Способ отбора популяций или субпопуляций образца

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выделения желаемой и нежелаемой субпопуляций из образца исследуемой жидкости или получения обогащенной субпопуляции с одной или более удаленными из нее нежелаемыми субпопуляциями. Способ включает взаимодействие исследуемого образца с частицами с присоединенным к ним реагентом, специфически связывающимся с выбранной субпопуляцией. Причем в качестве частиц используют частицы, имеющие плотность, по крайней мере вдвое большую, чем средняя плотность клеток выбранной субпопуляции, и диаметр по крайней мере в 3 мкм. Перемешивают исследуемый образец с частицами для неоднократного оседания упомянутых частиц. После перемешивания обеспечивают возможность дифференциального оседания частиц и отделяют выбранную субпопуляцию. 2 с. и 33 з.п.ф-лы, 12 табл., 34 ил.

Изобретение относится в основном к разделению желаемой и нежелаемой популяций/ или субпопуляций из образца для получения желаемой популяции или субпопуляции в отдельности или обогащенной популяции или субпопуляции с одной или более удаленными оттуда нежелаемыми субпопуляциями. Более подробно, изобретение направлено на выделение желательной или нежелательной популяции или субпопуляции, такой как клетки из костного мозга или крови, путем связывания популяции или субпопуляции с относительно плотными частицами и использования гравитационной седиментации для выделения популяции или субпопуляции из оставшегося супернатанта образца.

Обогащение популяций или субпопуляций образца может применяться для множества типов применения. Например, удаление всех лимфомных B-клеток нелимфогранулематозного происхождения из костного мозга было бы желательным в случае B-клеточной лимфомы. Если предстоит очистить костный мозг от B-клеток и повторно ввести его пациенту, представляется важным, чтобы костный мозг был полностью очищен и чтобы костный мозг не был поврежден иным образом.

В настоящее время одним подходом является использование множества магнитных микробус, обычно сделанных из полимера, основанного на магнитном материале относительно низкой плотности. Желательно, чтобы микросферы были относительно низкой плотности, потому что микросферы смешиваются с костным мозгом или кровью и сконструированы особым образом так, чтобы не выпадать в осадок по типу гравитационной седиментации. Микросферы обычно имеют малые размеры, в основном около или меньше одного микрона в диаметре. Однако, в продукте, продаваемом Dynal, Inc. of Great Neck, N.Y., используются магнитные полимерные микросферы, имеющие номинальный диаметр от 2.8 до 4.5 микронов с низкой плотностью микросфер порядка 1.5 г/см³. Магнитные микросферы из предыдущих методик имеют тенденцию удерживаться в суспензии в образце и поэтому сконструированы для сильного замедления или значительного устранения оседания под действием силы тяжести в суспензии образца.

Магнитные микросферы имеют, по крайней мере, одно антитело, связанное с ними, специфичное к популяции или субпопуляции, которую нужно удалить. Зачастую, как в процессе с продуктом Dynal, одно моноклональное антитело связано с интересующими клетками, а второе антитело, специфичное к первому моноклональному антителу, связано с микросферами. Клетки обычно выделяют из цельной крови или костного мозга и затем отмывают перед присоединением к ним моноклональных антител, причем этап отмывания вызывает несущественную потерю клеток. Микробусы и клетки затем смешивают вместе для присоединения микробус к клеткам посредством первого и второго антител. Для очистки крови или костного мозга образец следует смешать с множеством микробус, связанных с антителами, и затем поместить в магнитное поле. Оставшийся образец, или супернатант, удаляют, тогда как микробусы удерживаются в магнитном поле. Обычно данную процедуру надо повторить, так как единичный этап очистки обычно не приводит к очищению от достаточного процента нежелательной популяции или субпопуляции(й). Целью очистки является удаление всей (100%) намеченной популяции или субпопуляции. Как правило, это неосуществимо, и образец очищают настолько близко к ста (100) процентам, насколько это возможно.

Процедура удаления с помощью магнитного поля представляет несколько трудностей. Процедура также неспецифически удаляет некоторое количество клеток из других популяций на каждом этапе удаления. Это снижает производительность, так как процент желаемой популяции сохраняется. Единичный этап удаления приводит к колеблющемуся выходу относительно низкого процента, причем каждый последующий этап также понижает выход. Далее, магнитные микробусы относительно дорогостоящи.

Метод магнитных микробус также использовали для обогащения субпопуляции для исследования субпопуляции. В данном случае, магнитные микробусы связываются с желаемой субпопуляцией, и микробусы с присоединенными к ним клетками удаляют из образца. Субпопуляция затем может быть непосредственно изучена или может быть отделена от микробус для исследования. Данная процедура занимает много времени, порядка от примерно одного (1) до шести (6) часов или больше и небесспорно ведет к нативной субпопуляции, так как субпопуляция имеет, по крайней мере, одно моноклональное антитело, связавшееся, по крайней мере, с одним типом клеточных антигенов.

Дальнейшим применением очистки является исследование/обогащение специфичной субпопуляции, такой как CD4-популяции лимфоцитов (Л). В данном случае, микробусы имеют присоединенные к ним моноклональные антитела, специфичные к одной или более не-CD4-популяциям. Удаление других популяций увеличивает количество CD4-клеток в общей оставшейся клеточной популяции в образце. Однако, когда применяются магнитные микробусы, неспецифическое удаление части CD4-субпопуляции может серьезно повлиять на оставшееся количество CD4-субпопуляции. Неспецифическое удаление клеток может стать еще большей проблемой, когда используется большой объем образца, такой как пять (5) мл и больше, поскольку тогда объем требует большого количества магнитных микробус. Когда магнитные микробусы помещают в магнитное поле, зачастую возникают неспецифические ловушки (trapping) и происходит удаление других нецелевых (non-targeted) клеток.

Другие способы положительного и отрицательного отбора, включая поверхности, меченные антителами, использовали для получения субпопуляций клеток из смеси различных клеточных типов. В данных способах обычно используется антитело, ковалентно присоединенное к поверхности пластика или к частицам полимера в колонке. Вообще, смешанную клеточную популяцию смешивают с присоединенным антителом, как внося их в колонку и оставляя их на инкубацию, так и давая им осесть на поверхность. Данные способы работают оптимально, когда красные кровяные клетки (RBC'S, ККК) и плазма были первоначально удалены из смешанной клеточной популяции путем получения лейкоцитной пленки или получения мононуклеаров в градиентах плотности, отмывания клеток и смешивания их с поверхностью, меченной антителами. В обоих способах также требуется получение разделительной системы и промывание буфером перед использованием, что в сумме с временем инкубации с антителом в течение от тридцати до шестидесяти (30-60) минут образует методику, которая занимает минимум три часа в случае колоночного и скляночного (flask) метода. Данные способы могут быть использованы как для отрицательного отбора, так и для положительного отбора интересующей клеточной популяции. В обоих способах прямой отбор приводит к высокообогащенной популяции с результирующей неспецифической утратой нецелевых клеток. Высвобожденные клетки могут иметь на клеточной поверхности антитела и зачастую активируются технологией отбора, что часто является нежелательным.

Способ и устройство, осуществляющие изобретение, могут применяться для множества иммунологических реакций, таких как иммунологические реакции с участием реагентов и клеток. Клетки характеризуются как животные или растительные клетки, включая клеточные бактерии, грибы, которые определяются отдельно или в агрегированном состоянии. Клетки представляют собой наименьшую структурную совокупность живой материи, способную функционировать как независимая единица. Например, клетки могут быть популяциями ККК и белых кровяных клеток (WBC, БКК) человека, раковыми и другими аномальными клетками ткани, костного мозга и/или из образцов крови. Обоснованно ожидать, что клетки с подходящей меткой или зондом будут испытывать такое же влияние метода и устройства по изобретению, как и клетка крови человека или образцы костного мозга.

Используемый здесь термин "реагент" характеризует разнообразные молекулы (y), такие как моноклональные или поликлональные антитела, которые распознают и реагируют с одной или более специфичными комплементарными молекулами(ой), такими как антигены, которые находятся на клеточной поверхности. Некоторые примеры приведены ниже: Реагент - Специфичная молекула Антитело - Антиген Лекарство - Рецептор к лекарству Гормон - Рецептор к гормону Фактор роста - Рецептор к фактору роста Лектин - Молекула углевода Последовательность нуклеиновой кислоты - Комплементарная последовательность нуклеиновой кислоты Фермент - Кофактор или ингибитор Реагенты соединяются или связываются со специфичной молекулой(ами) на клетках.

Было бы желательным иметь в распоряжении эффективный способ очистки или отбора одной или более субпопуляций без воздействия на популяции, оставшиеся в образце, таком как цельная кровь или костный мозг. Способ должен быть недорогим, быстрым, приводить к высокой производительности и не ограничиваться по объему обрабатываемого образца.

Изобретение предлагает способ и устройство для выделения желаемой или нежелаемой популяции или субпопуляции из жидкого биологического образца, такого как цельная кровь, быстро и с высоким выходом. Множество плотных, относительно тяжелых частиц с одним или более реагентами, такими как моноклональные или поликлональные антитела, присоединенными к ним, смешивают с образцом. Антитела, связанные с частицами, могут быть направлены на неинтересующие клетки. Частицам с присоединенными к ним клетками дают дифференциально осесть под действием силы тяжести, а затем оставшийся образец удаляют. Это увеличивает число остающихся в образце интересующих клеток, которые не были мишенями частиц. Антитела, связанные с частицами, могут быть также направлены на интересующие клетки. Остаток жидкого образца и нецелевые клетки затем могут быть удалены от частиц с присоединенными к ним клетками-мишенями и подвергнуты анализу, чтобы определить, сколько было удалено нецелевых клеток. Клетки-мишени также могут быть затем отделены от частиц для дальнейшего анализа. Интересным предпочтительным материалом частиц может быть никель. Никелевую частицу можно нагревать для стерилизации частицы где угодно. Если образец очищен и должен быть трансплантирован в организм человека, магнитное поле и процедура отмывания могут быть использованы для отделения ККК и дальнейшего убеждения в том, что все плотные частицы удалены из образца.

Фигура 1 представляет собой схематичную блок-схему первого осуществления метода отбора по настоящему изобретению;
Фигура 2 представляет собой концептуальное воплощение частицы с присоединенными к ней клетками-мишенями по настоящему изобретению;
Фигуры 3A-3E представляют собой виды спереди, сбоку и сзади сумкового смесителя (bag mixer) крови по настоящему изобретению;
Фигуры 4A и 4B соответственно представляют собой контрольную гистограмму цельной крови и обогащенную гранулоцитарную гистограмму, полученную в соответствии с настоящим изобретением;
Фигуры 5A и 5B соответственно представляют собой контрольную гистограмму цельной крови и обогащенную лимфоцитарную гистограмму, полученную в соответствии с настоящим изобретением;
Фигуры 6A - 6C представляют собой гистограммы, сравнивающие оседание под действием силы тяжести магнитных частиц Rhone - Poulenc и плотных частиц по настоящему изобретению;
Фигуры 7A и 7B соответственно представляют собой контрольную гистограмму цельной крови и гистограмму, очищенную от тромбоцитов/гранулоцитов, полученную в соответствии с настоящим изобретением;
Фигуры 8A - 8C соответственно представляют собой контрольную гистограмму цельной крови, гистограмму, очищенную от тромбоцитов, и гистограмму, очищенную от гранулоцитов, полученные в соответствии с настоящим изобретением;
Фигуры 9A - 9F представляют собой гистограммы, иллюстрирующие результаты оседания под действием силы тяжести по настоящему изобретению в сравнении с ускоренным осаждением по настоящему изобретению;
Фигуры 10A - 10F представляют собой гистограммы, иллюстрирующие результаты по варьирующему времени оседания под действием силы тяжести по настоящему изобретению; и
Фигуры 11A - 11C представляют собой гистограммы сравнения нагретых частиц с ненагретыми частицами по настоящему изобретению.

Способы осуществления изобретения
Теперь, ссылаясь на фигуру 1, первое осуществление способа отбора и устройства по настоящему изобретению обозначено в целом сноской под номером 10. Устройство для отбора включает жидкий образец 12, содержащий предварительно отобранную популяцию или субпопуляцию, которую предстоит по желанию обогатить или удалить. Популяция или субпопуляция может быть популяцией или субпопуляцией клеток, включая: клетки, находящиеся в костном мозге или крови, такие как тромбоциты, нейтрофилы (N's, Н), зозинофилы (E's, Э), моноциты (M's, М), лимфоциты (L's, Л), подгруппы лимфоцитов, незрелые клетки от стволовых клеток до зрелых лейкоцитов и больные клетки, такие как раковые клетки человека или животных.

Жидкий образец может быть биологической жидкостью, включая цельную кровь или ее часть, костный мозг, спинномозговую жидкость или мочу или другие жидкости, содержащие популяции или субпопуляции, такие как описаны выше.

Устройство для отбора 10 также включает в себя источник частиц 14. Частицы 14 включают в себя моноклональное или поликлональное антитело, присоединенное к ним, которое будет специфически связывать выбранные клетки. Антитела могут быть присоединены к частицам 14 непосредственно, как ковалентно, так и с помощью адсорбции, либо опосредованно с помощью второго антитела любым удовлетворяющим способом. Множество частиц 14 и, по крайней мере, часть образца 12 объединяются по соответствующим линиям 16 и 18 в смесительную установку 20. Объединенные часть образца и частицы 14 смешивают и затем дают дифференциально осесть под действием силы тяжести, что показано блоком 22. Образец 12 и частицы 14 перемешиваются для того, чтобы способствовать быстрому связыванию частиц с выбранными интересующими клетками. Перемешивание образца 12 и частиц 14 проводят для того, чтобы вызвать быстрый контакт частиц 14 с выбранными клетками в образце 12. Преимуществом плотных частиц 14 является то, что они будут дифференциально оседать под действием силы тяжести сквозь образец 12 после перемешивания без существенного захвата невыбранных и нецелевых клеток. Во время перемешивания другим преимуществом частиц 14 является то, что перемешивание проводят в целях неоднократного прохождения или оседания частиц 14 через образец для обеспечения связи клетка-частица без физического повреждения клеток частицами 14. Для малых объемов, порядка микролитров, перемешивание может быть быстрым, таким как посредством взбалтывания, описанное в U.S. Patent N 5238812, который включен здесь в качестве ссылки. Для больших объемов, порядка от 0,5 мл до литров, эффективным методом перемешивания является опрокидывание частиц 14 и образца 12 вверх дном.

Когда частицы 14 перемешали с образцом 12, частицам 14 дают осесть на дно емкости (не проиллюстрировано), далее оставшаяся жидкая часть и клетки образца могут быть разделены, что показано блоком 24. Частицы 14 имеют плотность, существенно большую, чем у популяций в образце 12, как целевых, так и нецелевых, чтобы частицы 14 и присоединенные к ним популяции-мишени дифференциально оседали через образец 12, оставляя несвязавшиеся/нецелевые популяции в суспензии. Например, если образец 12 является образцом крови, клетки крови обладают плотностью порядка 1.05 г/см³, таким образом, частицы 14 должны быть существенно плотнее клеток, по крайней мере, порядка от двух (2) до трех (3) раз плотнее, чем клетки. Оставшиеся в образце жидкость и клетки могут быть отделены для исследования там, где выбранные интересующие клетки были оставлены в жидкой части и обогащены и не связаны с частицами 14. Связанные частицы 14 и клетки также могут быть при желании выделены из оставшегося жидкого образца для отделения клеток от частиц 14 в целях исследования связавшихся клеток, где они являются интересующими клетками. Оставшиеся жидкость и клетки также могут быть повторно введены в живой организм, без частиц и клеток, присоединенных к ним, которые было желательно удалить из образца или жидкости.

Устройство 10 может быть автоматическим устройством, объединяющим образец 12 и частицы 14 и перемещающим их между установками, или может представлять собой способ, выполняемый вручную, как например, выполняемый оператором, помещающим опытную пробирку или сосуд в установки 20, 22 и 24, или может быть комбинацией данных двух способов. Также, тогда как этапы осаждения и разделения 22 и 24 могут предпочтительно выполняться с помощью одной лишь гравитационной седиментации, могут быть включены по желанию дополнительные этапы. Образец 12 и частицы 14 могут быть в течение короткого времени подвергнуты центрифугированию, что иллюстрирует блок 26, для ускорения этапа осаждения 22. Частицы 14 также могут состоять из магнитного материала. В случае магнитных частиц 14 магнит или магнитное поле, показанные блоком 28, могут быть приложены к дну емкости (не проиллюстрировано) для ускорения этапа осаждения 22. В дополнение, магнитное поле 28 может поддерживаться или прикладываться к дну емкости для того, чтобы гарантировать, что частицы 14 не удаляются на этапе разделения 24. Оставшийся образец может быть отделен и пропущен мимо или через магнитное поле 30 для того, чтобы гарантировать, что в жидком образце не осталось фрагментов частиц или частиц 14, как например, когда образец должен быть повторно введен в живой организм, такой как тело человека.

Теперь, ссылаясь на фигуру 2, на концептуальной диаграмме показана одна частица 14, имеющая два различных присоединенных к ней антитела A и B. В целях примера показана пара A-позитивных клеток 32, включающих, по крайней мере, один антиген A', который будет специфически связываться с одним присоединенным антителом A на частице 14. Также показана пара B-позитивных клеток 34, включающих, по крайней мере, один антиген B', который будет специфически связываться с одним присоединенным антителом B на частице 14. В действительности, особого порядка связывания клеток не будет, и, вообще. A- или B-позитивные клетки будут закрывать видимость частицы 14 (не проиллюстрировано). Также, антитела A и B на одной частице 14 связывают одну клетку, экспрессирующую и A'- и B'-антигены. Например, если клетка A является CD4-позитивной клеткой, а клетка B является CD3-позитивной, с частицей 14 будет связано четыре или пять клеток A и только одна или две клетки B. Несмотря на то, что два различных антитела A и B оба описываются как присоединенные к частице 14, каждое антитело может быть по желанию присоединено к отдельным частицам 14.

Опять же, как утверждалось ранее, целевые, или выбранные, клетки могут быть отделены от образца 12 связанными с частицами 14, а затем клетки могут быть отделены от частиц 14 для отдельного исследования клеток. Клетки могут быть отделены от частиц 14 по широко распространенной технологии, такой как биохимическое разделение или механические способы разрыва.

Хотя ни один отдельный тип частиц 14 не заслуживает критики, магнитная частица 14 высокой плотности является предпочтительной. Одна предпочтительная частица 14 изготовлена из карбонилникеля, такого как никелевые порошки, изготовленные IN CO под названием Никелевый порошок типа 123 (Nickel Powder Type 123). Частицы 14 преимущественно изготовлены номинального диаметра приблизительно пять (5) микронов в преимущественном интервале от трех (3) до тридцати пяти (35) микронов, но не ограниченном ими. Тонкодисперсные (fines) наименьшие частицы удаляют перед применением. Частицы 14 относительно тяжелы и имеют плотность преимущественно порядка девяти (9) г/см³. Плотность частиц выбирают так, чтобы частицы дифференциально оседали сквозь суспензию образца быстрее, чем клетки. Таким образом, клетки-мишени, связанные с частицами, будут разделены силой тяжести до сколько-нибудь существенной изоляции к оседанию несвязывающихся (нецелевых) клеток. Понятно, что чем больше различия по плотности между популяциями образца и частицами 14, тем быстрее будет происходить дифференциальное оседание.

Объемы жидкостей образца могут варьироваться в зависимости от выполняемой процедуры. Для анализа крови, костного мозга или спинномозговой жидкости может использоваться десять (10) микролитров, тогда как для клинических трансплантаций, как например, костного мозга, объемы могут колебаться от примерно ста (100) миллилитров до трех (3) литров. Манипуляции на костном мозге обычно представляют собой способы очистки для удаления нежелательных клеток из костномозговой жидкости. В случае цельной крови или костного мозга может применяться множество методик, таких как выделение стволовой клетки путем удаления других клеток крови с помощью связывания их с одним или более моноклональными антителами, присоединенными к одному или более набору частиц 14.

Одним предпочтительным способом перемешивания частиц 14 с образцом 12 является мягкое опрокидывание смеси частиц 14 и образца вверх дном, что вызывает неоднократное оседание частиц 14 сквозь образец 12 в целях связывания интересующей популяции. Данный способ оказывается предпочтительным, но общеизвестная шаровая мельница (roller rocking) или более силовые методы перемешивания также могут быть эффективны, если избежать физического повреждения интересующих клеток тяжелыми плотными частицами 14. Одним таким устройством может быть держатель опытных пробирок, который медленно вращается для переворачивания опытной пробирки или сходного сосуда вверх дном. Это дает возможность "мягкого перемешивания" частиц 14 и образца 12, при котором частицы 14 смешиваются и оседают сквозь существенную часть образца при каждом повороте, что позволяет клеткам-мишеням связаться с частицами без видимого физического повреждения клеток. Такое же вращательное движение может быть получено путем вращения или колебания пробирки взад и вперед, причем каждый конец является сначала верхом, а затем дном, подобно поворачиванию вверх дном. Скорость барабана шаровой мельницы (roller rocker) может быть установлена так, чтобы осуществлять, по существу, такую же процедуру перемешивания.

Одно воплощение сумкового переворачивающего вверх дном смесителя крови (blood bag end over end mixer) показано на фиг. 3A-3E и обозначено в целом сноской под номером 40. Кровяная сумка (blood bag) (не проиллюстрировано) вводится в смеситель 40 путем расцепления верхней 42 и нижней 44 частей держателя. Верхняя 42 и нижняя 44 части включают в себя защелкивающийся затвор (snap closure) 46, удерживающий части вместе. Верхняя и нижняя части 42, 44 также предпочтительно соединены друг с другом стержнем (hinge) 48.

Смеситель 40, хотя и изображен в горизонтальном положении на фиг. 3A и 3B, должен быть ориентирован, по существу, вертикально для обеспечения желаемого опрокидывания вверх дном жидкости образца 12 и частиц 14. Смеситель 40 может быть насажен на, по существу, горизонтальную ось шпинделя мотора (horizontal motor shaft axis) (не проиллюстрировано) с помощью кронштейна (bracket) 50 (фиг. 3E). Кронштейн 50 прикрепляется к одной части 44 смесителя 40.

Кронштейн 50 может быть прикреплен к части 44 посредством множества отверстий 52 (фиг. 3D), сделанных в части 44. Кронштейн 50 заключает в себе множество сопряженных коридоров (mating passageways) 54 (фиг. 3E), которые могут быть установлены на одну линию с отверстиями 52, и кронштейн 50 может быть затем установлен и закреплен множеством болтов и других крепежных изделий (не проиллюстрировано). Кронштейн 50 прикреплен с помощью коридора 56 к шпинделю двигателя (не проиллюстрировано) для того, чтобы вращаться с ним, с помощью одного или более коридоров с резьбой (threaded passageways) 58. Болт (не проиллюстрировано) может быть помещен на резьбе в коридор 58 напротив шпинделя мотора для вращения смесителя 40.

Как и пробирка с кровью, кровяная сумка в смесителе 40 вращается медленно, что вызывает смешивание и осаждение частиц сквозь существенную часть образца при каждом повороте для связывания клеток-мишеней в образце.

Один предпочтительный способ мечения частиц антителами, эффективными для выделения специфичных клеточных субпопуляций из смеси образца, то есть цельной крови, костного мозга, смешанных клеточных популяций или жидкостей тела, и благодаря плотности частиц для осаждения под действием силы тяжести и, таким образом, удаления специфично связанных клеток вместе с частицами, излагается ниже.

Материалы
Никелевые частицы - приобретенная у Hovamet Specialty Products Corp. (Wyckoff, N J 07481) партия Никелевого порошка типа 123 INCO (Suffern, NY 10901). Данную партию просеивали через 400 ячеек для удаления больших частиц и подвергали воздушной сепарации в качестве сырья. Из получившейся партии отсортировывали по Фишеру частицы по 5.7 микронов с площадью поверхности 0,34 м²/г частиц.

Буфер A - Трис/NaCl, pH 7.2
9.55 г/л Трис
4.0 г/л NaCl
смешать с дH₂O; довести до pH 7.2 конц. HCl
Буфер B - Трис/NaCl/БСА
Добавить к буферу A бычий сывороточный альбумин (БСА) 0,2 г/100 мл
Раствор антител - из таблицы 1 для мечения частиц определить количество антитела, которое необходимо будет добавить к частицам. Рассчитать объем исходного раствора антител, из которого получится необходимое количество требуемого очищенного антитела. Намерить количество исходного раствора и добавить его к буферу A перед внесением частиц.

Способы:
1. Отвесить никелевые частицы (из расчета 1 г частиц/ 0.34 м² площади поверхности).

2. Дважды промыть частицы дH₂O
2а. Добавить дH₂O к частицам и размешать путем взбалтывания и переворачивания пробирки.

2б. Отделить частицы от жидкости, дав им оседать в течение приблизительно двух минут и удалив жидкость.

3. Промыть частицы, как в стадии 2, используя 1% раствор хлорной извести.

4. Промыть частицы, как в стадии 2, буфером A.

5. Оптимально замаскировать никелевые частицы с помощью БСА.

5а. Ресуспендировать частицы до объема 2 мл/г частиц в буфере A.

5б. Добавить раствор БСА в количестве 50 мг/мл (разведение буфера B 1:4) для получения конечной концентрации 3 мг БСА/м² поверхности частиц.

5в. Разместить пробирку на барабане на 3-6 часов при комнатной температуре.

5г. Дважды промыть частицы, как в стадии 2, буфером A с 30-60-минутным пребыванием на барабане между промываниями.

6. Добавление антител к частицам:
6а. Ресуспендировать "замаскированные" бусы, стадия 5, до 1 мл/г бус.

6б. Обрабатывать гранулы ультразвуком во время добавления предварительно приготовленного раствора антител.

6в. Промыть пробирку, в которой изготавливали раствор антител, буфером A и смешать его с частицами.

6г. Довести объем до 1 мл/г буфером A.

7. Поместить пробирку на барабан (roller) и крутить раствор частицы/антитела в течение ночи при комнатной температуре.

8. Закрывание (blocking) меченых частиц с помощью БСА.

8а. Дважды промывать частицы буфером A, как в стадии 5 г.

8б. Добавить объем в 2 мл/г буфера Б к частицам.

8в. Ресуспендировать частицы с помощью ультразвука или взбалтывания.

8г. Крутить частицы в течение одного часа.

8д. Сменить буфер Б дважды с кручением в течение 30 минут между сменами.

9. Хранение меченых гранул.

9а. Удалить конечный закрывающий буфер Б.

9б. Добавить свежий буфер Б до объема 2 мл/г.

9в. Хранить гранулы, покрытые антителами, в пробирке с крышкой при комнатной температуре.

10. Тестирование препарата антитела/частицы.

10а. Добавить ступенчато изменяющиеся количества антител/частиц в опытные пробирки, обычно в пределах 10-200 мкл антител/частиц на мл цельной крови.

10б. Промыть антитела/частицы три раза 3-кратным объемом смеси Isoton II (Coulter Diagnostics) и глюкозы (4.5 г/л).

10в. Декантировать раствор IG и добавить 1 мл цельной крови (собранных или в ЭДТА, или в гепарин в качестве антикоагулянта).

10г. Перемешивать с помощью опрокидывания вверх дном в течение 4-5 минут.

10д. Разместить пробирки вертикально в держателе опытных пробирок в течение 4-5 минут.

10е. Перенести кровь, находящуюся над частицами, с помощью пипетки в другую пробирку (пипетка может удерживаться напротив магнита во время данного переноса для удаления никелевых частиц, которые могли не осесть во время стадии 10д).

10ж. Анализировать с помощью наилучшего метода, какие популяции были удалены, и сравнить оставшиеся клетки с исходными популяциями, присутствующими в исходном образце.

10з. Выбрать количество частиц, требуемое на мл цельной крови для того, чтобы эффективно выделить популяцию интересующих клеток.

Изобретение особенно приспособлено для связывания микробус с тромбоцитами и с популяциями БКК или с подгруппами популяций БКК. Как применяется здесь, подгруппы популяций БКК являются субпопуляциями популяций БКК, с которыми могут связываться специфические моноклональные антитела. Номенклатура для моноклональных антител была определена Всемирной Организацией Здравоохранения и Международным Иммунологическим Обществом. Моноклональные антитела определяются по номенклатуре кластерного обозначения (СД), которая определяет особую специфичность для клетки или группы клеток и моноклональные антитела, специфичные к данной C-группе. Лишь в целях примера CD-группы указываются в таблице 1 параллельно с маркерами антител по Coulter.

Пример 1.

Изготовление препарата популяции гранулоцитов из цельной крови
Часть образца цельной крови, собранной в ЭДТА, пропускали через прибор Coulter STKS (который удаляет ККК путем лизирования) в качестве контроля для дальнейших выделений, что показано на фиг. 4A. Контроль иллюстрирует образцы нормальных популяций БКК, используя параметры DC (объем Coulter) и рассеяние света (LS), включая популяции Л's60, M's 62, гранулоцитов (Н's 64 и Э's 66) и фракции осколков 68. Подходящее количество никелевых частиц, покрытых антителами и предварительно оттитрованных, помещали в стеклянную опытную пробирку 12х75 мм и промывали три раза с помощью оседания под действием силы тяжести раствором Isoton II (Coulter Corporation), содержащим 4,5 г/л глюкозы (буфер IG). Три миллилитра образца цельной крови добавляли к промытым частицам и пробирку закрывали. Затем пробирку помещали на опрокидывающий вверх дном барабан при приблизительно 30 об/мин. Этого оказалось достаточно, чтобы удерживать частицы в суспензии, позволяя частицам неоднократно опускаться сквозь кровь. Кровь и частицы смешивали на данном барабане в течение четырех минут. Вслед за перемешиванием пробирки перемещали и устанавливали вертикально в штатив для опытных пробирок на четыре минуты, чтобы обеспечить дифференциальное оседание под действием силы тяжести. Чтобы проанализировать оставшиеся популяции, кровь, находящуюся над частицами, переносили пипеткой в другую пробирку. В некоторых случаях резервуар пипетки может удерживаться напротив магнита, чтобы гарантировать удаление Ni тонкодисперсных частиц, которые могли не выпасть в осадок. Образцы пропускали через прибор Coulter STKS и сравнивали против цельной крови в качестве контроля. Одно описание операции такого рода описывается в U.S. Patent N 5125737, который включен здесь в качестве ссылки. Хотя частицы и цельную кровь смешивают и частицы присоединяются к популяции или подгруппе популяции, в любом случае, ККК удаляют с помощью лизирования до получения показанных результатов. Результаты по тромбоцитам и ККК, на которые ссылаются здесь, получены с применением только параметра объема Coulter (DC) в каналах прибора, отличных от канала БКК.

Часть образца цельной крови разделили с использованием следующих меченых никелевых частиц: MY4 200 мкл/мл, T4 100 мкл/мл, B1 100 мкл/мл. PLT-1 80 мкл/мл, T8 50 мкл/мл и 3A1 50 мкл/мл. Данная смесь связанных с антителами меченных частиц очищала от большинства М's 62', Л's60' и тромбоцитов для получения обогащенной популяции гранулоцитов (Н's64' и Э's66'), что показано на фиг. 4B. Очистка приводила к 86%-ному уменьшению количества тромбоцитов и очистке популяций М 62' и Л 60' в очищенном образце по сравнению с цельной кровью (фиг. 4A). Это приводило к получению клеточного препарата, состоящего на 98% из гранулоцитов 64' и 66', что составляло 91% от исходного числа гранулоцитов. ККК сохранялись на 91% от образца цельной крови в качестве контроля, что указывает на специфичность клеточной очистки.

Пример 2.

Изготовление препарата лимфоцитов с использованием никелевых частиц с распределением и сохранением лимфоцитов.

Препарат лимфоцитов получали, используя покрытые антителами никелевые частицы, как показано на фиг. 5A и 5B. Результаты по цельной крови в качестве контроля, обработанные на гематологическом анализаторе Coulter STKS, показаны на фиг. 5A. В нормальном образце получалось 27 процентов Л's 70, 9 процентов М's 72, 61 процент Н's 74 и 2 процента Э's 76. Комбинация необходимого количества Ni-частиц, предварительно меченных PLT-1 (70 мкл частиц/мл крови), KC-48 (50 мкл частиц/мл крови) и MY-4 (100 мкл частиц/мл крови) на 10 мл цельной крови помещали в полистиреновую опытную пробирку на 15 мл и три раза промывали буфером IG. Удаляли супернатант от последнего промывания и к частицам добавляли 10 мл цельной крови, которую собирали в ЭДТА. Частицы ресуспендировали в крови и помещали на опрокидывающий вверх дном барабан на четыре минуты. Вслед за перемешиванием пробирку помещали вертикально в штативе для опытных пробирок и оставляли на четыре минуты, чтобы дать частицам дифференциально осесть. После того, как частицы осели, очищенную кровь удаляют пластиковой пипеткой и помещают в новую пробирку. Во время переноса резервуар пипетки держали напротив магнита, который удалял любые никелевые мелкодисперсные частицы. Анализ препарата лимфоцитов на гематологическом анализаторе Coulter STKS (фиг. 5B) показал, что популяция лимфоцитов обогащена до 92 процентов. Сокращение других клеточных популяций по сравнению с цельной кровью (фиг. 5A) показало уменьшение количества тромбоцитов на 94% Н's 74' на 98%, М's 72' на 80%, Э's 76' на 95% и ККК на 1%. Это указывает на то, что получившийся очищенный образец состоял из Л's 70' с очень небольшим неспецифическим удалением (сохранность лимфоцитов более чем 99%).

Пример 3.

Регенерация клеток T8 из меченных антителами никелевых частиц после очистки цельной крови.

Никелевые частицы, меченые антителами к T8, первоначально использовались для очистки цельной крови от T8-лимфоцитов. T8-меченые никелевые частицы в субоптимальной дозе для очистки (15 мкл против 50 мкл/мл цельной крови) три раза промывали в буфере IG. Цельную кровь добавляли к частицам и помещали на барабан, опрокидывающий вверх дном, (end - over - end roller) на десять минут и устанавливали вертикально на пять минут. Очищенную кровь удаляли, и частицы и связавшиеся клетки дважды промывали путем ресуспендирования в объеме, равном половине исходного количества образца, буфером IG, слегка переворачивая и позволяя частицам выпасть в осадок. Вслед за промыванием осадок частиц/клеток ресуспендировали в буфере IG и помещали на магнитную мешалку для механического разрыва в течение приблизительно тридцати секунд. Разрыв приводит к отделению клеток от частиц. Супернатант отделяли от частиц, давая частицам выпасть в осадок, удаляли с помощью пипетки и анализировали по методу проточной цитометрии. Проанализировали три образца, с контролем в виде цельной крови, кровь после очистки с помощью T8-меченных частиц и супернатант с клетками, высвобожденными после того, как частицы/клетки были размешены и частицам дали осесть. Результаты на Профиле П демонстрируют нормальный вид очищенной крови с небольшим, 16%-ным, сокращением популяции лимфоцитов. Регенерированные клетки, однако, показывают высокообогащенную и очищенную популяцию лимфоцитов. В последующем анализе с флюоресцентными поверхностными метками T4 и T8 в очищенной крови имелись T8-популяция, уменьшившаяся с 26% до 6,3% однако, T4-популяция увеличилась с 52,5% до 66.1% благодаря уменьшению количества T8-клеток. В регенированной популяции свыше 96% клеток являлись T8-позитивными.

Пример 4.

Мечение различных типов плотных частиц.

Стадия А: Различные типы плотных частиц, перечисленные в таблице 2, метили по настоящему методу антителами к T8.

Стандартную методику мечения никелевых частиц типа 123 использовали для различных типов частиц, что включало в себя закрывание с помощью 3-30 мг/м² антител к T8. Вслед за мечением и промыванием производили очистку цельной крови обычным способом с титрованием добавляемого количества меченых частиц. Вслед за перемешиванием крови и частиц в течение четырех минут частицам давали оседать в течение четырех минут. Получившиеся очищенные образцы затем анализировали на проточном цитометре (Coulter Profile П) на предмет процента T3-клеток. Очистку рассчитывали как продукт оставшихся T8-клеток к значению T8 цельной крови. Никелевая частица типа 123 представляет собой частицу, используемую для других экспериментов, и служила частицей сравнения для других типов частиц. Исходя из титрования, 25 мкл частиц типа 123 на мл цельной крови давали очистку T8-клеток свыше 96%. Частицы из нержавеющей стали не очищали даже при 100 мкл частиц/мл цельной крови. Цинковая пыль, меченная антителами к TB, вызывала коагуляцию цельной крови, возможно, благодаря взаимодействию с антикоагулянтом ЭДТА и вызыванию активации фибриногена путем высвобождения кальция в образце. Другие типы никелевых частиц приводили к очистке, но не так эффективно, как тип 123.

Стадия Б: Несколько различных типов частиц, меченных антителами к T4, но не прошедших этап предварительного покрытия БСА, исследовали на предмет мечения путем определения их способности к связыванию клеток. Все частицы связывают антитела, что определяется данным методом. Pd и VM63-Ni были одинаковы или несколько лучше в связывании клеток, чем тип 123-Ni, но оседали более медленно. Каждая из TiO₂, Pb и VM63-Ni были эффективны в мечении клеток для микроскопических исследований. Только для Ta была показана неэффективность в связывании клеток после мечения антителами.

Стадия В: Частицы метили антителами к KC-48, специфичными к нейтрофилам, с помощью стандартных методик для частиц типа 123-Ni. Частицы затем смешивали с цельной кровью, делали мазок крови и окрашивали и изучали, используя микроскоп. Все данные частицы демонстрировали специфическое связывание с нейтрофилами.

Вкратце, почти все из исследованных металлических частиц обеспечивали, по крайней мере, некоторую степень адсорбции антител. Однако, в контексте очистительной способности. Никель типа 123 был наиболее преимущественным благодаря свойствам его поверхности и скоростям оседания. В качестве примера, частицы из палладия и диоксида марганца будут хорошо очищать, но не смогут осесть достаточно быстро, чтобы являться эффективными по данному изобретению. Антитела, адсорбированные на частицы из диоксида титана, обеспечивают эффективное мечение клеток для микроскопического определения, но благодаря малым размерам (частиц) не дают значительного дифференциального оседания в цельной крови.

Пример 5
Очистка T4- и T8-субпопуляций цельной крови с использованием меченных антителами никелевых частиц.

Никелевые частицы метили антителами к T4 или к T8, используя методику, на которую ссылались выше, для мечения антителами. Для очистки частицы (50 мкл/мл цельной крови) переносили в опытную пробирку и три раза промывами буфером IG. Вслед за удалением третьего смыва к частицам прибавляли цельную кровь и комбинацию перемешивали путем опрокидывания вверх дном в течение четырех минут. Вслед за перемешиванием пробирки приводили в вертикальное положение и частицам давали оседать в течение четырех минут. Очищенную кровь затем метили флюоресцентными антителами T4-RD1/T8-ФИТЦ (Coulter Corporation, Coulter Cytostat, часть N 6603802) и анализировали на проточном цитометре (Coulter Profile 11). Все образцы обсчитывали в течение одной минуты, и популяции различных квадрантов сравнивали с T4- и T8-лимфоцитами. В сравнении с цельной кровью в качестве контроля, когда использовались T4-частицы, было очищено 94% T4-популяции, тогда как только 18% T8 было удалено. Когда использовались T8-частицы, было очищено 96% T8-популяции, тогда как только 4% T4-популяции было удалено.

Пример 6
Дифференциальное оседание.

Фиг. 6A-C иллюстрируют результаты дифференциального оседания плотных частиц по настоящему изобретению по сравнению с предшествующими в данной области магнитными частицами Rhone-Poulenc. Фиг. 6A опять же иллюстрирует контрольную гистограмму на STKS, включая образец нормальных популяций Л's 80, М's 82, Н's 84 и Э's 86. Фиг. 6B показывает диаграмму, получившуюся в результате очистки никелевыми частицами с использованием частиц с меткой в виде моноклонального антитела к KC48. Н's 84 составляли 59.6 процентов от результатов по контрольным популяциям БКК, показанных на фиг. 6A, тогда как Н's 84 уменьшились на 2.3 процента от популяций БКК, показанных на фиг. 6B.

Частицы Rhone-Poulenc c применялись таким же способом, что и никелевые частицы, и не проявляли фактически никакого оседания под действием силы тяжести, что показано гистограммой на фиг. 6C. В частности, связанные Н's и частицы Rhone-Poulenc показывают диаграмму 88, тогда как несвязавшиеся частицы Rhone-Poulenc выявляются как шум или диаграмма осколков 90. В публикациях Rhone-Poulenc утверждается, "что без магнитного поля существенная седиментация не имеет места в течение нескольких часов", что указывает опять на то, что данные частицы сконструированы для предотвращения оседания под действием силы тяжести.

Пример 7
Время перемешивания
Продолжительность и способы перемешивания могут варьироваться в соответствии с объемом образца и желаемым временем инкубации. Для объемов порядка 0,5 мл или меньше могут эффективно применяться без нанесения физического ущерба клеточным популяциям и быстрое перемешивание, такое как взбалтывание или встряхивание, и оседание плотных частиц при опрокидывании вверх дном. Взбалтывание совершали, применяя различные антитело-связанные частицы KC48-Никель (50 мкл/мл ЦК) и PLT-Никель (100 мкл/мл ЦК), с результатами, полученными на Coulter STKS и показанными в таблице 3. В таблице 3 и в каждой другой сходной таблице, такой как таблицы 5, 8 - 10 и 12, тромбоциты и БКК суммированы в единицах 10³/мкл, тогда как ККК представлены в единицах 10⁶/мкл.

В примере A имело место контрольное взбалтывание в течение тридцати (30) секунд без каких-либо частиц, пример B включал в себя частицы, взбалтывавшиеся в течение пятнадцати (15) секунд, и пример C включал в себя частицы, взбалтывавшиеся в течение тридцати (30) секунд, и осаждение в течение четырех (4) минут в каждом случае.

В заключение, очистка от нейтрофилов составляли пятьдесят (50) процентов, а от тромбоцитов - шестьдесят (60) процентов после пятнадцати (15) секунд взбалтывания, тогда как дополнительные пятнадцать (15) секунд повышали очистку от нейтрофилов до семидесяти пяти (75) процентов и от тромбоцитов до семидесяти пяти (75) процентов. Также было отмечено, что другие клеточные популяции сохранялись без неспецифических потерь.

Тот же образец крови перемешивали путем опрокидывания вверх дном в течение различного времени, что показано в таблице 4.

Результаты очистки, полученные по методике перемешивания из таблицы 4 показаны в таблице 5. Когда прибор STKS выдает результат 0.0 (Н's в таблице 5, F и G), действительный результат меньше 0.05, в целом, выше, чем 99 процентов.

Для данных частиц и антител минимальной продолжительностью перемешивания является четыре (4) минуты. Для других частиц и антител продолжительность перемешивания может колебаться в пределах настоящего изобретения. Понятно, что в некоторых случаях желательным может быть минимальное перемешивание в течение времени ниже минимального, что не приносит никакого ущерба настоящему изобретению.

Пример 8
Малые объемы образца
Малые объемы в 20 мкл цельной крови встряхивали с 5 мкл никелевых частиц KC 48 в течение четырех (4) минут. Результаты, указывающие на устранение 95 процентов H, были получены с помощью широко распространенного исследования мазка цельной крови, что показано в таблице 6.

Второй малый объем в 10 мкл встряхивали с 1 мкл KC 48 и 2 мкл PLT-1 в течение четырех (4) минут. Результатом, полученным на проточном цитометре Profile 11, явилась 82-процентная очистка от гранулоцитов.

Пример 9
Удаление гранулоцитов и/или тромбоцитов из препаратов образцов
Тромбоциты являются компонентом цельной крови и костного мозга, который удаляют различными способами во время получения клеточных суспензий. Характерные свойства тромбоцитов, которые делают их эффективными в заживлении ран, являются невыгодными для работы по получению клеточных препаратов, то есть агрегация тромбоцитов и неспецифическая адгезия к другим клеткам. Поскольку в цельной крови на лейкоцит приходится 20-50 тромбоцитов, удаление тромбоцитов перед любой работой по разделению увеличивает выходную способность лейкоцитов, приводит к более близкому к истине отражению лейкоцитарным профилем профиля цельной крови, снижает время изготовления препарата, поскольку наиболее обычный способ удаления тромбоцитов представляет собой три отдельных низкоскоростных центрифугирования после выделения клеточной суспензии. В препарате, который надлежит ввести пациенту, удаление тромбоцитов до замораживания уменьшит неспецифическую потерю клеток, которые нужно ввести, и удалит агрегаты тромбоцитов. В дополнение к этому, зрелые гранулоциты содержат гранулы, которые по высвобождении могут привести к шоку у пациента в результате инфузии. С помощью удаления и зрелых гранулоцитов и тромбоцитов клеточный препарат для инфузии, как немедленной, так и после замораживания, будет безопаснее и создавать меньше проблем для пациента.

Фиг. 7A иллюстрирует контрольную популяцию цельной крови, содержащую Л's 100, М's 102, Н's 104, Э's 106 и тромбоциты (не проиллюстрировано). Тромбоциты в контроле составляли 276·10³ тромбоцитов/мкл, тогда как гранулоциты (Н's и Э's) составляли 3,2·10³/мкл. Две группы плотных частиц объединяли и перемешивали с кровью в течение четырех минут и осаждали в течение четырех минут. Одна группа частиц включала в себя частицы, меченные PLT-1, в концентрации 80 мкл/мл, а вторая группа частиц включала в себя частицы, меченные KC48, в концентрации 50 мкл/мл. Как показано на Фиг. 7B, воздействие на Л's 100 и М's 102 было очень мало, тогда как Н's 104 и Э's 106 уменьшались приблизительно на 99.9 процентов. Количество тромбоцитов уменьшилось приблизительно до 2·10³/мкл.

Тромбоциты и гранулоциты также могут быть удалены по отдельности в отдельных частях образца крови. Фиг. 8A иллюстрирует контрольную популяцию цельной крови, содержащую Л's 110, М's 112, Н's 114, Э's 116 и тромбоциты (не проиллюстрировано). Фиг. 8B иллюстрирует часть образца после очистки от тромбоцитов вновь с применением плотных частиц, меченных PLT-1. Количество тромбоцитов снижалось с 231·10³ тромбоцитов/мкл в контрольной популяции цельной крови до 3·10³ тромбоцитов/мкл в очищенной части образца. Оставшиеся популяции Л's 110', М's 112', H's 114' и Э's 116' были относительно не затронуты.

Фиг. 8C иллюстрирует часть образца после очистки от H's 114 и Э's 116 с использованием плотных частиц, меченных KC 48 Н's 114'' и Э's 116'' сокращались, по существу, до нуля от общего количества Н's 114 и Э's 116 в 2.8·10³/мкл. Тромбоциты были относительно не затронуты.

Пример 10
Усиленное осаждение под действием силы тяжести
Фиг. 9A-9F иллюстрируют гистограммы оседания под действием силы тяжести по сравнению с коротким ускоренным осаждением с применением частиц по настоящему изобретению. Фиг. 9A-9D иллюстрируют препарат H, полученный с использованием частиц с метками, перечисленными в таблице 7.

Опять же, фиг. 9A иллюстрирует контрольную популяцию цельной крови из Л's 120, М's 122, Н's 124, Э's 126, тромбоцитов (не проиллюстрировано) и ККК (не проиллюстрировано).

Получение препарата Н с использованием меченых частиц из таблицы 7 дает обогащенную популяцию Н 124', где процентная доля Н в БКК возрастает с 59.7 процентов до 89.6 процентов. Количество Л's снижается с 32.1 процентов до 4.9 процентов, а количество М's снижается с 5.5 процентов до 0.8 процентов, что показано на фиг. 9B.

Фиг. 9C иллюстрирует контрольную популяцию цельной крови из Л's 130, М's 132, H's 134 и Э's 136. В данном примере, вместо оседания под действием силы тяжести часть образца и частицы центрифугировали на малой центрифуге, такой как Fisher Scientific Centrifuge Модели 59A, в течение 15 секунд в режиме N 2. При коротком центрифугировании или увеличенном улучшенном гравитационном оседании получали сходные результаты, как, например, оседание под действием силы тяжести в более короткий период времени, если это желательно. Процент Н возрастал с 59.5 процентов до 89.1 процента. Количество Л's снижалось с 31.5 процента до 5.7 процентов, тогда как количество М's снижалось с 5.8 процентов до 0.5 процента, что показано на фиг. 9D.

Каждая отдельная популяция может быть удалена с применением такой же процедуры, например, как изображено на фиг. 9E и 9F. Фиг. 9E иллюстрирует контрольную популяцию цельной крови из Л's 140, М's 142, Н's 144 и Э's 146. В данном примере, H'i 144 удаляют, используя усиленное гравитационное центрифугирование образца и частиц. Количество Н's уменьшается с 61.4 процентов в контроле до 0.7 процента, что показано с помощью 144' на фиг. 9F, тогда как оставшиеся популяции относительно не затрагиваются.

Первичные аспекты настоящего изобретения направлены на оседание под действием силы тяжести плотных частиц. Усиленное гравитационное осаждение, однако, может использоваться в случае клеток в системе градиентов плотности, такой как фиколл, причем в данном случае частицам требуется быть лишь слегка более плотными, чем клетки и система градиентов. С помощью усиленного гравитационного осаждения (центрифугирования) слегка более плотные частицы и клетки, присоединенные к ним, могут быть разделены в системе градиентов фиколла.

Пример 11
Время оседания
Фиг. 10A - 10F иллюстрируют гистограммы, содержащие различные результаты по времени оседания под действием силы тяжести по настоящему изобретению, которые суммированы в таблице 9.

Результаты таблицы 9 получили с помощью добавления порций по 3 мл того же образца популяции цельной крови в четыре отдельные пробирки или сосуда. Первая пробирка была контрольной, а в каждой из других трех пробирок находилось по 120 мкл добавленных в них KC 48-меченых частиц. Все четыре пробирки затем перемешивали, опрокидывая вверх дном, в течение четырех (4) минут и затем оставляли на оседание под действием силы тяжести в течение соответственно четырех (4) минут, двух (2) часов и трех (3) часов. Порцию образца, находящуюся над частицами, затем удаляли, перемешивали и анализировали. Контрольную порцию (фиг. 10A, 10C и 10E) затем сравнивали с соответствующими очищенными образцами (фиг. 10B, 10D и 10F). Как показано на фигурах и в таблице 9, популяции контрольной порции цельной крови фактически не изменялись в интервале от четырех (4) минут до трех (3) часов. Также, как было проиллюстрировано, очищенные порции для каждого времени оседания являются в значительной мере одинаковыми.

Что касается примера с оседанием в течение четырех (4) минут, Н's 150 (фиг. 10A) уменьшились с 42.9 процентов до 2.5 процентов Н's 150 (фиг. 10B). Подобно этому, пример с оседанием в течение двух (2) часов, H's 152 (фиг. 10C) уменьшились с 43.5 процентов до 1.1 процента Н's 152' (фиг. 10D). В примере с оседанием в течение трех (3) часов, Н's 154 (фиг. 10E) уменьшились с 42.7 процентов до 0.8 процента Н's 154' (фиг. 10F).

Пример 12.

Нагревание частиц
Фиг. 11A - 11C иллюстрируют сравнение ненагретых частиц типа 123 - Ni с нагретыми частицами типа 123 - Ni, что также изложено в таблице 10.

Опять же, результаты получили, используя KC 48-меченые частицы. Другие популяции были относительно не затронуты, тогда как результаты по ненагретым частицам (фиг. 11B) и нагретым частицам (фиг. 11C) были существенно сходными. До адсорбции антитела частицы нагревали до 250^oC в течение трех (3) часов для стерилизации (удаления микробов) и удаления эндотоксинов из частиц, особенно для использования там, где обработанный образец должен быть повторно введен пациенту. Нагревание частиц также понижает солюбилизацию ионов Ni из частиц посредством образования слоя оксида на поверхности частиц. Частицам давали оседать в течение четырех (4) минут после перемешивания в течение четырех (4) минут, как описано выше. Н's 156 (фиг. 11A) уменьшились с 61.8 процентов до 1.4 процентов Н's 156' (фиг. 11B) с применением ненагретых частиц и до 1.7 процентов Н's 156'' (фиг. 11C) с применением нагретых частиц. Вообще, частицы типа 123-Ni можно нагревать до пределов от 250^oC до 180^oC в течение от трех (3) до пяти (5) часов. Поскольку результаты по нагретым и ненагретым частицам были в значительной степени одинаковыми, другие примеры не повторялись и отражают использование ненагретых частиц.

Пример 13
Усовершенствованный клеточный препарат для трансплантации
Частицы по настоящему изобретению также могут использоваться для очистки от тромбоцитов в препарате (преп) костного мозга. Традиционные методы обработки костного мозга сравнивали с методиками по удалению частиц по настоящему изобретению, как показано в таблице 11.

Традиционный способ получения препарата костного мозга включает в себя разделение на фиколле с последующими ресуспендированием и промыванием собранных клеток-предшественников с помощью трех низкоскоростных центрифугирований для удаления тромбоцитов. Пример традиционной методики давал 29-процентное восстановление после оттаивания костного мозга, из которого 95 процентов было жизнеспособно, и восстанавливалось 56 процентов колониеобразующих единиц (КОЕ) (или клеток-предшественников). В противоположность этому, очистка частицами по настоящему изобретению, которая является намного более быстрой и менее сложной, приводила к 46-процентному восстановлению после оттаивания с 99-процентной жизнеспособностью и 71-процентным восстановлением КОЕ. Тромбоциты отделяли от костного мозга с помощью частиц до разделения на фиколле. Это устраняло традиционно медленные промывания центрифугированием, снижало количество агрегатов тромбоцит/клетка, что обеспечивало усиленное восстановление КОЕ. В примере, показанном в таблице 11, 30 мл костного мозга очищали, используя 600 мкл PLT-1-меченых никелевых частиц, перемешивали, опрокидывая вверх дном, и осаждали, причем каждую операцию выполняли в течение четырех (4) минут. Образец затем наслаивали на фиколл с последующим тридцати-(30)-минутным центрифугированием при 600g. Границу раздела фаз затем отбирали и концентрировали с помощью центрифугирования в Трис/NaCl + 0.5% БСА. Восстановленные клетки ресуспендировали в культуральной среде RPMI 1640 + 10% FCS (сыворотка плода коровы, СПК). Обработанный образец затем замораживали и оттаивали для сравнения с традиционной методикой.

В качестве дальнейшего обогащения КОЕ малую порцию (1.3 мл) первого очищенного от тромбоцитов образца костного мозга далее очищали, используя частицы, меченные 15 мкл частиц KC 48, 50 мкл частиц T11, 50 мкл частиц, меченных B1 и B4 и 50 мкл частиц, меченных MY 4 и MY 9. Это удаляло, по существу, все клетки с положительной дифференцировкой (зрелые) из костного мозга. С помощью очистки от зрелых клеток для анализа восстанавливали высокообогащенную популяцию стволовых клеток/клеток-предшественников (КОЕ). Показатель CFU-GM (КОЕ-ГМ) (гранулоцитарная, моноцитарная)/10 клеток, полученный для образца перед замораживанием с использованием традиционного препарата, составлял 143 CFU-GM, а с применением очистки от тромбоцитов с помощью частиц по настоящему изобретению составлял 147 CFU-GM, тогда как с применением дальнейшей очистки от дифференцированных клеток с помощью частиц по настоящему изобретению он составлял 620 CGU-GM.

Пример 14
Лиофилизированные частицы
Как показано в таблице 12, лиофилизированные частицы по настоящему изобретению также эффективны для очистки от Н's и Тр's. Две группы частиц, одна из которых мечена KC 48, а другая мечена PLT-1, объединяли для очистки от Н's и Тр's.

В заключение, оказывается, что лиофилизированные частицы столь же эффективны, как и нелиофилизированные частицы. Лиофилизированные частицы могут использоваться в наборах (китах) или для других целей, поскольку лиофилизированные частицы снимают требование о сохранении частиц в растворе.

В свете изложенных выше обучений возможно множество модификаций и вариаций настоящего изобретения.

Таким образом, следует понимать, что в пределах прилагаемой формулы изобретение может использоваться на практике иначе, чем это специфически описано.

Формула изобретения

1. Способ удаления выбранной клеточной субпопуляции из жидкого образца клеток крови или костного мозга, причем упомянутый образец включает в себя множество различных клеточных субпопуляций, упомянутый способ включает в себя обеспечение множества частиц, имеющих плотность, по крайней мере вдвое большую, чем средняя плотность клеток, и размер по крайней мере 3 мкм, причем упомянутые частицы имеют присоединенный к ним реагент, который связывается со специфичными клетками или с упомянутыми выбранными субпопуляциями; перемешивание упомянутых частиц с частью упомянутого жидкого образца в емкости для того, чтобы вызвать присоединение упомянутых частиц лишь к клеткам упомянутой выбранной субпопуляции, причем этап перемешивания проводят для того, чтобы вызвать неоднократное оседание упомянутых частиц благодаря силе тяжести через значительную часть упомянутого жидкого образца; по завершении этапа перемешивания обеспечение возможности упомянутым частицам и присоединенным к ним клеткам дифференциально осесть под действием силы тяжести так, чтобы пространственно отделить упомянутые частицы по отношению к несвязавшимся клеткам в упомянутом жидком образце, и отделение по крайней мере части несвязавшихся клеток от пространственно отделенных клеток и присоединенных к ним клеток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выбранные клеточные субпопуляции являются раковыми клетками, лейкоцитами, тромбоцитами, иммунокомпетентными клетками или специфически дифференцированными клетками.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутое перемешивание осуществляют путем вращения упомянутой емкости для того, чтобы вызвать опрокидывание упомянутого образца и упомянутых частиц вверх дном.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутые частицы образованы из никеля.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутые частицы имеют диаметр от приблизительно 3 до 35 мкм.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что частицы имеют диаметр приблизительно 5 мкм.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы имеют плотность, большую 2 г/см³.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что упомянутые частицы имеют плотность приблизительно 9 г/см³.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что упомянутые частицы имеют плотность, менее чем в три раза превышающую плотность клеток крови из упомянутой субпопуляции.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутый реагент включает в себя лекарство, гормон, фактор роста, лектин, фермент или последовательность нуклеиновой кислоты.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что реагент является антителом.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что упомянутое антитело специфично к тромбоцитам или белым клеткам крови.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутое перемешивание проводят в течение приблизительно от 15 с до 30 мин.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что упомянутое перемешивание проводят в течение приблизительно 4 мин.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что дифференциальное осаждение проводят в течение приблизительно от 15 с до 180 мин.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что упомянутый этап дифференциального осаждения проводят в течение приблизительно 4 мин.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый этап разделения включает в себя удаление по крайней мере части получившегося супернатанта упомянутой порции образца без упомянутых частиц и упомянутой присоединенной популяции или субпопуляции.

18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый этап разделения включает в себя выделение упомянутых частиц и последующее удаление упомянутой присоединенной популяции или субпопуляции от упомянутых частиц.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что упомянутыми присоединенными популяциями являются CD8-позитивные клетки.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутый реагент специфичен к моно-, лимфо- и тромбоцитарной субпопуляциям клеток крови, посредством чего гранулицитарная субпопуляция становится пространственно отделенной от моно-, лимфо- и тромбоцитарной субпопуляций.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутый реагент специфичен к моноцитарной, нейтрофильной, эозинофильной и тромбоцитарной субпопуляциям клеток крови, посредством чего лимфоцитарная субпопуляция становится пространственно отделенной от моноцитарной, нейтрофильной, эозинофильной и тромбоцитарной субпопуляций.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутый реагент специфичен к тромбоцитарной субпопуляции клеток крови, посредством чего лейкоцитарная субпопуляция клеток становится пространственно отделенной от субпопуляции тромбоцитов.

23. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутый реагент специфичен к нейтрофильной субпопуляции клеток крови.

24. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутый реагент специфичен, по существу, ко всем дифференцированным позитивным клеткам.

25. Способ по п. 1, отличающийся нагреванием упомянутых частиц перед присоединением к ним упомянутого реагента.

26. Способ по п.1, отличающийся лиофилизацией упомянутых частиц.

27. Устройство для удаления предварительно выбранной субпопуляции клеток крови из образца цельной крови, включающее в себя множество частиц, имеющих плотность, по крайней мере вдвое большую, чем плотность упомянутых клеток крови, и диаметр между приблизительно 3 и 35 мкм, причем упомянутые частицы имеют присоединенный к ним реагент, специфичный к данной предварительно выбранной клеточной субпопуляции, причем упомянутые частицы приспособлены для перемешивания с порцией упомянутого образца цельной крови для связывания упомянутых частиц с предварительно выбранной клеточной субпопуляцией и для того, чтобы стало возможным дифференциальное оседание связанных частиц и клеток в упомянутой порции образца по отношению к несвязавшимся клеткам.

28. Устройство по п.27, отличающееся тем, что упомянутые частицы содержат никель.

29. Устройство по п.27, отличающееся тем, что упомянутые частицы имеют плотность большую 2 г/см³.

30. Устройство по п.27, отличающееся тем, что упомянутые частицы изготовлены из никеля и имеют плотность приблизительно 9 г/см³.

31. Устройство по п.29, отличающееся тем, что упомянутые частицы имеют плотность, менее чем в три раза превышающую плотность клеток крови из упомянутой субпопуляции.

32. Устройство по п.27, отличающееся тем, что упомянутым реагентом является по крайней мере одно антитело, лекарство, фактор роста, лектин, фермент или последовательность нуклеиновой кислоты.

33. Устройство по п.27, отличающееся тем, что упомянутый реагент включает в себя антитело, специфичное к тромбоцитам и белым клеткам крови.

34. Устройство по п.27, отличающееся тем, что упомянутые частицы лиофилизированы.

35. Устройство по п.27, отличающееся тем, что упомянутые частицы содержат никель и имеют диаметр приблизительно 5 мкм.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 12.04.2005

Извещение опубликовано: 20.10.2006        БИ: 29/2006

---