Лечение рака и профилактика метастазирования

 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и касается лечения рака и профилактики его метастазирования. Для этого больному на первом этапе лечения проводят прямую инъекцию в опухоль противоракового препарата и препарата гиалуроновой кислоты ММ менее 750000 дальтон. На втором этапе больному вводят системно препарат той же кислоты в сочетании с препаратом, выбранным из группы НСПВП, химиотерапевтический агент, в частности антиоксидант. Этапы повторяются до достижения клинического эффекта. Способ обеспечивает уменьшение активности опухолевого процесса. 5 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к лечению рака и профилактике метастазирования у больных раком. Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям и дозированным количествам, пригодным для такого лечения и для профилактики. В одном приложении данное изобретение относится к лечению рака молочной железы и профилактике метастазирования у пациента с раком молочной железы.

Обычное лечение рака молочной железы включает мастэктомию, хирургическое удаление ткани молочной железы. Метод может варьироваться от простого удаления опухолевого узла до радикального вмешательства, в процессе которого хирург удаляет внутреннюю грудную цепочку лимфоузлов, лежащие под молочной железой грудные мышцы и прилегающие подмышечные лимфоузлы.

При раннем выявлении раковых опухолей молочной железы в настоящее время считается приемлемым лечение, сохраняющее молочную железу. Так, в качестве альтернативного способа лечения в настоящее время рекомендуется удаление опухолевого узла в сочетании с резекцией подмышечных лимфоузлов и лучевой терапией. Однако все еще ведется значительная полемика вокруг того, какое предельно минимальное лечение необходимо для достижения адекватного местного подавления. Это справедливо для всех видов рака. Поэтому при рассмотрении тактики лечения выбирают такой способ, который устранит раковое поражение и исключит рецидивы в виде метастазов, например, в молочной железе или в других органах и тканях.

В опубликованной заявке WO 91/04058 приведен новый способ лечения рака наряду с другими заболеваниями, заключающийся во введении дозированных количеств фармацевтических композиций, содержащих эффективные количества НСПВП, витамина C, противораковых агентов, наряду с прочими лекарственными препаратами и терапевтическими средствами вместе с производными гиалуроновой кислоты, например гиалуронатом натрия, имеющим молекулярный вес менее 750000 дальтонов, в количестве, равном или превышающем 10 мг на человека весом 70 кг. На странице 27, строка 35, документа указано, что дозы препаратов могут вводиться внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутриплеврально и непосредственно в опухоль путем инъекции через иглу, введенную под ультразвуковым или компьютерно-томографическим (КТ) контролем.

В случае V11, представленном на страницах 42 и 43, описано лечение массивного рака молочной железы с пальпируемыми надключичными и подмышечными лимфоузлами. Лечение включало комбинированное применение "гиалуроновой кислоты и/или ее солей в дополнение к обычной химиотерапии, применяемой системно, путем инъекции в опухоль и введения в плевральную полость" (страница 45, строки 3-5).

В указанном документе также исследовано системное введение сочетаний гиалуроновой кислоты и/или ее солей с НСПВП (нестероидными противовоспалительными препаратами), аскорбиновой кислотой (витамином C), противораковыми препаратами наряду с другими препаратами.

Публикация WO/CA93/00061 касается местного лечения кожных заболеваний и состояний и в ней описано изучение местного применения определенных дозированных количеств предлагаемых фармацевтических композиций. С помощью такого местного применения излечивается и устраняется, например, базальноклеточная карцинома. Дозированные количества препарата, поступающие из кожи, попадают в лимфатическую систему (страница 31, строка 35). Во время их нахождения в коже, в частности в эпидермисе, препараты лечат заболевание или патологическое состояние кожи с помощью формы гиалуроновой кислоты (например, гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон), доставляющего препараты в кожу. При применении НСПВП подавляется синтез простагландина, разблокируя макрофаги и клетки - естественные киллеры (от страницы 26, строка 27, до страницы 27, строка 35), обеспечивая таким образом возможность макрофагам и естественным киллерам бороться с заболеванием или патологическим состоянием.

Хотя разрушение/ликвидация злокачественной опухоли и всей имеющейся раковой опухоли является конечной целью, его нельзя предпринять без учета влияния на метастазирование. Необходимо предотвратить метастазирование и рецидив рака, особенно метастазирование в уязвимые органы, как например печень.

В применявшихся в прошлом способах лечения не уделялось достаточного внимания и заботы эффекту метастазирования (метастазам). Все было сосредоточено на разрушении и ликвидации опухоли. Таким образом, в назначаемых или предпринимаемых в прошлом способах лечения пытались разрушить злокачественную опухоль. Однако при многих подходах сохранялась возможность синтеза простагландина в ткани (что угнетало способность макрофагов и клеток - естественных киллеров выполнять их функцию - уничтожение раковых клеток и разрушение опухоли). Поэтому вместо того, чтобы быть уничтоженными, раковые клетки высвобождались из опухоли и получали возможность циркулировать по телу и оседать в более уязвимой области (например, печень или легкие - определенный способ метастазирования.

Поэтому объектом настоящего изобретения является новый способ лечения рака, который находит одно конкретное применение при лечении рака молочной железы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является снижение опасности метастазирования при таком способе лечения.

Еще одним объектом настоящего изобретения является снижение опасности рецидива заболевания, например, рака молочной железы.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции и дозированные количества фармацевтических композиций, подходящие для применения при таких способах лечения.

Дополнительные и другие объекты изобретения будут понятны специалистам в этой области из следующего краткого изложения сущности изобретения и подробного описания вариантов его реализации.

Неожиданно заявители нашли новый способ лечения рака (например, рака молочной железы - злокачественных опухолей молочной железы), который не только вызывает резкое уменьшение размера и исчезновение злокачественной опухоли (как например, опухоли молочной железы), но также неожиданно снижает опасность метастазирования.

В соответствии с одним аспектом изобретения заявители предложили новый способ лечения рака у человека, в частности злокачественных опухолей, например опухолей молочной железы или молочных желез, который включает этапы: 1) прямой инъекции в опухоль нетоксичного дозированного количества фармацевтической композиции, содержащей эффективное нетоксичное количество противоракового препарата и/или препарата, пригодного для применения при лечении рака (например, от около 1 до около 2 мг Novantrone^TM (Mitoxantrone) или другого химиотерапевтического агента (интерферон или НСПВП) и эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000-225000 дальтон) (например, от около 10 до около 20 мг гиалуроната натрия) в стерильной воде (размер опухоли определяет количество, которое может быть непосредственно введено в опухоль), и 2) предпочтительно системного введения (предпочтительно внутривенно) сочетания предпочтительно дозированного количества фармацевтического состава, содержащего: I) эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000-225000 дальтон), например, около 100-200 мг или более (ввиду отсутствия токсичности и для уменьшения побочных эффектов любых лекарственных средств (например, НСПВП), вводимых совместно с ним, если количество формы гиалуроновой кислоты превышает около 200 мг на человека весом 70 кг); II) препарат, выбранный из группы, включающей: а) нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), например, в эффективном нетоксическом количестве от около 30 мг до около 100 мг (например, от 30 до 60 мг трометаниновой соли кеторалака (имеющегося в продаже под торговой маркой Toradol) и от 50 до 100 мг диклофенака или диклофенака натрия (например, имеющегося в продаже под торговой маркой Voltarol)); б) эффективное нетоксическое количество химиотерапевтического агента, как описано выше в пункте (I) (противораковый препарат или препарат, пригодный для лечения рака и т.д.), и их сочетание необязательно вместе с III) антиоксидантом, например витамином C (при одном осуществлении - 25 г витамина C).

Когда применяется более 200 мг формы гиалуроновой кислоты на человека весом 70 кг, неблагоприятные побочные эффекты введения препаратов (НСПВП: химиотерапевтический агент) снижаются, если не устраняются.

Частота лечения по поводу злокачественных опухолей, как правило, может быть от одного (1) до четырех (4) раз ежемесячно или более (по потребности). По поводу рака молочной железы частота прямых инъекций в злокачественную опухоль в молочной железе фармацевтических композиций, указанных выше в подпункте (1), и системного (внутривенного) введения дозированного количества фармацевтической композиции, содержащей: I) эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярной вес менее 750000 дальтон (например, 150000-225000 дальтон), например, около 100-200 мг или более препарата, вводимого вместе с количеством формы гиалуроновой кислоты, превышающим 200 мг на человека весом 70 кг (ввиду отсутствия токсичности);
II) препарат, выбранный из группы, включающей:
а) нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), например, в количестве от около 30 мг до около 100 мг (например, от 30 до 60 мг трометаниновой соли кеторалака (имеющегося в продаже под торговой маркой Toradol) и от 50 до 100 мг диклофенака или диклофенака натрия (например, имеющегося в продаже под торговой маркой Voltarol)); и
б) эффективное нетоксическое количество химиотерапевтического агента, как описано выше в пункте I) (противораковый препарат или препарат, пригодный для лечения рака и т.п.), и их сочетания необязательно вместе с
III) антиоксидантом, например витамином C (при одном осуществлении - 25 г витамина C),
составляет от около (1) до трех (3) раз в месяц. (Форма гиалуроновой кислоты, например гиалуронат натрия, транспортирует (вызывает транспорт) лекарственные препараты и терапевтические агенты в опухолевую ткань для ее деструкции и угнетает синтез простагландина).

На молочную железу, пораженную злокачественной опухолью, можно воздействовать гипертермией (нагреванием до высокой температуры). Можно также назначать другие способы лечения. Например, в качестве предостережения, в зависимости от количества введенного НСПВП и количества введенного гиалуроната натрия, может быть также внутривенно введен вместе с гиалуронатом натрия лекарственный препарат, вызывающий изъявление слизистой желудка, как например ранитидин.

В соответствии с другим аспектом изобретения заявители предложили новый способ лечения рака, и указанный способ включает этапы:
1) системного введения (предпочтительно, внутривенно) человеку дозированного количества, включающего эффективное нетоксическое количество препарата, подходящего для лечения рака, самого по себе или предпочтительно с эффективным количеством формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000-225000 дальтон) (например, от около 10 до около 20 мг гиалуроната натрия) и
2) введения предпочтительно системного (предпочтительно внутривенно) дозированного количества фармацевтической композиции, содержащей:
I) эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000-225000 дальтон), например, около 100-200 мг или более (ввиду отсутствия токсичности);
II) препарат, выбранный из группы, включающей:
а) нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), например, в количестве от около 30 мг до около 100 мг (например, от 30 до 60 мг трометаниновой соли кеторалака (имеющегося в продаже под торговой маркой Toradol) и от 50 до 100 мг диклофенака или диклофенака натрия (например, имеющегося в продаже под торговой маркой Voltarol));
б) эффективное нетоксическое дозированное количество химиотерапевтического агента для лечения рака;
и их сочетания предпочтительно вместе с
III) антиоксидантом, например витамином C (при одном осуществлении - 25 г витамина C).

Этапы повторяют в течение периода времени с выбранными интервалами, подходящими для пациента.

Неожиданно и в соответствии с другим аспектом изобретения у больных, которым регулярно вводили дозированные количества, описанные выше, в течение срока их лечения, не наблюдалось никакого метастатического эффекта (у них не было метастазов). Таким образом, у них произошло резкое и неожиданное существенное уменьшение опасности метастазирования.

Таким образом, в соответствии с другим аспектом изобретения заявителями предложен новый способ лечения для уменьшения опасности для больных, страдающих раком и имеющих раковые метастазы (уменьшение опасности для таких больных, которые страдают от метастаз или страдающих от метастатических эффектов), и указанный способ лечения включает (предпочтительно с другим способом лечения, например, описанным выше) системное введение (предпочтительно внутривенное) дозированного количества фармацевтической композиции, содержащей
I) эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуронаната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например 150000-225000 дальтон), например, около 100-200 мг или более (ввиду отсутствия токсичности);
II) препарат, выбранный из группы, включающей:
а) нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), например, в количестве от около 30 мг до около 100 мг (например, от 30 до 60 мг трометаниновой соли кеторалака (имеющегося в продаже под торговой маркой Toradol) и от 50 до 100 мг диклофенака или диклофенака натрия (например, имеющегося в продаже под торговой маркой Voltarol)); и
б) эффективное нетоксическое дозированное количество химиотерапевтического агента (противоракового агента или препарата, пригодного для лечения рака);
и их сочетания предпочтительно с
III) антиоксидантом, например витамином C (при одном осуществлении - 25 г витамина C),
и указанное введение продолжается с равными промежутками (например, 1 - 4 раза ежемесячно) в течение срока лечения, назначенного пациенту для лечения рака.

Заявители полагают, что описанные выше способы лечения являются успешными потому, что подавляется синтез простагландина, реактивируя таким образом макрофаги и клетки - естественные киллеры для разрушения раковой опухоли, предотвращается или по крайне мере создаются препятствия для неоангиогенеза (комбинацией гиалуроновой кислоты (ГК) с НСПВП), усиливается выработка простациклина под влиянием используемого витамина C (аскорбат натрия), а гиалуроновая кислота (например, гиалуронат натрия) выводится через лимфатическую систему (по данным прямого измерения, концентрация гиалуроната (встречающегося в организме) в 10 раз выше в лимфе, чем в плазме). Авторы также наблюдали пролонгированное действие после введения простой дозы лекарственного препарата с ГК (формой гиалуроновой кислоты, например гиалуронатом натрия), что, как полагают заявители, связано с тем, что ГК, введенная внутривенно, пройдет через лимфатические пути. Поэтому можно предвидеть улучшение и удлинение эффекта в плане иммуносупрессии, например, при использовании циклоспорина. Это было подтверждено в некоторых первоначальных экспериментах с использованием кишечных аллотрансплантатов, в которых кишка трансплантируется на артериально-венозной ножке, но все ее лимфатические сосуды отсепарируются. Таким образом, когда препарат попадает через артериальное кровообращение, он следует в лимфатические пути, но лимфатический дренаж, по которому возможен выход из кишки, отсутствует. Поэтому препарат остается в трансплантатах в течение длительного срока. В первоначальных эксперментах авторов одна и две дозы циклоспорина в ГК обеспечивали неопределенно длительное выживание аллотрансплантата.

Ввиду того что, например, гиалуронат натрия транспортирует, переносит и обуславливает транспорт препарата, препарат также переносится и освобождается в лимфоузлах. Поскольку поток крови также захватит, например, гаилуронат натрия, и, следовательно, препарат, гиалуронат натрия и препарат будут доставлены в печень (с гиалуронатом натрия, переносящим препарат в ткань и клетки печени). Таким образом, в два главных участка возникающих метастазов поступает, например, гиалуронат натрия и препарат (натрия, НСПВП, противораковый препарат), доставленные в них гиалуронатом натрия, облегчающим транспорт препарата в ткань (лимфоузлов и печени), в которой требуется предотвратить развитие и/или метастазирование рака. Таким образом, гиалуронат натрия (и другие формы гиалуроновой кислоты, включая гиалуроновую кислоту) могут вводиться системно с препаратом, и при таком введении препарат совместно с формой гиалуроновой кислоты доставляется в лимфоузлы и печень. Такое введение помогает снизить риск метастазирования и, как показывают результаты исследований заявителей, помогает подавить или даже предотвратить метастазирование рака, лечение которого проводится у человека. Такое введение может также применяться для лечения ракового поражения лимфатической системы и печени, если в них обнаружен рак.

Если рак, по поводу которого проводится лечение, является злокачественной опухолью молочной железы и лечение включает системное введение, прямая инъекция (несколько раз в месяц в течение срока лечения рака), например, гиалуроната натрия с противораковым препаратом и/или НСПВП приводит к уменьшению в размере и исчезновению опухолей. Неожиданно уменьшение в размере протекало без метастазирования.

Поэтому в соответствии с другим аспектом изобретения заявителями предложены новые дозированные количества фармацевтических композиций в форме для системного введения (обычно, внутривенного введения из мешка системы для внутривенного введения), причем каждое такое дозированное количество включает
I) эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000 - 225000 дальтон), например, около 100 - 200 мг или более (ввиду отсутствия токсичности и уменьшения побочных эффектов препарата, вводимого вместе с формой гиалуроновой кислоты, взятой в количестве, превышающем 200 мг на человека весом 70 кг);
II) препарат, выбранный из группы, включающей:
а) нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), например, в эффективном нетоксическом количестве от около 30 мг до около 100 мг (например, от 30 до 60 мг трометаниновой соли кеторалака (имеющего в продаже под торговой маркой Toradol) и от 50 до 100 мг диклофенака или диклофенака натрия (например, имеющегося в продаже под торговой маркой Voltarol)); и
б) эффективное нетоксическое количество химиотерапевтического агента (противораковый агент или препарат, пригодный для лечения рака и т.д.),
и их сочетания предпочтительно с
III) антиоксидантом, например витамином C (при одном осуществлении - 25 г витамина C).

В соответствии с другим аспектом изобретения заявителями предложены новые дозированные количества фармацевтической композиции для инъекции (в форме, пригодной для инъекции), пригодной для применения, например, с указанным выше дозированным количеством, где указанное дозированное количество помещено в контейнер или флакон, пригодные для использования для инъекции (например, в шприц), и содержит эффективное количество противоракового препарата и/или препарата, пригодного к применению при лечении рака (например, рака молочной железы, в случае которого дозированное количество инъецируется в каждую опухоль молочной железы) (например, от около 1 до около 2 мг Mitoxantrone) и эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000 - 225000 дальтон) (например, от около 10 до около 20 мг гиалуроната натрия), в стерильной воде.

Таким образом, заявителем предложено использование нового дозированного количества фармацевтического состава, включающего
I) эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000 - 225000 дальтон), например около 100 - 200 мг или более (ввиду отсутствия токсичности);
II) эффективное нетоксическое количество препарата, выбранного из группы, включающей:
а) нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), например, в количестве от около 30 мг до около 100 мг (например, от 30 до 60 мг трометаниновой соли кеторалака (имеющегося в продаже под торговой маркой Toradol) и от 50 до 100 мг диклофенака или диклофенака натрия (например, имеющегося в продаже под торговой маркой Voltarol)); и
б) эффективное нетоксическое количество химиотерапевтического агента (противораковый агент или препарат, пригодный для лечения рака и т.д.),
и их комбинации предпочтительно с
III) антиоксидантом, например витамином C (в одном варианте реализации - 25 г витамина C) для
а) лечения рака у больной и
б) профилактики метастазирования у пациента, страдающего раком.

Кроме того, заявители предложили применение
А) дозированного количества фармацевтической композиции для инъекции (в пригодной форме для инъекции), и указанное дозированное количество помещено в контейнер или флакон для инъекции и содержит эффективное количество противоракового препарата и/или препарата, пригодного к использованию для лечения рака (например, рака молочной железы, в случае которого дозированное количество инъецируется в каждую опухоль молочной железы) (например, от около 1 до около 2 мг Mitoxantrone), и эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или фармацевтически приемлемых ее солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000 - 225000 дальтон) (например, от около 10 до около 20 мг гиалуроната натрия), в стерильной воде; и
Б) дозированное количество, включающее
I) эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, (например, гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно, гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000 - 225000 дальтон), например, около 100 - 200 мг или более (ввиду отсутствия токсичности);
II) эффективное нетоксичное количество препарата, выбранного из группы, включающей:
а) нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), например, в количестве от около 30 мг до около 100 мг (например, от 30 до 60 мг трометаниновой соли кеторалака (имеющегося в продаже под торговой маркой Toradol) и от 50 до 100 мг диклофенака или диклофенака натрия (например, имеющегося в продаже под торговой маркой Voltarol)); и
б) эффективное нетоксическое количество химиотерапевтического агента (противораковый агент или препарат, пригодный для лечения рака);
и их сочетания предпочтительно с
III) антиоксидантом, например витамином C (в одном варианте реализации - 25 г витамина C) для
а) лечения рака у больной,
б) профилактики метастазирования у пациента, страдающего раком и/или
в) доставки препарата в лимфатическую систему и/или печень.

Заявители, кроме того, предложили использование
I) нетоксического дозированного количества фармацевтического состава для инъекции (в пригодной форме для инъекции), причем указанное дозированное количество находится в контейнере или флаконе для инъекции и включает эффективное количество противоракового препарата и/или препарата, пригодного к использованию для лечения рака (например, рака молочной железы, в случае которого дозированное количество инъецируется в каждую опухоль молочной железы) (например, от около 1 до около 2 мг Mitoxantrone), и эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или фармацевтически приемлемых ее солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000-225000 дальтон) (например, от около 10 до около 20 мг гиалуроната натрия), в стерильной воде; и
II) нетоксического дозированного количества, включающего
1) эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000-225000 дальтон), например, около 100-200 мг или более (ввиду отсутствия токсичности);
2) препарат, выбранный из группы, включающей:
а) нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), например, в количестве от около 30 мг до около 100 мг (например, от 30 до 60 мг трометаниновой соли кеторалака (имеющегося в продаже под торговой маркой Toradol) и от 50 до 100 мг диклофенака или диклофенака натрия (например, имеющегося в продаже под торговой маркой Voltarol)); и
б) терапевтически эффективное нетоксическое дозированное количество химиотерапевтического агента (противораковый агент или препарат, пригодный для лечения рака);
и их сочетание предпочтительно с
III) антиоксидантом, например витамином C (при одном осуществлении - 25 г витамина C) для
а) лечения рака у больной,
б) профилактики метастазирования у пациента, страдающего раком, и/или
в) доставки препарата в лимфатическую систему и/или печень.

Заявителями также предложены
А) эффективное нетоксическое дозированное количество противоракового препарата и/или препарата, пригодного к использованию для лечения рака (например, рака молочной железы, в случае которого дозированное количество инъецируется в каждую опухоль молочной железы) (например, от около 1 до около 2 мг (Mitoxantrone), и эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или фармацевтически приемлемых ее солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000-225000 дальтон) (например, от около 10 до около 20 мг гиалуроната натрия), в стерильной воде; и
Б) дозированное количество, включающее
I) эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, например гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно гиалуроната натрия, имеющего молекулярный вес менее 750000 дальтон (например, 150000-225000 дальтон), например, около 100-200 мг или более (ввиду отсутствия токсичности);
II) препарат, выбранный из группы, включающей:
а) нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), например, в количестве от около 30 мг до около 100 мг (например, от 30 до 60 мг трометаниновой соли кеторалака (имеющегося в продаже под торговой маркой Toradol) и от 50 до 100 мг диклофенака или диклофенака натрия (например, имеющегося в продаже под торговой маркой Voltarol)); и
б) эффективное нетоксическое дозированное количество химиотерапевтического агента (например, противораковый агент или препарат, пригодный для лечения рака);
и их сочетания предпочтительно с
III) антиоксидантом, например витамином C (при одном осуществлении - 25 г витамина C), для изготовления двух фармацевтических составов, одного - из компонентов (А) и другого - из компонентов (Б), каждый для лечения рака, профилактики метастазирования и/или доставки препарата в лимфатическую систему и/или печень.

Подходящие формы гиалуроната натрия могут включать фракцию, поставляемую компанией "Hyal Pharmaceutical Corporation" в 15 мл флаконах гиалуроната натрия в концентрации 20 мг/мл (300 мг/флакон - партия 2F3). Фракция гиалуроната натрия является 2% раствором со средним молекулярным весом приблизительно 225000 дальтон. Фракция также содержит воду в требуемом количестве, которая была подвергнута тройной дистилляции и является стерильной в соответствии с требованиями Фармакопеи США для инъекционных составов. Флаконы гиалуроновой кислоты и/или ее солей могут быть изготовлены из боросиликатного стекла типа 1, закрыты бутиловыми пробками, которые не вступают в реакцию с содержимым флакона.

Фракция гиалуроновой кислоты и/или ее солей (например, натриевая соль) и гомологи, аналоги, производные, комплексы, эфиры, фрагменты и субъединицы гиалуроновой кислоты, предпочтительно гиалуроновая кислота и ее соли, могут включать гиалуроновую кислоту и/или ее соли, имеющие следующие характеристики:
очищенная, по-существу, апирогенная фракция гиалуроновой кислоты, полученная из естественного источника, имеющая по крайней мере одну характеристику, выбранную из группы (а предпочтительно все характеристики), включающей следующие характеристики:
I) молекулярный вес в области 150000 - 225000 дальтон;
II) менее чем около 1,25% сульфатированных мукополисахаридов на основании общего веса;
III) менее чем около 0,6% белка на основании общего веса;
IV) менее чем около м.д. железа от общего веса;
V) менее чем около 15 м.д. свинца от общего веса;
VI) менее 0,0025% глюкозамина;
VII) менее 0,025% глюкоуроновой кислоты;
VIII) менее 0,025% N-ацетилглюкозамина;
IX) менее 0,0025% аминокислот;
X) коэффициент ультрафиолетового затухания при 257 нм менее чем около 0,275;
XI) коэффициент ультрафиолетового затухания при 280 нм менее чем около 0,25;
XII) pH в пределах 7,3-7,9.

Предпочтительно, гиалуроновую кислоту смешивают с водой, и фракция гиалуроновой кислоты имеет средний молекулярный вес в пределах 150000 - 225000. Более предпочтительно, чтобы фракция гиалуроновой кислоты имела по крайней мере одну характеристику, выбранную из группы (предпочтительно, все характеристики), включающей следующие характеристики:
I) менее чем около 1% сульфатированных мукополисахаридов на основании общего веса;
II) менее чем около 0,4% белка на основании общего веса;
III) менее чем около 100 м.д. железа от общего веса;
IV) менее чем около 10 м.д. свинца от общего веса;
V) менее 0,00166% глюкозамина;
VI) менее 0,0166% глюкуроновой кислоты;
VII) менее 0,0166% N-ацетилглюкозамина;
VIII) менее 0,00166% аминокислот;
IX) коэффициент ультрафиолетового затухания при 257 нм менее чем около 0,23;
X) коэффициент ультрафиолетового затухания при 280 нм менее чем около 0,19; и
XII) pH в пределах 7,5-7,7.

Заявители также предлагают использовать гиалуронат натрия, производимый и поставляемый компанией "Life Core^TM Biomedical Inc.", имеющий следующие спецификации:
Характеристики - Спецификация
Внешний вид - Частицы от белого до кремового цвета
Запах - Без ощутимого запаха
Средняя вязкость
Молекулярный вес - <750000 дальтон
Скенограмма в УФ/видимом спектре, 190-820 нм - Соответствует эталонной скенограмме
Оптическая плотность при 260 нм, ед. опт. плотн. - <0,25
Инфракрасная скенограмма - Соответствует эталону
pH, раствор 10 мг/г - 6,2-7,8
Вода, % - Максимум 8
Белок, мкг/мг NaHy - <0,3
As - 2
Cd - 5
Cr - 5
Co - 10
Cu - 10
Fe - 25
Pb - 10
Hg - 10
Ni - 5
Микробный биологический груз - Не наблюдается
Эндотоксин, Е/мг NaHy - <0,07
Другая форма гиалуроната натрия продается под названием "Hyaluronan HA-M5070" фирмой "Skymart Enterprises, Inc." и имеет следующие характеристики:
Спецификации - Результаты теста
N партии - HG1004
pH - 6,12
Хондроитин сульфат - Не выявлен
Белок - 0,05%
Тяжелые металлы, м.д. - Не более 20
Мышьяк, м.д. - Не более 2
Потеря при высушивании, % - 2,07
Остаток после сгорания, % - 16,69
Внутренняя вязкость, dl/S (XW: 679,000) - 12,75
Азот, % - 3,14
Анализ, % - 104,1
Количество бактерий, /г - 80
E.coli - Отрицательный
Плесневые и дрожжевые грибы, /г - Не более 50
Другие формы гиалуроновой кислоты и/или ее солей, и аналогов, гомологов, производных, комплексов, эфиров, фрагментов и субъединиц гиалуроновой кислоты можно выбрать и других поставщиков, например у поставщиков, указанных в ранее опубликованных документах в этой области, при условии, что выбранная форма гиалуроновой кислоты пригодна для переноса лекарственного препарата.

Следующие ссылки информируют о гиалуроновой кислоте, ее источниках процессах ее производства и получения, которые могут оказаться подходящими.

В патенте США 4141973 предложены фракции гиалуроновой кислоты (включая натриевые соли), имеющие:
а) средний молекулярный вес больше 750000, предпочтительно больше 1200000, то есть ограничивающая величина вязкости больше 1400 см³/г и предпочтительно больше 2000 см³/г.

б) содержание белка менее 0,5% по весу;
в) поглощение ультрафиолетового излучения 1% раствора гиалуроната натрия менее 3 при длине волн 257 нм и менее 2 при длине волн 280 нм;
г) кинематическая вязкость 1% раствора гиалуроната натрия в физиологическом буфере больше, чем приблизительно 1000 сСт, предпочтительно больше 10000 сСТ;
д) молярное оптическое вращение 0,1 - 0,2% раствора гиалуроната натрия в физиологическом буфере меньше -11·10^-3 градусов - см²/моль (дисахарида), измеренная при 220 нм;
е) отсутствие существенной клеточной инфильтрации стекловидного тела и передней камеры, отсутствие свечения водянистой влаги, отсутствие помутнения или свечения стекловидного тела и отсутствие патологических изменений в роговице, хрусталике, радужной оболочке, сетчатке и сосудистой оболочки глаза обыкновенной ночной обезьяны, когда один миллилитр 1% раствора гиалуроната натрия, растворенного в физиологическом буфере, имплантируется в стекловидное тело, замещая приблизительно половину существующего жидкого стекловидного тела, причем указанные фракции гиалуроновой кислоты являются
ж) стерильными и апирогенными и
з) неантигенными.

В патенте 1205031, опубликованном в "Canadian letters" (в котором имеется ссылка на патент США 4141973 в качестве описания уровня техники) ссылаются на фракции гиалуроновой кислоты, имеющие средний молекулярный вес от 50000 до 100000; от 250000 до 35000 и от 500000 до 730000, и обсуждены процессы их производства.

Далее изобретение проиллюстрировано со ссылкой на следующие данные, относящиеся к лицам, страдающим раком. Схема дозированных количеств, получаемых каждым пациентом, закреплена и обозначена буквой, используемой для идентификации пациента. Хронология введения дозированных количеств в каждой схеме дана в обратном порядке с дозой, введенной самой первой, находящейся в конце схемы, а последней дозой, находящейся в начале схемы.

Пациенты, подвергнутые лечению
Пример 1
Больная А - возраст 42 года (женщина):
- рак молочной железы, занимающий всю молочную железу, ранее не лечилась;
- получала лечение неспецифическими; противовоспалительными препаратами, аскорбатом натрия, ГК внутривенно в сочетании с системной терапией;
- в 4-х случаях также получала инъекции Novantrone/ГК;
- полный эффект с тотальной регрессией местной опухоли, отсутствие каких-либо метастазов;
- дозировки см. в Схеме А, приведенной в конце описания (ГК = гиалуронат натрия, имеющий молекулярный вес меньше 750000 дальтон).

Пример 2
Больная В - возраст 60 лет (женщина):
- местный рецидив после региональной резекции;
- получала лечение прямой инъекцией Novantrone/ГК в дозе 1 мг в сочетании с 10 кг ГК в 4 различных сроках;
- также получала внутривенно неспецифические противовоспалительные препараты/ГК;
- регрессия ее опухоли составила 75% ее первоначального размера в течение 1,5 лет;
- не было никаких метастазов;
- дозировки см. в Схеме Б, приведенной в конце описания.

Пример 3
Больная В (женщина):
- получала дозы по Схеме В, приведенной в конце описания, включая прямую инъекцию в опухоли (ВО) молочной железы, включая прямую инъекцию и внутривенное введение (в/в);
- к удивлению, опухоли исчезли без метастазов.

Пример 4
Больная Г (женщина):
- получала дозы по Схеме Г, приведенной в конце описания, включая прямую инъекцию в опухоли (ВО) молочной железы, включая прямую инъекцию и внутривенное введение (в/в);
- больная не поддалась болезни.

Пример 5
Больная Д - возраст 55 лет (женщина):
- карцинома молочной железы, по поводу которой получала лечение только внутривенным введением противовоспалительных препаратов/ГК и аскорбата натрия (а также прямыми инъекциями);
- в течение последних трех лет не было метастазов из опухолевого очага в надключичные лимфоузлы;
- дозировки см. в Схеме Д, приведенной в конце описания.

Пример 6
Больная К - возраст 73 года (женщина):
- карцинома молочной железы с метастазами в печень, по поводу чего в течение 3 лет получала лечение внутривенным введением противовоспалительных препаратов, ГК, аскорбата натрия в сочетании с внутривенной (в/в) химиотерапией;
- опухоль не увеличивалась, затем начала расти, но за все это время метастазов не было (инъекций в молочную железу не получала; хотя делались инъекции в шейные лимфоузлы на левой стороне);
- она прекратила лечение ввиду ее возраста;
- дозировки см. в Схеме Е, приведенной в конце описания.

Пример 7
Больная Ж - возраст 56 лет (женщина):
- карцинома молочной железы с метастазами в наключичные лимфоузлы, заболевание не прогессировало в течение 4 лет в результате периодического лечения внутривенным введением противовоспалительных препаратов, аскорбата натрия и ГК;
- прямых инъекций не производили;
- дозированные количества см. в Схеме Ж, приведенной в конце описания.

Пример 8
Больная З - возраст 81 год (женщина):
- карцинома правого легкого с метастазами в средостение при диагностике;
- получала лечение еженедельным внутривенным введением противовоспалительных препаратов, аскорбата натрия и ГК;
- опухоль не прогрессировала, не давала метастазов, и в конце был отмечен ее некоторый локальный рост;
- лечение было прекращено, так как больной был 81 год, она была беспомощна и не хотела продолжать лечение;
- она умерла от сердечной недостаточности;
- дозированные количества см. в Схеме З, приведенной в конце описания.

Пример 9
Пациент И - возраст 64 года (мужчина):
- рак простаты, не отмечено никакого прогрессирования на фоне внутривенного введения противовоспалительных препаратов, ГК и аскорбата натрия;
- дозы см. в Схеме И, приведенной в конце описания.

Пример 10
Пациент К - возраст 64 года (мужчина):
- карцинома толстой и прямой кишки с метастазами в печень, не прогрессирует и не метастазирует в течение 2 лет;
- получал лечение от одного до двух раз в неделю внутривенным введением аскорбата натрия/ГК и неспецифических противовоспалительных препаратов;
- дозированные количества см. в Схеме К, приведенной в конце описания.

Следующие ниже дополнительные экспериментальные данные иллюстрируют результаты лечения больных раком молочной железы. В течение ряда лет заявители экспериментально применяли системное введение этим больным неспецифических противовоспалительных препаратов, аскорбата натрия и ГК. Всего проведено экспериментальное лечение 63 больных, у которых, по возможности, была выполнена самая щадящая хирургическая операция. При наличии положительных результатов анализа на рецепторы эстрогена или прогестерона больные получали агенты, блокирующие гормоны. Лишь в отдельных случаях была произведена овариэктомия. Заявители использовали низкие дозы химиотерапии, применяя метотрексат (100 мг/100 мг ГК в первый день) и 5-фторурацил (5-ФУ) (350 - 500 мг/100 мг ГК на второй и третий дни), первоначально без ГК, а в последующем с ГК в инъекции.

В случаях, когда опухоль расценивали как более агрессивную, использовали сочетание из четырех препаратов в инъекциях (см. таблицу 1).

Таблица 1
Лечение по поводу рака молочной железы
1. Операция:
Модифицированная радикальная мастэктомия - 23 пациента
Сегментарная резекция и удаление лимфоузлов - 40 пациентов
2. Воздействие на гормональный статус:
Назначение тамоксифена - 33/63 пациентов
Хирургическая овариэктомия - 3/63 пациентов
3. Химиотерапия:
Комбинация МТК (митоксантрона) + 5-ФУ (5-фторурацил)
или
комбинация новантрона, 5-ФУ,
митомицина C, МТК (митоксантрона)
4. Лучевая терапия:
Один случай.

5. Гипертермия:
EMW 915 MHz области раковой опухоли - c 1982 г. все больные.

6. Иммуномодуляция:
а) усиление неспецифического иммунного ответа,
б) модификация с помощью ингибиторов простагландина E2 и аскорбата натрия.

Облучения избегали. У этих больных применялась гипертермия с помощью микроволной методики для усиления действия препаратов. Таким образом достигали выживания в течение девяти лет в 90% случаев (см. таблицу 2).

Таблица 2
Рак молочной железы. Больные и выживание
Количество больных - 63
Стадия заболевания - I - 14 - II - 49
Возраст - 27 - 75 лет
средний возраст - 43 года
Количество выживших с излеченным раком - 55
Средняя продолжительность выживания в годах - 8
Количество выживших с наличием заболевания - 6
Количество умерших от заболевания - 2
По этим результатам очевидно, что умеренные дозы химиотерапии с добавлением неспецифических противовоспалительных препаратов и введением препаратов в ГК привели к повышению выживаемости в группе больных с высоким риском рецидива заболевания.

Альтернативное экспериментальное лечение по поводу локального рака молочной железы в сочетании или без системных заболеваний также является аспектом настоящего изобретения. В одной группе больных первые четыре пациента оказались от операции и/или облучения. У одной больной наблюдался рецидив в обеих молочных железах после облучения; у другой больной после облучения при поступлении обнаружены метастазы в кости скелета. Проведены инъекции митоксантрона в дозе 1 мг в 10 мг ГК от 1 до 6 раз до тех пор, пока опухоль не исчезла.

Дополнительно проведена системная химиотерапия в ГК и гипертермия. В случаях необходимости, использованы препараты, блокирующие гормоны. Всего таким образом лечению подвергнуты 10 пациентов. У всех отмечен полный эффект в плане обратного развития местного патологического процесса (см. таблицу 3).

Таблица 3
Альтернативное экспериментальное лечение рака молочной железы
Больные:
1. В течение ряда лет 10 пациентов получали экспериментальное лечение:
С рецидивом после операции - 4
С рецидивом после лучевой терапии - 1
Поражение обеих молочных желез - 5
2. У 1 из 10 при установлении диагноза были отдаленные метастазы; у всех были поражены подмышечные лимфоузлы.

Результаты:
- у 10 из 10 полный эффект в плане реакции очага и региональных лимфоузлов;
- 2 из 10 (первые пациенты) умерли вследствие системного заболевания;
- 8 из 10 живы и хорошо себя чувствуют.

Средний срок выживания 3 года.

Косметический результат отличный.

Местная реакция не была избыточной, хотя она состояла в первоначальном увеличении площади участка опухоли. Что было впечатляющим, так это возврат молочной железы к норме в некоторых случаях и лишь незначительная рубцовая ткань, выявляемая при маммографии, у других пациентов.

Это уникальный способ лечения. Представляется, что препараты, введенные в ГК, почти исключительно действуют на опухолевую ткань и не оказывают существенного влияния на нормальную ткань.

Поскольку возможно большое количество изменений дозированных количеств, использованных в примерах, без отклонений от диапазона изобретений, предлагается, что весь содержащийся здесь материал будет интерпретироваться как иллюстрация изобретения, а не в ограничивающем смысле. Т Т Т Т Тп

Формула изобретения

1. Способ лечения рака у человека для профилактики или уменьшения метастазирования, включающий введение эффективного дозированного количества гиалуроновой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемой соли, имеющей молекулярный вес менее 750000 дальтон, в сочетании с химиотерапевтическим агентом, отличающийся тем, что лечение состоит из этапа прямой инъекции в опухоль нетоксического дозированного количества фармацевтической композиции, содержащей эффективное нетоксическое количество противоракового препарата и/или препарата, пригодного для лечения рака, и формы гиалуроновой кислоты, выбранной из группы, включающей гиалуроновую кислоту и/или ее фармацевтически приемлемые соли и их сочетания, в стерильной воде и этапа системного введения нетоксического дозированного количества фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество формы гиалуроновой кислоты, выбранной из группы, включающей гиалуроновую кислоту и ее фармацевтически приемлемые соли, а также препарат, выбранный из группы, включающей нестероидный противовоспалительный препарат (НСПВП), химиотерапевтический агент и, необязательно, антиоксидант, и повторения указанных этапов так часто, как может потребоваться для профилактики или уменьшения метастазирования.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что композиция для системного введения содержит предпочтительно гиалуронат натрия, имеющий молекулярный вес меньше 750000 дальтон.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что системное введение фармацевтической композиции сочетают с введением антиоксидантов.

4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что частота лечения составляет от одного до четырех раз ежемесячно или более.

5. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что формой рака является рак молочной железы и частота лечения составляет от одного до трех раз ежемесячно и более.

6. Способ по пп.1 - 5, отличающийся тем, что системное введение осуществляют путем внутривенного введения.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125, Рисунок 126, Рисунок 127, Рисунок 128, Рисунок 129, Рисунок 130, Рисунок 131, Рисунок 132, Рисунок 133, Рисунок 134, Рисунок 135, Рисунок 136, Рисунок 137, Рисунок 138, Рисунок 139, Рисунок 140, Рисунок 141, Рисунок 142, Рисунок 143, Рисунок 144, Рисунок 145, Рисунок 146, Рисунок 147, Рисунок 148, Рисунок 149, Рисунок 150, Рисунок 151, Рисунок 152, Рисунок 153, Рисунок 154, Рисунок 155, Рисунок 156, Рисунок 157, Рисунок 158, Рисунок 159, Рисунок 160, Рисунок 161, Рисунок 162, Рисунок 163, Рисунок 164, Рисунок 165, Рисунок 166, Рисунок 167, Рисунок 168, Рисунок 169, Рисунок 170, Рисунок 171, Рисунок 172, Рисунок 173, Рисунок 174, Рисунок 175, Рисунок 176, Рисунок 177, Рисунок 178, Рисунок 179, Рисунок 180, Рисунок 181, Рисунок 182, Рисунок 183, Рисунок 184, Рисунок 185, Рисунок 186, Рисунок 187, Рисунок 188, Рисунок 189, Рисунок 190, Рисунок 191, Рисунок 192, Рисунок 193, Рисунок 194, Рисунок 195, Рисунок 196, Рисунок 197, Рисунок 198, Рисунок 199, Рисунок 200, Рисунок 201, Рисунок 202, Рисунок 203, Рисунок 204, Рисунок 205, Рисунок 206, Рисунок 207, Рисунок 208, Рисунок 209, Рисунок 210, Рисунок 211, Рисунок 212, Рисунок 213, Рисунок 214, Рисунок 215, Рисунок 216, Рисунок 217, Рисунок 218, Рисунок 219, Рисунок 220, Рисунок 221, Рисунок 222, Рисунок 223, Рисунок 224, Рисунок 225, Рисунок 226, Рисунок 227, Рисунок 228, Рисунок 229, Рисунок 230, Рисунок 231, Рисунок 232, Рисунок 233, Рисунок 234, Рисунок 235, Рисунок 236, Рисунок 237, Рисунок 238, Рисунок 239, Рисунок 240, Рисунок 241, Рисунок 242, Рисунок 243, Рисунок 244, Рисунок 245, Рисунок 246, Рисунок 247, Рисунок 248, Рисунок 249, Рисунок 250, Рисунок 251, Рисунок 252, Рисунок 253, Рисунок 254, Рисунок 255, Рисунок 256, Рисунок 257, Рисунок 258, Рисунок 259, Рисунок 260, Рисунок 261, Рисунок 262, Рисунок 263, Рисунок 264, Рисунок 265, Рисунок 266, Рисунок 267, Рисунок 268, Рисунок 269, Рисунок 270, Рисунок 271, Рисунок 272, Рисунок 273, Рисунок 274, Рисунок 275, Рисунок 276, Рисунок 277, Рисунок 278, Рисунок 279, Рисунок 280, Рисунок 281, Рисунок 282, Рисунок 283, Рисунок 284, Рисунок 285, Рисунок 286, Рисунок 287, Рисунок 288, Рисунок 289, Рисунок 290, Рисунок 291, Рисунок 292, Рисунок 293, Рисунок 294, Рисунок 295, Рисунок 296, Рисунок 297, Рисунок 298, Рисунок 299, Рисунок 300, Рисунок 301, Рисунок 302, Рисунок 303, Рисунок 304, Рисунок 305, Рисунок 306, Рисунок 307, Рисунок 308, Рисунок 309, Рисунок 310, Рисунок 311, Рисунок 312, Рисунок 313, Рисунок 314, Рисунок 315, Рисунок 316, Рисунок 317, Рисунок 318, Рисунок 319, Рисунок 320, Рисунок 321, Рисунок 322, Рисунок 323, Рисунок 324, Рисунок 325, Рисунок 326, Рисунок 327, Рисунок 328, Рисунок 329, Рисунок 330, Рисунок 331, Рисунок 332, Рисунок 333, Рисунок 334, Рисунок 335, Рисунок 336, Рисунок 337, Рисунок 338, Рисунок 339, Рисунок 340, Рисунок 341, Рисунок 342, Рисунок 343, Рисунок 344, Рисунок 345, Рисунок 346, Рисунок 347, Рисунок 348, Рисунок 349, Рисунок 350, Рисунок 351, Рисунок 352, Рисунок 353, Рисунок 354, Рисунок 355, Рисунок 356, Рисунок 357, Рисунок 358, Рисунок 359, Рисунок 360, Рисунок 361, Рисунок 362, Рисунок 363, Рисунок 364, Рисунок 365, Рисунок 366, Рисунок 367, Рисунок 368, Рисунок 369, Рисунок 370, Рисунок 371, Рисунок 372, Рисунок 373, Рисунок 374, Рисунок 375, Рисунок 376, Рисунок 377, Рисунок 378, Рисунок 379, Рисунок 380, Рисунок 381, Рисунок 382, Рисунок 383, Рисунок 384, Рисунок 385, Рисунок 386, Рисунок 387, Рисунок 388, Рисунок 389, Рисунок 390, Рисунок 391, Рисунок 392, Рисунок 393, Рисунок 394, Рисунок 395, Рисунок 396, Рисунок 397, Рисунок 398, Рисунок 399, Рисунок 400, Рисунок 401, Рисунок 402, Рисунок 403, Рисунок 404, Рисунок 405, Рисунок 406, Рисунок 407, Рисунок 408, Рисунок 409, Рисунок 410, Рисунок 411, Рисунок 412, Рисунок 413, Рисунок 414, Рисунок 415, Рисунок 416, Рисунок 417, Рисунок 418, Рисунок 419, Рисунок 420, Рисунок 421, Рисунок 422, Рисунок 423, Рисунок 424, Рисунок 425, Рисунок 426, Рисунок 427, Рисунок 428, Рисунок 429, Рисунок 430, Рисунок 431, Рисунок 432, Рисунок 433, Рисунок 434, Рисунок 435, Рисунок 436, Рисунок 437, Рисунок 438, Рисунок 439, Рисунок 440, Рисунок 441, Рисунок 442, Рисунок 443, Рисунок 444, Рисунок 445, Рисунок 446, Рисунок 447, Рисунок 448