или мелко перемолотого порошка) с 50 мл растворителя 80/20 метанол/вода. Смесь встряхивается в течение 2 часов при комнатной температуре орбитальным встряхивателем. Спустя 2 часа остальные нерастворенные материалы удаляются фильтрацией через фильтровальную бумагу Whatman N. 42. 5мл фильтрата разводятся 4 мл воды и 1 мл метанола.

Экстрагированные изофлавоны отделяются посредством ВЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с использованием колонны с обратной фазой Beckman C18. Изофлавоны впрыскиваются в колонну и элюируются градиентом растворителя, начиная с 88% метанола, 10% воды и 2% ледяной уксусной кислоты и кончая 98% метанола и 2% ледяной уксусной кислоты. При скорости течения 0,4 мл/мин все изофлавоны - генистин, 6''-O-ацетигенистин, 6''-O-малонилгенистин, генистеин, даидзин, 6''-O-ацетидаидзин, 6''-O-малониллаидзин, даидзеин, глицитин и его производные и глицитеин - явно растворяются. Амплитудное детектирование проводится удельным поглощением в УФ при 262 мм. Идентификация пиков проводится масс-спектрометром.

Квантификация достигается использованием чистых эталонов (генистин, генистеин, даидзин и даидзеин), приобретенных у фирмы Indofine Chemical Company. Соммервилл, Нью-Джерси. Факторы чувствительности (отклика) (интегральная площадь/концентрация) рассчитываются для каждого из указанных соединений и используются для квантирования неизвестных образцов. Для сопряженных форм, для которых нет чистых эталонов, считается, что факторы чувствительности - это факторы исходной молекулы, но скорректированный по разнице молекулярного веса.

Фактор чувствительности для глицитина принимается как фактор для генистина, скорректированный по разнице молекулярных весов.

Этот способ дает количества каждого отдельного изофлавона. Для удобства, весь генистеин, весь даидзеин и весь глицитеин можно рассчитать как представление суммарного веса этих соединений, если все сопряженные формы преобразованы в их соответствующие несопряженные формы. Эти суммарные количества можно также измерить непосредственно некоторым методом с использованием кислотного гидролиза для преобразования сопряженных форм.

Конечно, нужно понимать, что вышеизложенное - это только предпочтительные примеры осуществления изобретения и что можно сделать различные изменения и модификации, не отходя от смысла и более широких аспектов изобретения, как они изложены в прилагаемой формуле изобретения, которые нужно интерпретировать в соответствии с принципами патентного закона, включая учение об эквивалентах.

Формула изобретения

1. Способ получения сыворотки растительного соевого белка, обогащенной изофлавоном аглюкона, путем получения сыворотки соевого белка, содержащей изофлавоны глюкона, отличающийся тем, что проводят реакцию изофлавонов глюкона с достаточным количеством как минимум одного фермента бета-глюкосидазы и фермента эстеразы в течение времени, при температуре и значении pH, достаточных для преобразования как минимум 50% изофлавонов глюкона в сыворотке в изофлавоны аглюкона с получением сыворотки, обогащенной изофлавонами аглюкона.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают сыворотку растительного соевого белка, содержащую изофлавоны глюкона и достаточное количество остаточного фермента, являющегося как минимум одним из ферментов бета-глюкосидазы и ферментом эстеразы, а реакцию изофлавонов глюкона проводят с остаточным ферментом в течение времени, при температуре и значении pH, достаточных для преобразования как минимум 50% изофлавонов глюкона в сыворотке в изофлавоны аглюкона с получением сыворотки, обогащенной изофлавоном аглюкона.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что после получения сыворотки растительного соевого белка, содержащей изофлавоны глюкона, в нее добавляют дополнительный фермент, являющийся как минимум одним из ферментов бета-глюкосидазы и ферментов эстеразы, в таком количестве, чтобы общая концентрация фермента в сыворотке была достаточна для преобразования как минимум 50% изофлавонов глюкона в сыворотке в изофлавоны аглюкона, затем проводят реакцию изофлавонов глюкона с ферментом в течение времени, при температуре и значении pH, достаточных для преобразования как минимум 50% изофлавонов глюкона в сыворотке в изофлавоны аглюкона с получением сыворотки, обогащенной изофлавоном аглюкона.

4. Способ по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что указанный период времени составляет приблизительно 2 - 48 ч.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный период времени составляет около 24 ч.

6. Способ по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что указанная температура составляет приблизительно 40 - 60^oC.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная температура составляет около 60^oC.

8. Способ по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что значение pH равно приблизительно 4 - 8.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что значение pH равно около 4,5.

10. Способ по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что указанный период времени составляет около 24 ч, указанная температура - около 60^oC и указанное значение pH - около 4,5.

11. Способ по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что он дополнительно включает в себя извлечение материала белка из сыворотки с получением белка сыворотки, обогащенного изофлавонами аглюкона.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что белок сыворотки извлекают как минимум одним из способов, или ультрафильтрацией, или коагуляцией нагреванием, или обезвоживанием.

13. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что материал белка сыворотки извлекают ультрафильтрацией.

14. Способ по п.11, отличающийся тем, что белок сыворотки извлекают способом, включающим в себя нагрев указанной сыворотки при значениях pH, времени и температуры, достаточных для получения нерастворимого белка с последующим отделением ставшего нерастворимым белка от сыворотки.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что значение pH равно приблизительно 1 - 2.

16. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанная температура составляет как минимум 80^oC и ее поддерживают в течение как минимум около 30 мин.

17. Способ по п.14, отличающийся тем, что ставший нерастворимым белок отделяют от сыворотки центрифугированием.

18. Способ по п.14, отличающийся тем, что ставший нерастворимым белок обезвоживают.

19. Способ по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что выбирают такое значение pH, при котором фермент наиболее активен до реакции с изофлавонами глюкона.

20. Способ по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что в принципе все изофлавоны глюкона преобразуют в изофлавоны аглюкона.

21. Способ получения сыворотки растительного соевого белка, обогащенной изофлавонами аглюкона, путем получения сыворотки растительного соевого белка, содержащей изофлавоны глюкона, отличающийся тем, что проводят реакцию упомянутых изофлавонов глюкона с достаточным количеством кислоты при значениях pH, времени и температуры, достаточных для преобразования как минимум 50% изофлавонов глюкона в сыворотке в изофлавоны аглюкона с получением сыворотки, обогащенной изофлавонами аглюкона.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что значение pH равно приблизительно 1 - 2.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанная температура составляет приблизительно 80 - 90^oC.

24. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанное время составляет приблизительно 30 - 180 мин.

25. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанное значение pH равно около 4,5.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанное время составляет около 24 ч.

27. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанная температура составляет около 50^oC.

28. Способ извлечения белка сыворотки с как минимум 50% изофлавонов из материала растительного соевого белка путем получения материала соевого белка, содержащего изофлавоны, отличающийся тем, что после получения материала растительного соевого белка, содержащего изофлавоны, проводят реакцию изофлавонов с достаточным количеством фермента, выбранного из группы, содержащей фермент бета-глюкосидазы и фермента эстеразы, в течение периода времени, при температуре и значении pH, достаточных для преобразования как минимум 50% изофлавонов в материале растительного соевого белка в изофлавоны аглюкона с получением сыворотки, обогащенной изофлавонами, затем белок сыворотки извлекают из обогащенной изофлавонами сыворотки для получения белка сыворотки, содержащего как минимум 50% изофлавонов, содержащихся в материале растительного соевого белка.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что белок сыворотки содержит как минимум 65% изофлавонов, содержащихся в материале растительного соевого белка.

30. Способ по п.28, отличающийся тем, что белок сыворотки содержит как минимум 80% изофлавонов, содержащихся в материале растительного соевого белка.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9

PC4A - Регистрация договора об уступке патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:СОЛАЕ, ЛЛС (US)

(73) Патентообладатель:АРШЕР-ДЭНИЕЛС-МИДЛЕНД КОМПАНИ (US)

Договор № РД0017967 зарегистрирован 02.02.2007

Извещение опубликовано: 20.03.2007        БИ: 08/2007