Бензотиопираноиндазолы, фармацевтическая композиция на их основе и способ лечения опухоли

 

Описываются новые соединения - бензотиопираноиндазолы общей формулы I, где n равно 2 или 3; R означает водород, низший алкил, С(O)Н, С(O)R₃, SO₂R₃ и С(O)ОR₃, R₁ и R₂ каждый независимо означает водород или низший алкил; R₃ означает низший алкил и R₉ означает водород, низший алкил, низший алкоксил, или гидроксил, или любая фармацевтически приемлемая их соль присоединения кислоты, или сольват. Соединения обладают противоопухолевой активностью. Описываются также фармацевтические композиции, содержащие бензотиопираноиндазолы, и способы лечения опухолей и рака у млекопитающих с применением этих соединений. 7 с. и 6 з.п. ф-лы, табл. 2.

Изобретение относится к новым 2Н-[1]бензотиопирано[4,3,2-cd]индазолам, фармацевтическим составам на их основе, способам лечения опухолей при применении указанных соединений и способам лечения рака у млекопитающих при применении фармацевтических составов на основе бензопираноиндазолов.

Известный уровень техники Elslager и другие раскрывают в заявке на Европатент N 127369, опубликованной 5 декабря 1984 г., N,N-диэтил-5-метил-2Н-[1]бензотиопирано[4,3,2-сd] индазол-2-этанамин, который, как отмечают авторы, можно использовать в качестве противоопухолевого лекарственного вещества.

Beylin и другие раскрывают в заявке на Европатент N 264966, опубликованной 5 октября 1988 г., способ получения соединений формулы где X означает кислород, серу или селен; D и D' могут принимать одинаковые или разные значения и означают C₂-C₄ алкилен с прямой или разветвленной углеродной цепью; R₁ и R₂ могут принимать одинаковые или разные значения и означают водород или C₂-C₈ алкил, который может быть замещен гидроксильной группой; R₃, R₄, R₅ и R₆ могут принимать одинаковые или разные значения и означают водород или гидроксил, или любая фармацевтически приемлемая их соль.

Эти соединения, как отмечают авторы, обладают антибактериальной, противогрибковой и противоопухолевой активностью. Аналогичные соединения раскрывает также Beylin и другие в журнале J. Heterocyclic Chem., 1991, вып. 28, стр. 517 - 527.

Elslager и другие в патенте США 3505341, выданном 7 апреля 1970 г., раскрывает соединения формулы: где А означает C₂-C₄ алкилен;
Q означает атом водород или атом галогена;
R₁ и R₂ могут принимать одинаковые или разные значения и означают C₁-C₄ алкил или вместе с атомом азота образуют [-N(R₁)R₂], низший C₁-₈ алкилен, от 4 до 6 углеродных атомов которого связаны в кольце с атомом азота; и
W означает альдегидную группу -CHO, или метил или гидроксиметил. Эти соединения, как отмечают авторы, обладают антипаразитарной и антибактериальной активностью.

Elslager в патенте США N 3963740, выданном 15 июля 1976 г., раскрывает соединения формулы

где А означает C₂-C₄ алкилен.

R₁ и R₂ могут принимать одинаковые или разные значения и означают C₁-C₄ алкил или вместе с атомом азота образуют низший C₄-C₈ алкилен, от 4 до 6 углеродных атомов которого связаны в кольце с атомом азота; и
W означает метил, гидроксиметил или ацилоксиметил, где указанная ацильная часть содержит от 1-8 атомов углерода;
Y означает S или O; и
одно из значений радикалов Q и R означает водород, а другое выбирают из водорода и замещенной группы галогена или C₁-C₄ алкокси-.

В указанном патенте, в частности отмечается, что эти соединения являются промежуточными соединениями в синтезе соответствующего N-оксидного производного, которые можно использовать в качестве антипаразитарных лекарственных веществ. Elslager в патенте США N 4026899, выданном 31 мая 1977 г., описывает аналогичные соединения.

Blanz и French в журнале J. Wed Chem., 1963, вып. 6, стр. 185 - 191 раскрывают 5-метил-2Н-[1]бензотиопирано[4,3,2-сd]индазол (пример 39), которые прошли испытание, и, как установлено, не обладают противоопухолевой активностью. Showalter и другие в журнале J. Mad. Chem.,1988, вып. 31, стр.1527 - 1538 раскрывают синтез ряда замещенных 5-амино-2Н-[1]бензотиопирано[4,3,2-cd] индазолов и отмечают их противораковую активность. В частности, описаны N, N-диэтил-5-амино-2Н-[1] бензотиопирано[4,3,2-сd]индазол-2-этанамин, N,N-диэтил-5-амино-9-метокси-2Н-[1] бензотиопирано[4,3,2-сd]индазол-2-этанамин и N, N-диэтил-5-амино-9-гидрокси-2Н-[1] бeнзoтиoпиpaнo[4,3,2-cd]индaзoл-2-этaнaмин.

Bailly и Waring в журнале Biochemistry 1993, вып. 32, стр. 5985 - 5993 раскрывают соединения формулы:

где R₁ = Cl, а R₂ = CH₃; R₁ = Cl, а R₂ = CH₂OH; и R₁ = H; R₂ = CH₃; и R₁ = H, а R₂ = CH₂OH.

Отмечается также, что указанные соединения демонстрируют противоопухолевую активность.

Gordon и Chiang в журнале The Journal of Pharmacology и Experimental therapeutics 1986, вып. 236 (1), стр. 85 - 89 раскрывают N,N-диэтил-5-метил-8-хлоро-2Н-[1] бензотиопирано-[4,3,2-cd] индaзoл-2-этaнaмин и N,N-диэтил-5-гидроксиметил-8-хлор-2Н-[1]бензотиопирано-[4,3,2-cd]индaзoл-2-этaнaмин и результаты их проверки на антимускариновую активность.

Краткое изложение сущности изобретения
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются соединения формулы I:

где n равно 2 или 3;
R означает водород, низший алкил, С(O)H, С(O)R₃, SO₂R₃, и С(O)OR₃;
R₁ и R₂ каждый независимо означает водород или низший алкил; R₃ означает низший алкил; и
R₉ означает водород, низший алкил, низший алкоксил, или гидроксил; или любая фармацевтически приемлемая их соль присоединения кислоты, или сольват.

Предлагаемые соединения могут быть использованы для лечения новообразований и различных онкогенных болезней у млекопитающих.

Используемый в данном описании термин "низший алкил" означает углеводородные группы линейного, разветвленного и циклического строения, содержащие четыре или более атомов углерода.

Используемый в данном описании термин "низший алкокси-" означает линейные или разветвленные алкилокси-заместители, содержащие от одного до четырех атомов углерода, например, метокси-, этокси-, пропокси-, изопропокси-, бутокси-, вторбутокси, и тому подобные.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются составы для лечения опухолей и рака у млекопитающих, которые содержат соединения формулы I в сочетании с фармацевтически приемлемыми наполнителями и разбавителями.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ лечения опухолей у млекопитающих, включающий введение в организм млекопитающего соединения формулы I.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ лечения рака у млекопитающих, включающий введение в организм млекопитающего фармацевтического состава на основе соединения формулы I в сочетании с фармацевтически приемлемыми наполнителями и разбавителями.

Подробное описание изобретения и предпочтительные варианты его осуществления
К предпочтительным соединениям настоящего изобретения относятся соединения, где n означает 2, a R₁ и R₂ каждый независимо означает этил. К более предпочтительным соединениям настоящего изобретения относятся соединения, где R означает SO₂R₃ и С(O)OR'₃, и R₃ каждый означает метил. К самым предпочтительным соединениям настоящего изобретения относятся соединения, где R₉ означает гидроксил.

Синтез соединений предлагаемого изобретения можно проводить в соответствии со Схемой A (см. в конце описания).

Реагенты
(i) pyr, 115^oC
(ii) CHCl₂ОCH₃, AlCl₃, CH₂Cl₂, 25^oC
(iii) POCl₃, DMF, 100^oC
(iv) HCONH₂, HCO₂H, 140^oC
(v) NaOH, MeOH, H₂O, 70^oC
(vi) CH₃SO₂Cl, pyr, CH₂Cl₂, 25^oC
(vii) CH₃OCOCl, Et₃N, CH₂Cl₂, 25^oC
(viii) BBr₃, CH₂Cl₂, -78^oC
(ix) NCONHCH₃, HCOOH, 140^oC
Обработка тиоксантонов 2a и 2b (каждого в виде смеси с соответствующими их 3-хлорзамещенными региоизомерами) диалкиламино(алкил)гидразином в присутствии пиридина при кипячении с обратным холодильником приводит к образованию ядерных гетероциклических систем 3а и 3b, соответственно. Соединение 3а обрабатывают CHCl₂OCH₃/AlCl₃ с образованием 5-формилзамещенного производного 4а, в то время соединение 3b подвергают реакционным условиям Vilsmeier с выходом 4b. Обработка 4а и 4b формамидом/муравьиной кислотой (в условиях Leuckart) обеспечивает получение соединений 5а и 5b, соответственно; полученные формамиды подвергают гидролизу с образованием соответствующих аминов 6а и 6b при использовании раствора NaOH в воде с метанолом. Используя стандартную методологию, соединения 6а и 6b можно превратить в соответствующие метансульфонамидо-уретановые производные 7а, 7b, 8а и 8b. Фенольные аналоги 7с и 8с получают обработкой производных 7b и 8b, соответственно, с BBr₃ и CH₂Cl₂ при температуре -78^oC. Соединение 9 получают обработкой соединения 4а смесью HCONHCH₃/HCO₂H с последующим гидролизом с использованием основания.

Для модификации функциональных групп соединений (формулы I можно использовать простые химические превращения, которые общеприняты и хорошо известны специалистам в данной области химии.

Соединения формулы I можно использовать как в форме свободного основания, так и в форме солей присоединения кислот и, обе указанные формы включены в объем предлагаемого изобретения. В некоторых случаях, более удобной для использования формой предлагаемых соединений является их форма в виде солей присоединения кислот; и на практике, использование солевой формы равноценно состоянию, присущему использованию их в форме свободного основания. В качестве кислот, пригодных для получения кислых аддитивных солей, предпочтительно использование таких, которые приводят, в комбинации со свободным основанием, к образованию фармацевтически пригодных солей, то есть солей, анионы которых относительно безвредны для организма животного при использовании таких солей в терапевтически эффективных дозах, в результате чего не происходит ухудшение полезных свойств, присущих свободному основанию, из-за побочных эффектов, приписываемых действию анионов. При практическом осуществлении настоящего изобретения, целесообразно использовать предлагаемые соединения в форме свободного основания или аддитивной соли соляной кислоты, муравьиной кислоты, толуолсульфокислоты, метансульфокислоты или малеиновой кислоты. Однако в пределах объема настоящего изобретения возможны другие фармацевтически приемлемые соли, образованные с помощью других минеральных и органических кислот. Соли присоединения кислот основных соединений предлагаемого изобретения получают в соответствии со стандартными методами, общеизвестными специалистам в данной области, которые включают, но не ограничивая их объема, операцию растворения свободного основания в водно-спиртовом растворе, содержащем соответствующую кислоту, и последующее выделение образованной соли путем упаривания реакционного раствора, или взаимодействие свободного основания с кислотой в органическом растворителе, причем, в этом случае соль либо выделяется самопроизвольно, либо ее осаждают при использовании второго органического растворителя, или ее также можно получить путем упаривания реакционного раствора. Хотя предпочтение отдают фармакологически приемлемым солям основных соединений, все соли присоединения кислот входят в объем настоящего изобретения. Все соли присоединения кислот можно использовать в качестве источников для получения предлагаемых соединений в форме свободного основания, даже исключительно в тех случая, когда необходимо получить соль в качестве промежуточного продукта для конкретного ее использования, например когда необходимо образование соли для целей очистки или идентификации, или когда ее используют в качестве промежуточного соединения при получении фармакологически приемлемой соли, например, методами реакции ионного обмена.

Структуры соединений настоящего изобретения устанавливали в процессе синтеза. Спектры ПЯМР (протон-ЯМР), полученные на ЯМР-спектрометре GE QE 300 и масс-спектры, полученные методом химической ионизации на масс-спектрометре Nermag R 10-10 С коррелируют с устанавливаемыми структурами. В данных, полученных методом ПЯМР, мультиплетность спектрального терма имеет следующие обозначения: с (синглет), д (дублет), т (триплет), кв (квартет) и м (мультиплет). Константы связывания приведены в Гц. Анализ образцов на скорость сгорания (C,H,N) осуществляют по методу Quantitative Technologies, Inc. Whitehouse, NJ и, полученные результаты находятся в пределах 0,4% от теоретических значений. Реакции проводят в атмосфере N₂. Температуры плавления полученных соединений определяют на измерительном приборе для измерения точки плавления по кривой зависимости Плавление-Температура в открытых капиллярах, которые приведены в примерах в ^oC без их корректировки. Исходные соединения либо имеются в продаже, либо их можно получить в соответствии с методиками, которые общеизвестны специалистам в данной области техники.

Пример 1
Получение N,N-диэтил-2Н-[1]бензотиопирано[4,3,2-сd]индазол-2-этанамина.

Раствор, содержащий смесь (1: 1) 1-хлор- и 3-хлорзамещенного тиоксантен-9-она (6,20 г, 25,2 ммолей), N,N-диэтил-2-гидразиноэтанамина (4,20 г, 32,0 ммолей) в пиридине (50 мл) кипятят с обратным холодильником в течение 24 часов, и растворитель упаривают в вакууме. Остаток растворяют в CHCl₃ и промывают водой (3 раза). Органический слой сушат Na₂SO₄ и упаривают в вакууме. Остаток пропускают через слой силикагеля, элюируют смесью EtOAc/гексан (10% - 40%), с получением 2,42 г указанного соединения (30%). В результате последующей перекристаллизации из гексана получают аналитический образец, т. пл. : 49 - 50,5^oC. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн (часть на миллион): 1,00 (6Н; т), 2,56 (4Н; кв), 2,90 (2Н; т), 4,30 (2Н; т), 6,64 (1Н; д), 6,64 (1Н; д), 7,10 - 7,22 (4Н; м), 8,02 (1Н; дд). Масс-спектр.: отношение m/z 324 (МН⁺).

Элементный анализ (C₁₉H₂₁N₃S) С, Н, N.

Пример 2
Получение N, N-диэтил-9-метокси-2Н-[1]бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-2-этанамина.

Соединение получают и очищают по аналогичной методике, приведенной в примере 1, из смеси (1:1) 1-хлор- и 3-хлор-7-метокситиоксантен-9-она с 39% его выходом в виде желтого масла. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,98 (6Н; т), 2,56 (4Н; кв), 2,90 (2Н; т), 3,82 (3Н; с), 4,30 (2Н; т), 6,62 (1Н; д), 6,76 (1Н; дд), 6,80 (1Н; д), 7,08 (2Н; 2дс), 7,58 (1Н; д). Масс-спектр.: отношение m/z 354 (МН⁺). Элементный анализ (C₂₀H₂₃N₃OS)C,H,N.

Пример 3
Получение 2-[2-(диэтиламино)этил] -2Н-[1] бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-карбоксальдегида.

Суспензию хлорида алюминия (1,76 г, 12,8 ммолей) в CH₂Cl₂ (25 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин и прибавляют раствор соединения, полученного в примере 1 (2,07 г, 6,38 ммолей) в CH₂Cl₂ (15 мл) при температуре 5^oC. Полученную смесь перемешивают 10 мин и охлаждают до 0^oC. Затем к реакционной смеси прибавляют по каплям раствор дихлорометилметилового эфира (1,52 г, 17,4 ммолей) в 10 мл CH₂Cl₂ в течение 15 мин. Реакционной смеси дают нагреться до комнатной температуры, а затем ее перемешивают в течение ночи, разбавляют 2 н. НС1 (10 мл) и холодной водой (100 мл). Полученную смесь выливают в CHCl₃ (100 мл), подщелачивают раствором 2 н. NaOH до pH 8 - 9, и образовавшиеся слои отделяют. Водный слой экстрагируют CHCl₃ (40 мл). Объединенные органические слои промывают водой и сушат Na₂SO₄. После упаривания и сушки в вакууме получают неочищенный альдегид (2,16 г, 96%), который можно использовать без дополнительной очистки. Аналитический образец получают хроматографией на силикагеле (элюирование EtOAc) с последующей перекристаллизацией из смеси ЕtОАс/гексан (1:2), т.пл.: 81 - 82,5^oС. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,95 (6Н; т), 2,54 (4Н; кв), 2,95 (2Н; т), 4,40 (2Н; т), 7,02 (1Н; д), 7,23-7,40 (2Н; м), 7,51 - 7,54 (1Н; м), 7,64 (1Н; д), 8,17 - 8,20 (1Н; м), 10,02 (1Н; с). Масс-спектр.: отношение m/z 352 (МН⁺). Элементный анализ (C₂₀H₂₁N₃OS) С, Н, N.

Пример 4
Получение 2-(2-(диэтиламино)этил)-9-метокси-2Н-[1] бензотиопирано[4,3,2-cd]-индaзoл-5-кapбoкcaльдeгидa.

К перемешанному раствору, содержащему соединение из примера 2 (1,60 г, 4,19 ммолей) в ДМФ (45 мл) при комнатной температуре, прибавляют по каплям раствор хлорангидрида фосфорной кислоты (1,6 мл) в ДМФ (5 мл). Реакционную массу нагревают при температуре 95 - 100^oC в течение 18 часов. После этого прибавляют лед (50 г). Затем реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин и подщелачивают раствором 2 н. NaOH до установления pH 8 - 9. Полученный щелочной раствор экстрагируют CHCl₃ и экстракты промывают трижды водой, сушат Na₂SO₄, фильтруют и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток очищают флэш-хроматографией (при элюировании гексаном, смесью гексан:ЕtOАс (60:40) и EtOAc (100%) и выделяют целевой продукт (1,06 г, 61%) в виде желтого масла. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,98 (6Н; т), 2,56 (4Н; кв), 2,96 (2Н; т), 3,94 (3H, с), 4,42 (2Н; т), 6,96 - 7,06 (2Н; м), 7,48 (1Н; д), 7,62 - 7,72 (2Н; дд), 10,04 (1H; с).

Пример 5
Получение N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил] -2Н-[1] бензотиопирано[4,3,2-сd] индазол-5-ил]метил]формамида.

Раствор, содержащий соединение, полученное в примере 3 (1,64 г, 4,67 ммолей), муравьиную кислоту (1,8 г, 39 ммолей) и формамид (30 мл), нагревают до 140 - 150^oС в течение 5 часов. Реакционную смесь выливают в 40 мл воды со льдом, и подщелачивают раствором 2 н. NaOH до установления pH 8 - 9. Щелочной водный раствор экстрагируют CHCl₃. Органический слой промывают водой, сушат и после упаривания получают неочищенный продукт, который затем очищают хроматографией на двуокиси кремния при элюировании 0,5% изопропиламином в ЕtOАс с выделением чистого формамида (1,20 г, 67%), т.пл.: 159,5 - 161^oC. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,95 (6Н; т), 2,56 (4Н; кв), 2,92 (2Н; т), 4,36 (2Н; т), 4,08 (2Н; д), 6,83 (1H; д), 7,15 (1H; д), 7,18 - 7,30 (3H; м), 8,07 - 8,10 (1H; м), 8,26 (1H; с). Масс-спектр.: отношение m/z 381 (МН⁺). Элементный анализ (C₂₁H₂₄N₄OS) С, Н, М.

Пример 6
Получение N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил] -9-метокси-2Н-[1] -бензотиопирано-[4,3,2-сd]индазол-5-ил]метил]формамида.

Указанное соединение получают по количественному выходу по аналогичной методике, используемой для синтеза соединения примера 5, которое можно использовать далее без его очистки: т.пл.: 125 - 131^oC. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,92 (6Н; т), 2,48 (4Н; кв), 2,82 (2Н; т), 3,80 (3Н; с), 4,22 (2Н; т), 4,28 (2Н; д), 6,70 - 6,80 (2Н; м), 7,00 - 7,08 (2Н; м), 7,42 (1H; д), 8,08 (1Н; с). Масс-спектр.: отношение m/z 412 (МH⁺).

Элементный анализ (C₂₂H₂₆N₄O₂·1/4H₂O)
Пример 7
Получение N[2-[(2-(диэтиламино)этил]-2Н-[1]-бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-ил]метил]-N'-метилформамида.

Указанное соединение получают с 80% выходом по аналогичной методике, используемой для синтеза соединения примера 5 за исключением того, что N-метилформамид используют вместо формамида. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле (элюирование смесью EtOAc/гексан, 1:1). ¹H ЯМР (CDCl₃) (в виде смеси 2 изомеров, 2:3), ч/млн: 0,92 (6H; т), 2,50 (4H; кв), 2,70 - 2,80 (3H; с + с), 2,88 (2H; т), 4,2 - 4,36 (3,2H; м), 4,42 (0,8H; с), 6,80 - 7,30 (5H; м), 8,00 (1H; м), 8,10 (0,4H; с), 8,30 (0,6H; с).

Пример 8
Получение 2-[(2-(диэтиламино)этил1-2H-[1] -бензотиопирано[4,3,2-сd] индазол-5-метанамина.

К раствору, содержащему соединение примера 5 (2,76 г, 7,25 ммолей) в МеОН (100 мл) прибавляют 10% раствор NaOH (50 мл). Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 5 часов. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и экстрагируют CHCl₃. Органические слои промывают водой и сушат Na₂SO₄. При последующем упаривании в вакууме получают неочищенный продукт, который разделяют хроматографией при элюировании смесью 2% Et₃N и 98% CHCl₃ с получением 1,78 г (62%) чистого продукта в виде вязкого масла. При перекристаллизации его из смеси MeOH/EtOAc (2:10) получают аналитический образец, т. пл. : 197 - 199,5^oС. ¹H ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,99 (6H; т), 2,54 (6H; кв, с), 2,93 (2H; т), 3,79 (2H; с), 4,34 (2H; т), 6,87 (1H; д), 7,10 - 7,30 (4H; м), 8,01 (1H; м). Масс-спектр.: отношение m/z 353 (MH⁺). Элементный анализ (C₂₀H₂₄N₄S·HCl·1/2H₂O) С, Н, N.

Пример 9
Получение 2-[(2-(диэтиламино)этил] -9-метокси-2H-[1] -бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-метанамина.

Соединение получают по аналогичной методике, используемой для синтеза соединения примера 8. Чистое указанное вещество получают флэш-хроматографией [элюирование смесью гексан:ЕtOAс (50:50), EtOAc, CH₂Cl₂, 0,5 - 1% изопропиламином в CH₂Cl₂, выход 90%: т.пл. 74 - 76^oC. ¹H ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,96 (6Н; т), 2,52 (4Н; кв), 2,88 (2H; т), 3,72 (2H; с), 3,82 (3H; с), 4,28 (2Н; т), 6,70-6,80 (2H; м), 7,10 (1H; д), 7,62 (1Н; д). Масс-спектр.: отношение m/z 383 (МН⁺). Элементный анализ (C₂₁H₂₆N₄OS) С, H, N.

Пример 10
Получение N-метил-2-[(2-(диэтиламино)этил] -2Н-[1] -бензотиопирано[4,3,2-сd]индазол-5-метанамина дигидрохлорида гидрата.

Указанное соединение получают при 84% выходе по аналогичной методике, используемой для синтеза соединения примера 8. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле (элюирование смесью 1% Et₃N: 0,5% МеОН: CHCl₃). Гидрохлористую соль указанного соединения выделяют из раствора 2 н. НС1, т. пл.: 189 - 193^oC. ¹H ЯМР (свободное основание в CDCl₃), ч/млн: 0,96 (6H; т), 2,42 (3H; с), 2,53 (4H; кв), 2,89 (2H; т), 3,67 (2H; с), 4,30 (2H; т), 6,84 (1H; д), 7,10 - 7,30 (4H; м), 8,02 (1H; м). Масс-спектр.: отношение m/z 367 (MH⁺). Элементный анализ (C₂₁H₂₆N₄S·2HCl·3/4 H₂O) C, H, N.

Пример 11
Получение N-[[2-[2-(диэтиламино)этил] -2H-[1] -бензотиопирано[4,3,2-сd] индазол-5-ил]метил)метансульфонамида.

К раствору метансульфонилхлорида (0,172 г, 1,50 ммолей) в CH₂Cl₂ (30 мл) прибавляют соединение в форме свободного основания, полученное в примере 8 (0,51 г, 1,28 ммолей) и пиридин (0,4 мл) при перемешивании при 0^oC. Затем реакционной смеси дают нагреться до комнатной температуры в течение 5 часов, и к реакционной смеси прибавляют CHCl₃ (30 мл) и 2 н. NaOH (5 мл). Органические слои отделяют, промывают водой, сушат Na₂SO₄, и после упаривания в вакууме получают неочищенный целевой продукт, который очищают хроматографией (элюирование 0,5% Et₃N в CH₂Cl₂) с получением 0,650 г указанного продукта в виде смолы. После перекристаллизации из смеси эфир/метанол (90:10) выделяют указанное соединение (0,460 г, 84%), т.пл.: 120 - 125^oC. ¹H ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,98 (6H; т), 2,58 (4H; кв), 2,84 (3H; с), 2,92 (2H; т), 4,26 (2Н; д), 4,38 (2Н; т), 4,48 (1H; шир.), 6,90 (1Н; д), 7,08 - 7,30 (4H; м), 8,06 (1H; м). Масс-спектр.: отношение m/z 431 (МH⁺). Элементный анализ (C₂₁H₂₆N₄O₂S₂·1/2H₂O) C, H, N.

Пример 12
Получение N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил]-9-метокси-2Н-[1]бензотиопирано-[4,3,2-cd]индазол-5-ил]метил]метансульфонамида.

Указанное соединение получают по аналогичной методике, используемой для синтеза соединения примера 11. При флэш-хроматографии неочищенного продукта при элюировании его сначала гексаном, затем смесью гексан/ЕtOАс (40:60) и, наконец, EtOAc, получают указанное соединение в виде смолы (0,785 г, 66%). После перекристаллизации смолы из эфира с несколькими каплями CH₂Cl₂ получают аналитический образец указанного соединения, т.пл.: 125 - 126^oC. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,98 (6Н; т), 2,58 (4Н; кв), 2,84 (3Н; с), 2,90 (2Н; т), 3,88 (3Н; с), 4,26 (2Н; д), 4,72 (1Н; т), 6,80 - 6,92 (2Н; м), 7,20 (1Н; д), 7,22 (1Н; д), 7,60 (1Н; д). Масс-спектр.: отношение m/z 461 (МН⁺). Элементный анализ (C₂₂H₂₈N₄O₃S₂) С, Н, N.

Пример 13
Получение метил-N-[[2-[(2-диэтиламино)этил] -2Н-[1] -бензотиопирано(4,3,2-cd)индазол-5-ил]метил)карбамата.

К раствору, содержащему соединение в форме свободного основания, полученного в примере 8 (0,974 г, 2,45 ммолей) в CH₂Cl₂, прибавляют метилхлорформиат (0,23 мл) и Et₃N (0,8 мл) при перемешивании при 0^oС. Затем реакционную смесь перемешивают в течение еще 5 часов и охлаждают до комнатной температуры. Реакционную массу разбавляют CHCl₃ (0,23 мл) и водой (15 мл) и подщелачивают с доведением ее pH до 10 путем прибавления нескольких капель 10% раствора NaOH. Образовавшиеся органические слои отделяют, промывают водой, сушат Na₂SO₄, и после упаривания в вакууме получают неочищенное указанное соединение. В результате очистки методом хроматографии при элюировании смесью 0,5% изопропиламин/ЕtOAс получают 0,62 г чистого твердого вещества (55%), т. пл. : 130 - 132^oC. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,98 (6Н; т), 2,56 (4Н; кв), 2,90 (2Н; т), 3,66 (2Н; с), 4,30 (4Н; т, с), 4,98 (1Н; шир.), 6,86 (1Н; д), 7,08 - 7,30 (4Н; м), 8,04 (1Н; м). Масс-спектр.: отношение m/z 411 (MH⁺). Элементный анализ: вычислено для C₂₂H₂₆N₄O₂S: С, H, N.

Пример 14
Получение метил N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил)-9-метокси-2Н-[1]-бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-ил]метилкарбамата.

Указанное соединение получают по методике, аналогичной используемой в синтезе неочищенного соединения по примеру 13. В результате флэш-хроматографии полученного неочищенного продукта (элюирование смесью 5% MeOH/EtOAc) выделяют чистое указанное соединение (1,10 г, 63%) в виде бледно-желтого твердого вещества, т. пл. 125 - 127^oC. Масс-спектр.: отношение m/z. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,98 (6Н; т), 2,59 (4Н; кв), 2,95 (2Н; т), 3,70 (3Н; с), 4,89 (3Н; с), 4,35 (4Н; м), 7,15 (2Н; м), 7,22 (2Н; д), 7,60 (1Н; д).

Пример 15
Получение N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил] -9-гидрокси-2Н-[1]-бензотиопирано-(4,3,2-cd)-индазол-5-ил]метил]метансульфонамида.

Раствор, содержащий соединение, полученное в примере 12 (1,02 г, 2,22 ммолей) в CH₂Cl₂ (50 мл) охлаждают до температуры -50^oC и обрабатывают введением по каплям BBr₃ (15 мл 1 М раствора в CH₂Cl₂, 15 ммолей) с образованием в результате этого густой суспензии оранжевого цвета. Затем реакционную массу охлаждают до температуры -10^oC, и перемешивают в течение еще 2 часов. Реакционную массу разбавляют CH₂Cl₂ (100 мл) и гасят MeOH (10 мл). Полученную смесь выливают в воду со льдом, нейтрализуют водным раствором NaOH, и экстрагируют смесью 10% MeOH/CHCl₃ (5 раз). Органическую фазу отделяют, а водный слой промывают соляным раствором, сушат Na₂SO₄ и после упаривания в вакууме получают желтое твердое вещество (0,87 г). В результате флэш-хроматографии на сухой колонке при элюировании продукта сначала EtOAc, затем смесью 1% MeOH/EtOAc и в конце смесью 1% МеОН/0,2% изопропиламин/ЕtОAс экстрагируют чистый целевой продукт в виде белого твердого вещества (0,44 г, 45%), т. пл. 215 - 218^oC (разл.). ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆), ч/млн: 0,80 (т, J = 7,1 Гц, 6Н), 2,44 (кв, J = 7,1 Гц, 4Н), 2,82 (т, J = 6,3 Гц, 2Н), 2,86 (с, 3H), 4,02 (д, J = 6,0 Гц, 1Н), 4,33 (т, J = 6,1 Гц, 2Н), 6,74 (дд, J = 2,7, 8,7 Гц, 1H), 7,16 (д, J = 8,6 Гц, 1H), 7,26 (д, J = 8,3 Гц, 2Н), 7,37 (д, J = 2,6 Гц, 1H), 7,44 (т, J = 6,0 Гц, 1H) 9,78 (с, 1H). Масс-спектр.: отношение m/z 447 (MH⁺). Элементный анализ (C₂₁H₂₆N₄O₃S₂·1/4H₂O) С, H, N.

Пример 16
Получение метил N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил] -9-гидрокси-2Н-[1]-бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-ил]метил]карбамата.

Указанное соединение получают по аналогичной методике, используемой для синтеза соединения примера 12. Полученный неочищенный продукт очищают флэш-хроматографией на сухой колонке при элюировании продукта сначала EtOAc, затем смесью 2% MeOH/EtOAc и в конце смесью 1,8% MeOH/0,2% изопропиламин/ЕtОAс с извлечением целевого продукта. После упаривания экстракта в вакууме получают указанное соединение в виде желтовато-белого твердого вещества (0,42 г, 61%), т.пл. 239 - 240^oC (разл.). ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,98 (т, J = 7,2 Гц, 6Н), 2,54 (4, J = 7,l Гц, 4Н), 2,86 (т, J = 7,2 Гц, 2Н), 3,65 (с, 3H), 4,25 (м, 2Н), 5,15 (шир.с, 1Н), 6,76 (дд, J = 7,2, 8,5 Гц, 1H), 6,85 (д, J = 8,6 Гц, 1H), 7,45 (д, J = 8,6 Гц, 1H), 7,23 (м, 1H), 7,43 (д, J = 2,9 Гц, 1H). Элементный анализ (C₂₂H₂₆N₄O₃S) C, H, N.

Пример 17
Получение N-[[2-1(2-(диэтиламино)этил] -9-метокси-2Н-[1] -бензотиопирано[4, 3, 2-cd]индазол-5-ил]метил]-2-хлорацетамида.

Раствор, содержащий соединение, полученное в примере 2 (0,73 г, 2,05 ммолей) в ледяной HOAc (4 мл) обрабатывают при 0^oC концентрированной H₂SO₄ и перемешивают в течение 15 мин. Затем прибавляют N-гидроксиметилхлорацетамид (0,26 г, 2,10 ммолей) и реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. Смесь выливают в лед, подщелачивают 3 н. NaOH и экстрагируют CHCl₃ (3 х 50 мл). Органическую фазу отделяют, сушат Na₂SO₄ и после упаривания в вакууме получают неочищенный продукт, который очищают флэш-хроматографией (на силикагеле, элюирование смесью гексан/EtOAc, 1:1) с выделением чистого указанного соединения (0,64 г, 70%), т.пл. 167 - 169^oC. ¹Н ЯМР (CDCl₃), ч/млн: 0,92 (т, 6Н), 2,48 (кв, 4Н), 2,84 (т, 2Н), 3,78 (с, 3Н), 4,04 (с, 2Н), 4,22 (т,2Н), 4,30 (д, 2Н), 6,64 - 6,74 (м, 2Н), 6,92 (т, 1Н), 7,02, (м, 2Н), 7,42 (д, 1Н). Масс-спектр.: отношение m/z 462 (МН⁺). Элементный анализ (C₂₃H₂₇ClN₄O₂S) С, Н, N.

Образцы типичных соединений настоящего изобретения использовали в испытаниях на противоопухолевую активность.

В испытаниях указанных соединений на противоопухолевую активность использованы следующие методы, и полученные результаты приведены в табл. 1. Тест на цитотоксичность in vitro - этот показатель определяют путем подсчета количества выживших клоногенных клеток на мягком агаре через час после транзиторного воздействия лекарственного средства на клетки, инфицированные мышиной лейкемией Р388. ИК₅₀ означает концентрацию лекарственного средства, которая снижает показатель выживаемости клоногенных клеток на 50%. Ингибирование топоизомеразы II - показатель стимуляции испытуемым соединением комплексообразования с ковалентной связью между [³²P]-меченной по концам ДНК pBR322 и высокоочищенной топоизомеразы II, выделенной из клеток линии HeLa определяют методом преципитации натрия додецилсульфата /К⁺ Trask и других, описанного в журнале EMBO Journal, 1964, вып. 3, стр. 671 - 676. Значения ЭК₅₀ (ЕС₅₀) рассчитывают как концентрацию испытуемого соединения, при которой количество осажденной ДНК эквивалентно 50% от максимального количества, осажденного м-AMSA в сопуствующем контрольном эксперименте.

Интеркаляция ДНК - общеизвестный метод анализа ингибирования бромистым этидием, приводящего к сдвигу рамки считывания, используют для определения способности ДНК к интеркаляции (Cain и другие, журнал J.Med.Chem., 1978, вып. 21, стр. 658 - 668). ЭК₅₀ (среднее значение, полученное из двух замеров) означает концентрацию испытуемого соединения, необходимую для 50% вытеснения бромистого этидия, связанного с ДНК, выделенной из телячьего тимуса. Тест на противоопухолевую активность испытуемого соединения у мыши с паппилярной аденокарциномой панкреатической железы #03. Этот тест проводят в соответствии с методиками: Corbett и других, Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, Kluwer Academic Publishers, Boston, 1992, стр. 35 - 87; Corbett и других, Cancer Res., 1984, вып. 44, стр. 717 - 726.; и LoRusso, и другие, Cancer Res., 1990, вып. 50, стр. 4900 - 4905.

Показатель Т/С - этот показатель означает степень подавления фактора роста опухолевых клеток, где Т означает среднюю предрасположенность к опухолеобразованию в 100 раз ниже в группе, подвергшейся лечению испытуемым соединением при оценке, С означает среднюю предрасположенность к опухолеобразованию в контрольной группе при оценке. Значения Т/С<42% считается как уровень с достоверной противоопухолевой активностью.

МПД (MTD) - этот показатель означает максимально переносимую суммарную дозу лекарственного вещества, вводимого внутривенно в мг/кг.

LTC - этот показатель означает эффективность лечения в зависимости от продолжительности проведенных курсов лечения, то есть количество мышей в леченной группе, где не было отмечено ни одного случая пальпируемой опухоли после минимального 86-дневного курса введения испытуемого соединения на общее количество животных в группе, подвергшейся лечению.

LCK - этот показатель означает гибель клеток в логарифмической фазе роста у онкогенных мышей (не включая случаи продолжительных курсов лечения), оценку этого показателя осуществляют на основе данных замедления роста опухоли; курсы лечения для этой стадии развития опухоли требуют показатели гибели клеток в логарифмической фазе >4,51 (см. табл.1 и 2).

Фармацевтические составы предлагаемого изобретения могут включать в свою рецептуру одно или несколько заявляемых соединений в комбинации с одним или несколькими нетоксичными физиологически приемлемыми наполнителями, адъювантам, разбавителями или носителями, под которыми следует понимать в данном описании все носители для парентерального введения путем инъекций, для перорального введения в твердой или жидкой форме, для ректального или местного введения и тому подобные.

Предлагаемые составы можно вводить человеку или животному любым из следующих путей введения: перорально, ректально, парентерально (внутривенно, внутримышечно или подкожно), интравагинально, внутрибрюшинно, местно (в форме порошков, мазей или капель) или буккальным или назальным путем в виде аэрозоля.

Лекарственные препараты предлагаемого изобретения для парентерального введения могут включать в свой состав физиологически приемлемые стерильные водные и безводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для приготовления из них стерильных инъекционных растворов или дисперсий. В качестве пригодных для использования водных и безводных носителей, разбавителей, растворителей или наполнителей могут служить вода, этанол, полиолы (пропиленгликоли, полиэтиленгликоль, глицерин и тому подобные), а также соответствующие их смеси, растительные масла (например, оливковое масло) и вводимые в виде инъекций сложные эфиры, например этилолеат. Требуемую текучесть этой формы можно обеспечить, например при использовании покрытия, такого как лецитин, а также обеспечения необходимого гранулометрического состава, в случае приготовления дисперсий, и при использовании поверхностно-активных веществ.

Такие фармацевтические составы могут также содержать адъюванты, например консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергаторы. Для защиты от воздействия микроорганизмов в указанных составах можно использовать различные противобактериальные и противогрибковые средства, например парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту и тому подобное. Целесообразно также включать в такие составы изотоники, например растворы глюкозы, хлористого натрия и тому подобное. Инъекционную лекарственную форму с пролонгированной абсорбцией можно обеспечить при использовании агентов, задерживающих абсорбцию, например как стеарат алюминия и желатин.

При желании, для лучшего распределения соединения предлагаемого изобретения могут быть включены в системы, обеспечивающие пролонгированное их высвобождение или целевую их доставку, например как полимерные матрицы, липосомы, и микросферы. Их можно получать в стерильном виде, например путем пропускания через фильтр, задерживающий бактерии, или включением в состав стерильных агентов в форме твердых составов, которые можно растворить в стерильной воде, или другой инъекционной стерильной жидкой среде непосредственно перед использованием.

Твердые формы лекарственных препаратов на основе предлагаемых соединений для перорального введения можно получать в виде капсул, таблеток, пилюль, порошков и гранул. Для получения указанной твердой формы, активное соединение смешивают с по меньшей мере одним инертным наполнителем (или носителем), например цитратом натрия или дикальцийфосфатом, или (а) наполнителями или рыхлителями, например любым крахмалом, сахарозой, глюкозой, маннитом и кремниевой кислотой, (b) вяжущими средствами, например как карбоксиметилцеллюлоза, алигнаты, желатина, поливинилпирролидон, сахароза и акация, (с) смачивателями, например как глицерин, (d) дезинтеграторами, например как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиочный крахмал, альгиновая кислота, некоторые комплексные силикаты и карбонат натрия, (е) средства, задерживающие высвобождение активного вещества, например парафин, (f) средства, ускоряющие абсорбцию, например соединения четвертичного аммония, (g) смачивающие агенты, например цетиловый спирт и моностеарат глицерина, (h) адсорбенты, например каолин и бентонит и (i) замасливатели, например как тальк, кальция стеарат, магния стеарат, твердые полиэтиленгликоли, натрия лаурилсульфат или их смеси. В случае использования предлагаемых фармацевтических составов в форме капсул, таблеток и пилюль, такие лекарственные формы могут также содержать буферные вещества.

Процентное содержание активного компонента в таких составах может меняться в зависимости от дозировки, пригодной для использования. Дозировка лекарственного препарата для конкретного больного может меняться в зависимости от указания врача с учетом следующих критериев: метода введения, продолжительности курса лечения, массы тела и физического состояния больного, активности действующего вещества и реакции на него пациента. Терапевтически эффективную дозу активного компонента, может таким образом без труда подобрать врач с учетом всех вышеуказанных критериев и собственного мнения относительно дозировки, безопасной для больного.

Формула изобретения

1. Бензотиопираноиндазолы следующей формулы I

где n = 2 или 3;
R означает водород, низший алкил, С(О)Н, C(O)R₃, SO₂R₃ и C(O)OR₃;
R₁ и R₂ каждый независимо означает водород или низший алкил;
R₃ означает низший алкил;
R₉ означает водород, низший алкил, низший алкоксил, или гидроксил, или любая фармацевтически приемлемая их соль присоединения кислоты, или сольват.

2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой соединение, где n = 2.

3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой соединение, где R₁ и R₂ каждый независимо означает этил.

4. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой соединение, где R₉ означает гидроксил.

5. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой соединение, где R означает SO₂R₃ и C(O)OR₃ и R₃ каждый означает метил.

6. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой соединение, где n означает 2; R₁ означает этил; R₂ означает этил и R₉ означает гидроксил.

7. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой: а) N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил]-2H-[1]-бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-ил]метил] формамид; b) N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил]-9-метокси-2Н-[1]-бензотиопирано[4,3,2-cd] индазол-5-ил] метил]формамид; с) N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил] -2H-[1] -бензотиопирано[4,3,2-cd] индазол-5-ил] метил] -N'-метилформамид; d) 2[(2-(диэтиламино)этил] -2H-[1]-бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-метанамин; е) 2-1(2-(диэтиламино)этил)-9-метокси-2Н-[1]-бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-метанамин; f) N-метил-2-[(2-(диэтиламиноэтил] 2H-[1] -бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-метанамин; g) N-[[2-[2-(диэтиламино)этил]2H-[1]-бензотиопирано[4,3,2-cd)индазол-5-ил] метил] метансульфонамид; h) N-1[2-[(2-(диэтиламино)этил] -9-метоксил-2Н-[1] -бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-ил] метил] метансульфонамид; i) метил N-[[2-[(2-диэтиламино)этил]-2H-[1]-бензотиопирано(4,3,2-cd)индазол-5-ил] метил)карбамат; j) метил N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил] -9-метокси-2Н-[1] -бензотиопирано[4,3,2-cd] индазол-5-ил] метилкарбамат; k) N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил)-9-гидрокси-2Н-[1]-бензотиопирано-(4,3,2-cd)-индазол-5-ил] метил] метансульфонамид; l) метил N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил] -9-гидрокси-2Н-[1] -бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-ил] метил] карбамат или m) N-[[2-[(2-(диэтиламино)этил]-9-метокси-2Н-[1]-бензотиопирано[4,3,2-cd]индазол-5-ил]метил]-2-хлорацетамид.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, отличающаяся тем, что она содержит соединение формулы I по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

9. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, отличающаяся тем, что она содержит соединение формулы I по п.6 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

10. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, отличающаяся тем, что она содержит соединение формулы I по п.7 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

11. Способ лечения опухоли у млекопитающего, отличающийся тем, что он включает введение в организм указанного млекопитающего соединения формулы I по п.1 в дозе, эффективной для снижения размера опухоли.

12. Способ лечения опухоли у млекопитающего, отличающийся тем, что он включает введение в организм указанного млекопитающего соединения формулы I по п.6 в дозе, эффективной для снижения размера опухоли.

13. Способ лечения опухоли у млекопитающего, отличающийся тем, что он включает введение в организм указанного млекопитающего соединения формулы I по п.7 в дозе, эффективной для снижения размера опухоли.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3