Продукт, содержащий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (g - csf) и tnf-связующий протеин

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к новым препаратам, содержащим иммуноактивные белки, и предназначен для профилактики и/или лечения септического шока. Предметом изобретения является продукт, содержащий G-CSF или его фармацевтически приемлемую соль и TNF-связывающий протеин или его фармацевтически приемлемую соль. Этот продукт предназначен для лечения и/или профилактики септического шока. Изобретение расширяет арсенал иммуноактивных белковых средств. 12 з.п.ф-лы, 2 табл.

Настоящее изобретение относится к продуктам, содержащим гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Granulocyte Colony Stimulating Factor = G-CSF) или его фармацевтически приемлемую соль и фактор, вызывающий некроз опухолевых клеток (Tumor Necrosis Factor = TNF), связывающий протеин (TNF-binding protein = TNF-BP) или его фармацевтически приемлемую соль в виде комбинированного препарата, в частности, при профилактике и/или лечении септического шока.

G-CSF представляет собой основной фактор в дифференциации и созревании гранулоцитов [Metcalf, D., Blood 67, 257-264 (1986)]. Как было продемонстрировано, лечение с помощью G- CSF приводит к быстрому улучшению иммунного статуса как у подопытных животных с вызванной нейтропенией [Cohen A.M. et al. , Proc. Nail. Acad. Sci. USA 84, 2484-2488 (1987)], так и у пациентов с нейтропенией [Gabrilove, J.L. et al., N. Enol.J.Med. 318, 1414- 1422 (1988)] . Наряду с этим, G-CSF подтвердил способность к уменьшению влияния лихорадочных приступов и нозокомиально приобретенных инфекций у пациентов с нейтропенией и у раковых пациентов, подвергающихся цитостатической химиотерапии [Crawford, J. et al., N.Engl.J.Med. 325, 164-170 (1991)]. Однако, действие G-CSF на нейтрофилы не ограничено дифференциацией и пролиферацией. Совершенно очевидно, что он играет также важную роль в регуляции функций у зрелых лейкоцитов [Lopez, A.F. et al., J.Immunol. 131, 2983 (1983)].

Недавно обнаружено, что G-CSF снижает летальность при вызванном липополисахаридом (LPS) септическом шоке у животных [Gorgen, I. et al., J.Immunol. 149, 918-924 (1992)]. Это также известно в отношении растворимых фрагментов TNF-рецептора (TNF-receptor = TNFR) или химерных полипептидов, содержащих такие растворимые фрагменты [Lesslauer, W. et al., Eur. J.Immunol. 21, 2883-2886 (1991)]. Подопытные животные с LPS-вызванным шоком широко использовались для идентификации соединений, которые могли бы иметь потенциальную способность при профилактике и лечении шоков у людей. Однако, представляется, что подопытные животные по вызванным инфекцией шокам более соотносятся с клинической ситуацией, чем подопытные животные с LPS-вызванным шоком [Zanetti, G. et al., J.Immunol. 148, 1890-1897 (1992)]. В соответствии с этим, G-CSF и такой химерный полипептид были исследованы на подопытном животном, у которого факт шока выявлялся распространением перитонита от Escherichia coli. В то время, как G-CSF и вышеупомянутый химерный полипептид в отдельности не демонстрировали значительного увеличения коэффициента выживаемости, было обнаружено, что, когда G-CSF и химерный полипептид вводили вместе в одном и том же состоянии подопытным животным, было видно заметное улучшение защиты. В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является приготовление продуктов, содержащих G-CSF или его фармацевтически приемлемую соль и TNF-BP или его фармацевтически приемлемую соль в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при профилактике и/или лечении септического шока.

Термин G-CSF в контексте настоящего описания и в формуле изобретения используется в его самом широком смысле с точки зрения биологической активности, понимаемой специалистом в данной области, и включает в себя полипептиды (естественного или включающего синтетические элементы рекомбинантного происхождения, модифицированные или нет), как определено и описано (включая их приготовление и применение) в научной литературе, например, в любой из нижеприведенных патентных публикаций: DE 3027105, ЕР 169566, ЕР 215126, ЕР 237545, ЕР 396158, ЕР 220520, ЕР 217404, ЕР 230980, ЕР 231819, DE 3723781, ЕР 263490, ЕР 344796, ЕР 355811, ЕР 373679, ЕР 401384, ЕР 456812, ЕР 459630, ЕР 459516, ЕР 459795, ЕР 243153, ЕР 272703, ЕР 331186, ЕР 335423, WO 93/15211. G-CSF, как он описан в ЕР 237545 [G-CSF широкого спектра действия на человека (hpG-CSF)], т.е. предпочтительной является рекомбинантная молекула, возможно, содержащая метиониновый остаток в ее N- окончании. Наиболее предпочтительным является G-CSF, имеющий особую аминокислотную последовательность и который закодирован ДНК-последовательностями, приведенными в ЕР 237545.

Иными словами, термин G-CSF в дополнение к G-CSF естественного происхождения содержит любой G-CSF, кодированный ДНК-последовательностью, которая после экспрессии в прокариотной или эукариотной клетке хозяина приводит к получению полипептидного продукта, имеющего по крайней мере часть первичной структуры и одно или несколько биологических свойств естественно встречающегося hpG-CSF, как это определено в ЕР 237545, при этом указанную последовательность ДНК выбирают среди: (а) последовательности ДНК, приведенной в Таблице VII ЕР 237545, или ее комплементарной цепи; (б) последовательностей ДНК, которые гибридизируют при любых подходящих условиях гибридизации, например, как представлено в ЕР 237545 или описано в "Molecular Cloning", Sambrook et al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, и (в) последовательностей ДНК, которые, если бы не вырожденность генетического кода, гибридизировали с последовательностями ДНК, определенными в (а) или (б), и эти последовательности кодируют полипептид, имеющий те же самые аминокислотные последовательности.

Последовательности ДНК, которые гибридизируют с вышеуказанными последовательностями, так называемыми мутантными ДНК-последовательностями, могут быть получены с помощью неспецифического или сайтнаправленного мутагенеза или с помощью химического синтеза или с помощью технологии полимеразно-цепьевой реакции (polymerase chain reaction = PCR) с использованием праймеров, определяемых на основе ДНК-последовательностей, приведенных в ЕР 237545, с помощью методов, известных в данной области и описанных, например, Sambrook et al. (см. выше), или в отношении PCR-технологии авторами Innis et al. [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. (1990)] . Таким образом, используя мутантные ДНК-последовательности, могут быть получены известными в данной области методами мутантные G- CSF, которые охватываются термином "G-CSF", описанные, например, в вышеуказанных патентных публикациях. Мутантные G-CSF охарактеризованы и их препараты описаны, в частности, в ЕР 243153, WO 90/12874, WO 89/05824, ЕР 272703 или ЕР 456200.

Как указано выше, термин G-CSF включает в себя G-CSF естественного или рекомбинантного происхождения, также в измененной форме, например, когда он связан с химическими структурными единицами, которые без изменения базовой биологической активности G-CSF модифицируют ее целесообразным в терапевтическом отношении путем. Предпочтительная и хорошо известная модификация полипептидов, таких как G-CSF, представляет собой связывание с водорастворимыми полимерами, например, полиэтиленгликолями или полипропиленгликолями, в рамках широких пределов молекулярного веса, например, от 500 до 20000 дальтон. Это приводит к получению защищенных G-CSF, например, полиэтиленгликолем, которые могут быть практически неиммуногенными. Из уровня техники известно несколько вариантов связывания полимера с G-CSF через разные линкеры, которые описаны в общем, например, в "Perspectives in Bioconjugate Chemistry", edt. by C. F.Meares, American Chemical Society, Washington 1993, и в частности, например, в патенте США N 4179337. Модифицированные G-CSF и их приготовление описаны, например, в ЕР 401384, ЕР 335423 и ЕР 473268. Модифицированный G-CSF также включает в себя, например, G-CSF, который демонстрирует иной рисунок гликозилирования, как известно, для естественно встречающегося или рекомбинантного G-CSF в виде по крайней мере одной дополнительной поликарбогидратной цепи, как описано, например, в ЕР 370205.

Термин TNF-связывающий протеин (TNF-BP) включает в себя любой протеин или фрагмент протеина, состоящий из достаточного количества аминокислот, чтобы могла быть образована структура, которая способствует связыванию TNF человека независимо от того, откуда или как он был получен. Такой TNF-BP может представлять собой, например, антитело к TNF как моноклональное антитело, но также и любой тип химерного антитела к TNF человека, как описано, например, в WO 91/02078. Такое химерное антитело представляет собой антитело, в котором различные части молекулы имеют различного типа происхождение, в частности, от человека и животного, например, мыши, крысы или кролика. В предпочтительном варианте осуществления в таких антителах только комплементарные определяющие участки имеют происхождение не от человека, и при желании дополнительные аминокислоты в вариабельных областях. Они могут быть приготовлены в соответствии с методами, известными в данной области, и как описано, например, в ЕР 239400 или в WO 90/07861.

TNF-BP, как он определен выше, может также представлять собой любой встречающийся в природе или полученный рекомбинантным путем TNF-рецептор или его часть, предпочтительно протеин, который содержит часть р55- или p75-TNFR человека или является производным от нее, причем эта часть еще связывает TNF, как, например, растворимую часть этих рецепторов или, например, так называемых химерных полипептидов, которые содержат растворимую часть этих рецепторов и все или части константных областей, но по крайней мере одну константную область, из тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека. Предпочтительны такие химерные полипептиды, в которых TNF-связывающая часть является частью p55-TNFR человека или производна от него. Кроме того, такие химерные полипептиды являются предпочтительными, в которых иммуноглобулиновая часть содержит все области, за исключением первой области константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, такого как IgG, IgA, IgM или IgE, в частности, IgG, например, IgG1 или IgG3.

Специалист в данной области очень хорошо осознает тот факт, что любая аминокислота из иммуноглобулиновой части или из TNF- связывающей части может быть удалена или замещена одной или несколькими аминокислотами, или же одна или несколько аминокислот могут быть добавлены, пока TNF-связывающая часть еще связывает TNF, и часть иммуноглобулина показывает одно или несколько ее характерных свойств. Это справедливо и для TNF-BP, как описано выше, без иммуноглобулиновой части. Протеины TNF-BP, их выделение из природных источников или их получение рекомбинантными методами, включая приготовление специфических конструкций, как, например, в форме химерных полипептидов, содержащих в дополнение к TNF- связывающей части и иммуноглобулиновую часть, описаны, например, в следующих патентных публикациях: ЕР 308378, ЕР 422339, GB 2218101, ЕР 393438, WO 90/13575, ЕР 398327, ЕР 412486, WO 91/03553, ЕР 418014, JP 127800/1991, ЕР 433900, US 5136021, GB 2246569, ЕР 464533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, ЕР 512528, ЕР 526905, WO 93/07863, ЕР 568928, WO 93/21946, WO 93/19777 и ЕР 417563.

Особенно предпочтительными являются TNF-связывающие протеины в форме рекомбинантных растворимых частей TNFR человека, в частности, р55-TNFR, который еще связывает TNF, или химерные полипептиды, содержащие такие растворимые части и иммуноглобулиновые части, как определено выше и как описано в ЕР 417563. Специалист в данной области поймет, что определение TNF-BP согласно настоящему изобретению также будет включать в себя такие TNF-BP, которые были модифицированы химическим путем так, как описано выше в отношении G-CSF, например, путем связывания с водорастворимым полимером, например, полиэтиленгликолем или полипропиленгликолем, по методу, описанному в уровне техники, например, в WO 92/16221.

Кроме того, целью настоящего изобретения является приготовление вышеуказанных продуктов, в которых G-CSF и/или TNF-BP представлены/представлен в форме фармацевтически приемлемой (ых) соли (ей). Применительно к данному описанию термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к обеим солям продуктов по настоящему изобретению. Такие соли карбоксильной группы могут быть образованы с помощью средств, известных в данной области, и включать неорганические соли, например, натриевые, кальциевые соли, соли аммония, соли трехвалентного железа или цинка, и тому подобное, и соли с органическими основаниями, как соли, образуемые, например, с аминами, как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. Соли присоединения кислоты включают, например, соли с минеральными кислотами, как соляная кислота или серная кислота, и соли с органической кислотой или серной кислотой, и соли с органическими кислотами, как, уксусная кислота и щавелевая кислота.

Другими целями настоящего изобретения являются применение G-CSF или его фармацевтически приемлемой соли при приготовлении лекарственного средства, в частности, для профилактики и/или лечения септического шока пациентов, принимающих TNF-BP или его фармацевтически приемлемую соль, как определено выше, а также применение TNF-связывающего протеина или его фармацевтически приемлемой соли, как определено выше, при приготовлении лекарственного средства, в частности, для лечения и/или профилактики септического шока у пациентов, принимающих G-CSF или его фармацевтически приемлемую соль.

Кроме того, предметом настоящего изобретения также является способ лечения септического шока, включающий в себя введение как TNF-BP или его фармацевтически активной соли, так и G-CSF или его фармацевтически активной соли.

Продукты, содержащие G-CSF и TNF-BP, представлены в форме комбинации, предпочтительно в виде "набора из частей", содержащего эти активные ингредиенты в отдельных упаковках, предназначенных для одновременного, раздельного или последовательного введения, в особенности при профилактике и/или лечении септического шока. Это означает, что пациенту вводят G-CSF и TNF-BP по отдельности в одно и то же время (одновременно) или вводят раздельно последовательным образом с синергическим эффектом. Однако, эта комбинация включает в себя также такие комбинации, в которых G-CSF и TNF-BP представлены в виде смеси в одной и той же упаковке.

При профилактике и/или лечении септического шока с помощью вышеуказанного способа G-CSF может быть введен пациенту любым известным методом в данной области техники, например, внутримышечно, внутривенно, подкожно, например, с помощью подкожного имплантата, как описано, например, в ЕР 246322, перорально в виде специальной пероральной дозировки, как описано, например, в ЕР 459516 и ЕР 459795, перназально, как описано, например, в ЕР 565722, или введением в легкие, как описано, например, в ЕР 505123.

G-CSF может быть составлен в виде подходящей дозировки согласно конкретному выбранному методу введения. Когда G-CSF получают в виде G-CSF-содержащего раствора с помощью любых известных методик, его предпочтительно держат в растворе при температуре примерно 4^oC, но, в зависимости от типа полученного G-CSF, его также можно хранить в замороженном состоянии. В качестве альтернативы этот раствор может храниться в леофилизованном виде после его дегидратации путем лиофильной сушки или вакуумной сушки, как описано, например, для ПЭГ-G-CSF в ЕР 335423. При желании G-CSF может храниться в соответствующем буфере с последующей асептической фильтрацией через микропористый фильтр или любое другое соответствующее средство с тем, чтобы приготовить пригодный для инъецирования препарат.

С целью составления формы дозировки, которая пригодна для введения пациенту определенным методом, подлежащий применению по способу лечения согласно настоящему изобретению G-CSF, может содержать соответствующие добавки, выбранные из известных фармацевтических носителей, наполнителей, разбавителей, стабилизаторов, например, в форме протеинов, как сывороточный альбумин человека, противоадсорбционные вещества, консерванты, солюбилизаторы и эмульгаторы, как они описаны, например, в DE 3723781, или представлен в виде стабилизированного гидрофобного состава, как описано, например, в ЕР 373679, или в форме препарата в виде частиц с замедленным высвобождением, как описано, например, в ЕР 263490 или ЕР 58481, или, в отношении защищенного полиэтиленгликолем G-CSF, как описано, например, в ЕП 473268.

Уровень дозировки и частота введения G-CSF могут быть соответствующим образом определены с учетом различных факторов, как серьезность шокового состояния, подвергаемого лечению, веса тела, возраста и пола пациента и метода введения. Обычно может вводиться дозировка, содержащая примерно 10-2000 мкг/кг, предпочтительно примерно 50-1500 мкг/кг, наиболее предпочтительно примерно 10-250 мкг G-CSF/кг веса тела.

TNF-BP по настоящему изобретению предпочтительно вводят парентерально инъецированием, хотя также возможны другие эффективные формы введения, как интраартикулярная инъекция, составы перорального действия, трансдермальный ионтофорез или суппозитории. Одним предпочтительным носителем является физиологический солевой раствор, но полагают, что также могут быть использованы другие фармацевтически приемлемые носители. Первичный растворитель в таком носителе может быть водным или неводной природы. В дополнение к этому, этот носитель может содержать другие фармацевтически приемлемые наполнители для изменения или поддерживания pH, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, стерильности, стабильности, скорости растворения или запаха этого состава. Подобным же образом этот носитель может содержать еще другие фармацевтически приемлемые наполнители для изменения или поддерживания стабильности, скорости растворения, высвобождения или поглощения ингибитора TNF. Такие наполнители - это те вещества, которые обычно и привычно используются для состава дозировок для парентерального введения в виде единичной дозы или в многодозовой форме.

Как только приготовлен лечебный состав, его можно хранить в стерильных сосудах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизованного порошка. Такие составы могут храниться либо в готовой к употреблению форме, либо в форме, требующей восстановления сразу же перед употреблением. Предпочтительное хранение таких составов будет при температурах не выше 4^oC и предпочтительно при -70^oC. Также целесообразно, чтобы такие составы, содержащие TNF-BP, хранились и употреблялись при физиологической величине pH или близкой к ней.

В некоторых вариантах осуществления изобретения введение служит для получения предварительно выбранного диапазона концентрации TNF-BP в потоке крови пациента. Полагают, что поддержание концентраций циркуляции TNF-BP выше 0,01 нг на мл плазмы необходимо для его эффективности.

Возможный диапазон дозировки для лечения септического шока может находиться в пределах примерно от 0,1 до 200 мг на кг веса тела пациента за 24 часа, вводимых равными дозами в пределах примерно от 4 до 15 раз за 24 часа. Частота дозировки и оптимальная доза будут зависеть от фармакокинетических параметров TNF-BP в используемом составе.

Лечение септического шока должно начинаться при любом режиме лечения, как можно скорее после того, как произошла септицемия, или после диагноза о возможной септицемии. Например, лечение может начаться немедленно после хирургической операции, или несчастного случая, или любого другого случая, когда имеется опасность септического шока.

Независимо от метода введения конкретную дозу рассчитывают в соответствии с примерным весом тела пациента. Дальнейшее уточнение расчетов, требуемых для определения соответствующей дозировки для лечения с использованием каждого из вышеуказанных составов, производится обычным способом специалистом в данной области техники.

Пример Септический шок, вызванный общим перитонитом от E.coli Швейцарским мышам-альбиносам (Jbm MoRo, вес 16-20 г) вводили инъецированием водный раствор G-CSF (Neupogen, Hoffmann-La Roche, Basle, CH; 0,1 мг/кг подкожно) и/или TNFR/IgG3 (TNF-BP, как описан в ЕР 417563, состоящий из первых 182 аминокислот p55-TNFR человека, слитого с шарнирной областью тяжелой цепи IgG3 человека и экспрессированного в клетках миеломы мыши J558L; 2,5 мг/кг внутрибрюшинно), как указано в таблице 1. Перитонит был вызван внутрибрюшинной инъекцией 10⁶ КОЕ (колониеобразующих единиц) (colony-forming units = CFUs) культуры E.coli 25922, оставленной на всю ночь, что составляет примерно 500-кратное число организмов, требуемых для того, чтобы убить 50% животных, которым не введены лекарственные средства, в течение 72 часов. Контрольная и подвергавшаяся лечению группы состояли из 5-10 мышей каждая. Развитие общей инфекции прекращали у всех животных введением ceftriaxone (Hoffmann- La Roche, Basle, CH; 1 мг/кг подкожно) через 3,8 часа после введения бактерий. Это привело к бактериальному очищению тока крови, но было слишком поздно для того, чтобы предупредить летальный септический шок у > 80% незащищенных животных. Выжившие мыши получали дополнительное лечение с помощью цефтриаксона (ceftriaxone) через 24 часа после заражения. Животные, которые были серьезно больны и были не способны есть и пить через 21 час или дольше после введения, умерщвлялись и регистрировались как неблагоприятные исходы при терапии. Для контроля забирали кровь из сердца от по крайней мере одной умершей или умерщвленной мыши в подвергаемых лечению группах и в контрольной группе и культивировали на агаре. Обобщенные данные нескольких экспериментов, проведенных с G-CSF и конкретным упомянутым TNF-BP, представлены в таблице 1.

При использовании в качестве единственного соединения G-CSF приводил к 20%-ной величине выживаемости, а конкретный TNF-BP приводил к величине выживаемости в 22 %. Эти различия по отношению к контрольной группе с солевым раствором с величиной выживаемости 10% не очень значительны. Заметное улучшение в защите было достигнуто при комбинировании G-CSF и конкретного TNF-BP. Все мыши выживали, когда G-CSF дали трижды, т.е. за 48 часов, 24 часа и за 2 часа до заражения, в схеме приема в комбинированном виде. Все эти животные проявляли видимые признаки начала септического шока через 3 часа после заражения, как у контрольных животных. Однако, они не умерли и начинали приходить в себя примерно через 24 часа после заражения. Когда при комбинированной схеме введения пропускали последнюю дозу G-CSF за 2 ч до заражения, степень защиты снижалась до 65%. Подсчитанное количество жизнеспособных бактерий через 3,8 часа после заражения, когда септицемию останавливали введением цефтриаксона, было только незначительно меньше в группе G-CSF плюс конкретный TNF-BP, чем в группе с солевым раствором (2,6 х 10⁸ КОЕ/мл против 3,5 х 10⁸ КОЕ/мл, соответственно). Содержание эндотоксина в G-CSF (25 мкг/мл) и TNFR/IgG3 (250 мкг/мл) было определено в ходе лимулюс-теста с лизатом амебоцитов (чувствительностью: 0,06 эндотоксиновых единиц/мл) (EU/ml), как известно в данной области техники, оно составило < 0,05 эндотоксиновых единиц/мл. В соответствии с этим десенсибилизация против липополисахаридов (LPS) может быть исключена. Зависимость по дозе G-CSF при шоке, вызванном E.coli у швейцарских мышей-альбиносов, приведены в таблице 2 (G-CSF вводили в меняющихся дозах, как указано, за 48 часов, 24 часа и 2 часа до заражения, 50 мкг TNFR/IgG3/мышь вводили за 2 часа до заражения).

Формула изобретения

1. Продукт, содержащий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G - CSF) или его фармацевтически приемлемую соль и протеин, связывающий фактор некроза опухоли (TNF-связывающий протеин), или его фармацевтически приемлемую соль, а при необходимости, фармацевтически приемлемый носитель.

2. Продукт по п.1 для одновременного, раздельного или последовательного использования при лечении и/или профилактике септического шока.

3. Продукт по п. 1 или 2, в котором TNF-связывающий протеин содержит TNF-рецептор или его часть, которая еще связывает TNF.

4. Продукт по любому из пп.1 - 3, в которых TNF-связывающий протеин содержит часть р55- или р75-TNF-рецептора, причем эта часть все еще связывает TNF.

5. Продукт по п.4, в котором TNF-связывающий протеин представляет собой растворимую часть р55- или р75-TNF-рецептора, растворимая часть которого еще связывает TNF.

6. Продукт по п.4, в котором TNF-связывающий протеин представляет собой химерный полипептид, который содержит растворимую часть р55- или р75-TNF-рецептора и все константные домены - или их части - тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека.

7. Продукт по п.6, в котором химерный полипептид содержит все домены, за исключением первого домена константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, такого, как IgG, IgA, IgM и IgE.

8. Продукт по п.7, в котором иммуноглобулин человека представляет собой JgG, в частности IgG1 или IgG₃.

9. Продукт по пп. 1 и 2, в которых TNF-связывающий протеин представляет собой антитело к TNF.

10. Продукт по любому из пп.1 - 9, в которых G - CSF представляет собой природный G - CSF или продукт его прокариотной или эукариотной экспрессии.

11. Продукт по п.10, в котором G - CSF представляет собой продукт прокариотной экспресии.

12. Продукт по п.10 или 11, в котором G - CSF модифицирован.

13. Продукт по п.12, в котором G-CSF полиэтиленгликолирован.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2