Штамм paramyxovirus canis, используемый для контроля антигенной активности вакцин и получения специфической сыворотки и антигена для диагностики парамиксовирусной инфекции собак

 

Штамм Paramyxovirus canis "Рикан" получен из изолята вируса Paramyxovirus canis, выделенного от больного двухмесячного щенка породы ротвейлер с признаками острого респираторного заболевания, путем последовательных пассажей на первично трипсинизированной культуре клеток почки щенка собаки (ПЩ). Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер 33 ДЕП. Штамм обладает стабильной инфекционной активностью в культуре клеток и гемагглютинирующей активностью в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Способен индукцировать образование специфических антител у лабораторных животных в титрах 1:64 - 1:256. Использование штамма Paramyxovirus canis "Рикан" ВГНКИ 33 в производственных условиях позволит с большой достоверностью судить о качестве биопрепаратов против парамиксовирусной инфекции собак, а также дает возможность проводить серологическую диагностику данного заболевания.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к новому штамму Paramyxovirus canis, используемому для контроля антигенной активности вакцин и получения специфической сыворотки и антигена для диагностики парамиксовирусной инфекции у собак.

Известны штамм Paramyxovirus canis "C-6A" и штамм Paramyxovirus canis "C-958", используемые для воспроизведения инфекции и получения специфических сывороток для диагностики парамиксовирусной инфекции у собак (1, 2).

Указанные штаммы, используемые в качестве специфического антигена, и получаемые с их использованием специфические сыворотки для диагностики парамиксовирусной инфекции у собак не являются достаточно активными. Кроме того, известные штаммы не применялись для контроля антигенной активности вакцин против парагриппа собак.

Целью изобретения является получение культурального штамма парамиксовируса собак, обладающего стабильной инфекционной и гемагглютинирующей активностью, который может быть использован для контроля антигенной активности вакцин и получения специфической сыворотки и антигена для диагностики парамиксовирусной инфекции у собак.

Штамм Paramyxovirus canis "Рикан" получен из выделенного в 1994 году изолята вируса Paramyxovirus canis от больного двухмесячного щенка породы ротвейлер с признаками острого респираторного заболевания путем последовательных пассажей на первично трипсинизированной культуре клеток почки щенка собаки (ПЩ).

Штамм депонирован в коллекцию микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер - 33 ДЕП.

Штамм Paramyxovirus canis "Рикан" ВГНКИ N 33 характеризуется следующими признаками и свойствами: Морфологические свойства.

Вирионы имеют неправильную сферическую форму, липопротеидную оболочку со слабо различимыми пепломерами. Диаметр вирионов колеблется от 120 до 200 нм.

Культуральные свойства.

Штамм хорошо размножается в культуре клеток ПЩ, MDCK. Вызывает цитопатическое действие (ЦПД). При культивировании в первично-трипсинизированной культуре клеток ПЩ и в перевиваемой культуре клеток почки собаки MDCK титр вируса составляет 5,75 lg ТЦД_50/см3 Цитопатическое действие вируса штамма "Рикан" в использованных культурах проявляется образованием синтициев, появлением скоплений округлившихся клеток с зернистостью цитоплазмы, постепенно дегенерированные клетки отделяются от стекла в виде "косичек" и образуют окна.

Антигенные свойства.

Штамм "Рикан" при подкожном и внутривенном введении кроликам индуцирует образование вируснейтрализующих антител и тормозящих гемагглютинацию антител в титрах 1:64 - 1:256.

Вирулентность.

При интратрахеальном заражении 6-8-недельных интактных щенков культуральной расплодкой штамма в дозе 2·10^5,75 ТЦД 50/см³ клинические признаки парамиксовирусной инфекции (парагриппа) проявляются у всех щенков на 5-7 сутки. У животных отмечают снижение аппетита, кашель, ринит, катаральный конъюнктивит. На 6 - 8 сутки у 75% щенков наблюдается кратковременный подъем температуры тела до 40 - 40,5^oC. На 8-9 день болезни происходит выздоровление животных.

Стабильность основных свойств штамма.

Штамм "Рикан" сохраняет стабильную инфекционную и антигенную активность на протяжении 15 пассажей.

Серологические свойства.

Титр вируснейтрализующих антител гипериммунной сыворотки против парагриппозной инфекции в реакции нейтрализации (PH) 1:64 - 1:128.

Гемагглютинирующие свойства.

Штамм "Рикан" агглютинирует эритроциты морской свинки в разведении 1:8 - 1:128 при pH - 6,6 - 7,2, при температуре 2-4^oC.

Безвредность для лабораторных животных.

Штамм парамиксовируса собак "Рикан" безвреден для белых мышей, морских свинок и кроликов при внутримышечном внутривенном и подкожном введении.

Дополнительные сведения о штамме.

Штамм "Рикан" свободен от бактериальных, микоплазменных, грибковых и вирусных контаминантов.

Способность штамма к распространению в естественных условиях.

Заражение животных в окружающей среде происходит аэрогенно и через контакт с больными животными и с их выделениями. Инкубационный период 3-5 дней.

Основные условия хранения.

Штамм "Рикан" парамиксовируса собак, лиофилизированный со стабилизирующими добавками, сохраняет активность при -20^oC два года.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами: Пример 1.

Проводят оценку антигенной активности вируса парагриппа в вакцине Nobivac -DHPPi производства фирмы "Интервет Интернейшинел Б.В." Нидерланды (сер. 8117 В) против чумы плотоядных, инфекционного гепатита, парвовирусного энтерита и парагриппа собак. Для этого собак 2-4-месячного возраста вакцинируют указанной вакциной в дозе 1 см³ согласно наставлению по применению. Перед вакцинацией и через 21 день у всех привитых щенков берут пробы крови и получают сыворотки крови.

Для определения титра вируснейтрализующих антител к парамиксовирусу собак полученные сыворотки исследуют в pН с 100 ТЦД_50/см3 штамма "Рикан" в перевиваемой культуре клеток МДСК. В качестве положительной контрольной сыворотки в pH используют специфическую диагностическую сыворотку к парамиксовирусу собак, полученную как описано ниже в примере 2. Оценку реакции проводят через 7 суток по развитию ЦПД в культуре клеток. Титр вируснейтрализующих антител в сыворотках крови привитых собак составляет 1:32 - 1:256. При сравнении результатов титрования сывороток, полученных от собак перед вакцинацией и после, отмечают, что у всех подопытных животных титры специфических антител к возбудителю парагриппа возрастают в 2-4 и более раз.

Таким образом установлено, что парагриппозный компонент в вакцине Nobi-vac-DHPPi является активным и, следовательно, вакцина по данному компоненту пригодна для использования.

Пример 2.

Получают специфическую сыворотку для диагностики парагриппозной инфекции у собак. Для этого иммунизируют кроликов 3-кратно с интервалом в 21 день. При иммунизации животных используют нативный парамиксовирус собак из штамма "Рикан" с титром 5,75 lg ТЦД_50/см3. С целью повышения специфичности сыворотки вирус осветляют и концентрируют ультрацентрифугированием при скорости 40000 об/мин, в течение 2 часов. Сконцентрированный вирус вводят кроликам: первоначально - внутривенно в объеме 1,0 см³, второй и третий раз - подкожно с адъювантом Фрейнда 1:1 в объеме 4,0 см³. Через две недели после последней иммунизации проводят обескровливание животных и получают сыворотку общепринятым методом отстоя. Затем сыворотку разливают в стерильные ампулы по 1 см³ и подвергают лиофильной сушке. Высушенный препарат имеет вид светло-бежевой таблетки. Перед титрованием содержимое 1 ампулы растворяют в 1 см³ физиологического раствора хлорида натрия. Устанавливают титр полученной сыворотки в pH (1:64 - 1:128) и в РТГА (1:256 - 1:512). Лиофилизированную сыворотку хранят при температуре 4^oC в течение 24 месяцев.

Пример 3.

Диагностическую сыворотку к парамиксовирусу плотоядных, полученную как описано в примере 2, используют для идентификации культуральных изолятов вирусов, выделенных от собак с признаками респираторных заболеваний. Для этого содержимое ампулы с лиофилизированной сывороткой растворяют в 10 см³ ростовой культуральной среды. Исследуемые образцы изолятов соединяют с разведенной сывороткой в соотношении 1:1. Полученную смесь инкубируют 1 час при комнатной температуре и вносят по 1 см³ в пробирки с культурой клеток МДСК на сформированный монослой (по 4 пробирки на каждый образец). Параллельно в 4 другие пробирки с культурой вносят по 1 см³ разведения изолятов 1:2 в поддерживающей культуральной среде. Контролем служат незараженные пробирки с культурой, куда вносят по 1 см³ поддерживающей культуральной среды без сыворотки и вируса. Пробирки помещают в термостат на 7 дней и ежедневно микроскопируют.

Диагностическая сыворотка нейтрализует ЦПД гомологичных изолятов, содержащих парамиксовирус собак, и не влияет на развитие ЦПД в пробах с гетерологичными изолятами, содержащими возбудители других заболеваний плотоядных.

Пример 4.

Получают специфический антиген для обнаружения антител к возбудителю парагриппа собак в РТГА. Для этого культуральную расплодку штамма "Рикан" с активностью 10^5,5 ТЦД 50/см³ инактивируют ультрафиолетовым облучением в течение 40 минут. Инактивированный культуральный вирус соединяют в соотношении 1: 1 со стабилизирующей средой, разливают в ампулы, лиофилизируют по стандартной методике и запаивают под вакуумом.

Готовый препарат в ампуле имеет вид желтовато-белой гомогенной таблетки. Лиофилизированный антиген агглютинирует 1% эритроциты морской свинки в титре 1:64 и сохраняет стабильную активность на протяжении 1 года при хранении при температуре 0 - 8^oC.

Пример 5.

Определяют специфичность парамиксовирусного антигена из штамма "Рикан", полученного по примеру 4, в РТГА со специфической и гетерологичными гипериммунными сыворотками.

Реакцию ставят в микропанелях с U-образными лунками в следующем порядке: - во все лунки вносят по 0,025 см³ фосфатного буферного раствора; - в 1-7-ом рядах лунок готовят двукратные разведения исследуемых сывороток; - в первых 6 лунках 8 ряда готовят двукратные разведения рабочего раствора антигена; - в последних 6 лунках 8-го ряда ставят контроль эритроцитов.

Содержимое каждой ампулы лиофилизированного антигена растворяют в 1 см³ физиологического раствора хлорида натрия. Далее в рядах, содержащих разведения сывороток, в каждую лунку вносят по 0,025 см³ рабочего раствора парамиксовирусного антигена, содержащего 8 ГАЕ; в 8 ряду в каждую лунку дополнительно вносят по 0,025 см³ фосфатного буферного раствора.

Пластинку слегка встряхивают и оставляют для контакта при комнатной температуре. Через 1 час во все лунки вносят по 0,05 см³ 0,75% суспензии формалинизированных эритроцитов морской свинки и помещают панель в холодильник (2-4^oC) на 1,5 часа.

В лунках со специфической диагностической сывороткой к парамиксовирусу собак, полученной по примеру 2, наблюдают четко выраженное торможение агглютинации эритроцитов парамиксовирусным антигеном. В лунках с гетерологичными сыворотками к возбудителям чумы, парвовирусного и коронавирусного энтерита, аденовирусных инфекций плотоядных и к вирусу болезни Ауески торможение отсутствует. Следовательно, полученный антиген для диагностики парагриппа собак в РТГА высокоспецифичен.

Пример 6.

Полученный по примеру 4, специфический парамиксовирусный антиген используют для контроля антигенной активности вируса парагриппа в поливалентной вакцине Vanqard 5/L производства фирмы "Пфайзер" США (сер.4146 1L) против чумы плотоядных, инфекционного гепатита, аденовирусной инфекции, парагриппа и лептоспироза. Для этого собак 2-4 месячного возраста вакцинируют указанной вакциной в дозе 1 см³ согласно наставлению по применению. Перед вакцинацией и через 21 день у всех привитых щенков берут пробы крови и получают сыворотки крови.

Титр тормозящих агглютинацию антител в сыворотках крови определяют в реакции с рабочим раствором лиофилизированного агглютинирующего антигена из штамма "Рикан", содержащего 8 ГАЕ. Реакцию проводят, как описано в примере 5. Положительным контролем при постановке реакции служит сыворотка, полученная по примеру 2.

Сыворотки крови вакцинированных собак тормозят агглютинацию 0,75% эритроцитов морской свинки в разведениях от 1:32 до 1:512. При сравнении результатов титрования сывороток, полученных от собак перед вакцинацией и после, отмечают, что у всех животных титры специфических антител к возбудителю парагриппа собак возрастают в 2-4 и более раз.

Таким образом установлено, что парагриппозный компонент в вакцине Vanqard 5/L является активным и, следовательно, вакцина по данному компоненту пригодна для использования.

Пример 7.

Определяют чувствительность лиофилизированного парамиксовирусного антигена из штамма "Рикан" в РТГА с сыворотками крови клинически здоровых собак и с парными сыворотками крови, полученными с интервалом 12-14 дней, от собак с признаками респираторного заболевания. Исследования проводят аналогично, как это описано в примере 5. Положительным контролем при постановке реакции служит диагностическая сыворотка, полученная по примеру 2.

Титры антител в сыворотках крови здоровых собак составляют 1:16-1:64, а в сыворотках собак с признаками респираторного заболевания вызванного парамиксовирусом - 1:128 - 1:512. У собак инфицированных возбудителем парагриппа отмечают возрастание титров специфических антител в парных сыворотках в 4 и более раз.

Использование штамма Paramyxovirus canis "Рикан" N 33 в производственных условиях позволит с большой достоверностью судить о качестве изготавливаемых и используемых биопрепаратов против парамиксовирусной инфекции собак, а применение его для получения специфической диагностической сыворотки и антигена для постановки РТГА дает возможность проводить серологическую диагностику данного заболевания.

Формула изобретения

Штамм Paramyxovirus canis "Рикан" ВГНКИ N 33-ДЕП, используемый для контроля ангигенной активности вакцин и для получения специфической сыворотки и антигена для диагностики парамиксовирусной инфекции собак.