Препарат-пробиотик в сухой иммобилизованной форме

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаратам медицинского и ветеринарного назначения. Препарат включает носитель, представляющий собой сорбент, и клетки пробиотиков, иммобилизованные на указанном носителе. Клетки пробиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток. Препарат дополнительно содержит защитную среду, а клетки пробиотиков с питательной средой представляют собой сухой концентрат бифидобактерий на молочной основе с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г и содержанием аминокислот (мг/100 г сухой биомассы): глутаминовая кислота 15,0-68,0, глутамин 8,0-20,0, лейцин 10,0-50,0, аргинин 20,0-30,0, цистеин 50,0-80,0, при следующем соотношении компонентов препарата в сухом виде, мас.%: клетки эубиотиков с питательной средой и титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г 0,1-10,0, защитная среда 0,1-10,0, носитель-сорбент остальное до 100%. В качестве защитной среды используют желатин, сахарозу, аскорбиновую кислоту и хлористый натрий при следующем содержании компонентов, мас.%: желатин 8,5-11,5, аскорбиновая кислота 0,8-1,2, хлористый натрий 1,7-3,0, сахароза остальное до 100%. Препарат-пробиотик "Экофлор" в иммобилизованной форме имеет более длительный срок хранения и более эффективное пролонгированное лечебно-профилактическое действие на всех участках желудочно-кишечного тракта за счет более высокой его колонизационной активности. 4 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаратам медицинского и ветеринарного назначения.

В настоящее время проблема дисбактериозов и кишечных дисфункций является по-прежнему актуальной, что обусловлено комплексом причин различного характера: ухудшение экологической ситуации, рост иммунодефицитных состояний, повышенная аллергизация, грубые нарушения микробиоценоза в результате антибактериальной, гормональной или лучевой терапии, а также различных отрицательных социальных факторов и т.д. По данным научных исследований более 90% населения страдает теми или иными формами дисбактериозов и кишечных дисфункций. Это в свою очередь влечет за собой целый спектр заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ, работой иммунной системы, синтезом витаминов и незаменимых аминокислот, их всасыванием, а также поступлением в организм микро- и макроэлементов и т.д.

Для профилактики и лечения многих патологических состояний, обусловленных нарушением эндоэкологии, широкое распространение получили энтеросорбенты. Это различные типы активных углей, например, карбактин, карболонг, микросорб, полифепан и т.д. (Сенов П.Л. Фармацевтическая химия. - М.: Медицина, 1978, с. 132-133; патент РФ N 2029546, МПК⁶ A 61 K 9/16, опубл. 27.02.95 г. ), природные материалы и их аналоги (кристаллическая микроцеллюлоза, цеолиты, хитозаны, пектины и т.д.), синтетические минеральные сорбенты и другие материалы, которые используются для очищения организма от шлаков, радионуклидов, тяжелых металлов и токсинов. Энтеросорбенты снижают эффекты экзо- и эндотоксикозов.

Однако энтеросорбенты не устраняют причин вызывающих эффекты экзо- и эндотоксикозов, как правило, они не селективны, работают в основном на избыток субстрата, могут оказывать негативное действие из-за сорбции нужных для организма метаболитов (витаминов, гормонов) и не обеспечивают активно нормализацию микробиоценоза.

Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая. Для нормализации микробиоценоза широкое распространение получили препараты живых бактериальных клеток: бифидобактерий (межд. заявка (WO) N 85/03848), МКИ A 23 C 9/12, опубл. 12.09.85 г.), лактобактерий (заявка ЕПВ N 0154614, МКИ A 23 C 9/123, опубл. 11.09.85 г.) и колибактерий и т.д.

Недостатком этих препаратов является довольно короткие сроки их хранения, если они находятся в жидкой форме или высокая стоимость, если они изготовлены в сухой форме, а также слабая устойчивость к инактивирующим факторам внешней среды и желудочно-кишечного тракта организма при применении.

Известен комплексный препарат, включающий пористый неорганический носитель и иммобилизованные на нем клетки микроорганизмов (заявка ФРГ N 3410650, МКИ C 12 N 11/14, опубл. 03.10.85 г.). В качестве носителей применяют сталактитовые подложки с двойной структурой пор. Подложки имеют сквозные макропоры, которые делают возможным свободный обмен жидкости и газа из внутренней части носителя в окружающую среду. Размер макропор лежит в пределах величины клеток микроорганизмов.

Недостатком данного препарата является то, что он не предназначен для использования в качестве медицинского или ветеринарного препарата в связи с отсутствием данных о влиянии сталактитового носителя с нанесенными на нем микроорганизмами на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта организма человека или животного.

Известен комплексный фармацевтический препарат, включающий фармацевтически приемлемый носитель и иммобилизованные на нем микроорганизмы (межд. заявка (WO) N 91/09608, МКИ A 61 K 35/74, опубл. 11.07.91 г.). Носитель не нарушает жизнеспособности микроорганизмов. В качестве микроорганизмов используют штамм L1a Streptococcus lactis. Препарат предназначен для борьбы с патогенной микрофлорой кишечника человека и животных, вызывающей диарею и другие желудочно-кишечные расстройства.

Недостатком препарата является то, что используемый в нем штамм L1a Streptococcus lactis влияет в основном на патогенную микрофлору кишечника человека и животных, т. е. проявляет антагонистические свойства, но слабо участвует в восстановлении микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Кроме того отсутствуют данные об антацидных свойствах носителя, что свидетельствует о слабой защите носителем иммобилизованных клеток Streptococcus lactis при действии внутренней среды организма с низкими значениями pH.

Известен комплексный бактериальный препарат, включающий носитель и иммобилизованные на нем микробные клетки в концентрации на 1 мм² 2,1 · 10³ - 1,0 · 10⁵ (патент РФ N 2017486, МПК⁶ A 61 K 31/00, опубл. 15.08.94 г.). В качестве носителя используют активированный уголь в виде порошка с размером частиц менее 30 мкм, а в качестве микроорганизмов используют лактобактерии и кишечные палочки.

Недостатком такого препарата является то, что активированный уголь, используемый в качестве носителя, является тонкопористым сорбентом с преобладанием микропор и высокой удельной поверхностью. Вследствие этого микробные клетки расположены на поверхности частиц сорбента и недостаточно защищены при неблагоприятном воздействии окружающей среды. Активированные угли активно поглощают низкомолекулярные гормоны, витамины и газы кишечника, что ухудшает работу перистальтики. Они быстро забиваются и работают преимущественно в верхних отделах желудочно-кишечного тракта. Кроме того угли не обладают антацидными свойствами, что не способствует выживаемости нанесенных на них клеток при действии сред с низкими значениями pH. Препарат не предусматривает использование одновременно нескольких штаммов микроорганизмов разных видов, например, смеси бифидо- и лактобактерий, что значительно снижает эффективность действия препарата особенно при восстановлении микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является препарат-пробиотик в иммобилизованной форме, включающий носитель, представляющий собой сорбент, и клетки эубиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки эубиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см³/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток при следующем количественном соотношении компонентов препарата, мас.%: Клетки эубиотиков с питательной средой и титром 10⁸ - 10⁸ КОЕ/мл - 1,0-50,0 Носитель-сорбент - Остальное до 100% В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например, энтеросорбент типа СУМС, модифицированный углеродом, или энтеросорбент типа СИАЛ, модифицированный кремнийорганическим полимером. В качестве эубиотиков используют бифидо- или лактобактерии или их смесь (патент РФ N 2118535, МПК⁶ A 61 К 35/74, опубл.10.09.98 г.).

Однако указанный препарат имеет недостаточную колонизационную активность входящих в состав препарата бактерий-эубиотиков вследствие отсутствия стимулирующих добавок, ограниченные сроки хранения (не более 1 года), т.к. не содержит антиоксидантов и других стабилизирующих добавок.

В основу настоящего изобретения поставлена задача создания такого комплексного бактериального препарата-пробиотика "Экофлор" в иммобилизованной форме, который обеспечивал бы более длительный срок хранения препарата и более эффективное пролонгированное лечебно-профилактическое действие на всех участках желудочно-кишечного тракта за счет более высокой его колонизационной активности.

Указанная задача решается тем, что в препарате-пробиотике в иммобилизованной форме, включающем носитель, представляющий собой сорбент, и клетки пробиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки пробиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см³/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток, согласно изобретению, препарат дополнительно содержит защитную среду, а клетки пробиотиков с питательной средой представляют собой сухой концентрат бифидобактерий на молочной основе с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г и содержанием аминокислот (мг/100 г сухой биомассы): Глутаминовая кислота - 15,0-68,0 Глутамин - 8,0-20,0 Лейцин - 10,0-50,0 Аргинин - 20,0-30,0 Цистеин - 50,0-80,0 при следующем соотношении компонентов препарата в сухом виде, мас.%:
Клетки эубиотиков с питательной средой и титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г - 0,1-10,0
Защитная среда - 0,1-10,0
Носитель-сорбент - Остальное - до 100%
В качестве защитной среды используют желатин, сахарозу, аскорбиновую кислоту и хлористый натрий при следующем содержании компонентов, мас.%:
Желатин - 8,5-11,5
Аскорбиновая кислота - 0,8-1,2
Хлористый натрий - 1,7-3,0
Сахароза - Остальное до 100%
В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например, энтеросорбент типа СУМС, модифицированный углеродом.

Препарат в качестве бактерий-пробиотиков дополнительно содержит сухую закваску вязких штаммов ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus типа AB, соотношение которых с сухим концентратом бифидобактерий составляет 1: (8-9) соответственно.

В качестве бифидобактерий в сухом концентрате используют бактерии Bifidum bifidum N 1, или N 791, или ЛВА-3, или Bifidobacterium longum 379, или Bifidobacterium adolescentis MC-42, или смесь бактериальных клеток указанных штаммов, взятых в равных весовых долях.

Ниже приведено обоснование качественного и количественного содержания компонентов в препарате.

Концентрат бифидобактерий изготавливают в соответствии с патентом РФ 2104706 (МПК⁶ A 61 K 35/74, опубл. 20.02.98 г.), который включает в себя следующие компоненты питательной среды: стерильное обезжиренное молоко с содержанием СОМО не менее (12-14)%, панкреатический гидролизат молока и автолизат пекарских дрожжей.

Закваску вязких штаммов ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus типа AB изготавливают в соответствии с технологической инструкцией (ТИ), разработанной Всероссийским научно-исследовательским молочным институтом (ТИ по приготовлению и применению заквасок для кисломолочных продуктов. - М., ВНИМИ, 1992. - с. 3-7).

Наличие в питательной среде панкреатического гидролизата белков молока, обеспечивает обогащение ее смесью высокомолекулярными и низкомолекулярными пептидами, которые являются эффективными стимуляторами роста бифидобактерий (Т.М. Эрвольдер, А.В. Гудков и Л.П.Семенова. "Воздействие ферментативных гидролизатов на накопление биомассы бифидобактерий". - Журн. "Молочная промышленность", N 12, 1980. - С.15-17).

Автолизат пекарских дрожжей содержит витамины и стимулирующие факторы роста бифидобактерий Bifidobacterium bifidum.

Введение в препарат сухой микробной биомассы с биотитром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г обеспечивает ему оптимальную биологическую активность. Если исходная микробная биомасса имеет титр меньше 10⁸ КОЕ/г, то препарат обладает недостаточной биологической активностью и при введении в желудочно-кишечный тракт проявляет слабый лечебно-профилактический эффект. Титр сухой микробной биомассы более 10¹⁰ КОЕ/мл значительно увеличивает стоимость препарата без значительного увеличения лечебно-профилактического эффекта.

Основу жидкой бактериальной суспензии для сушки составляют клетки-пробиотики в молочной питательной среде с повышенным титром клеток (10⁹ - 10¹¹ КОЕ/мл) - жидкий концентрат бифидобактерий. Молочная питательная среда с клетками-эубиотиками содержит повышенное количество белка (не менее 12% СОМ - сухого остатка молока). Это позволяет увеличить антибиотические свойства бактерий-пробиотиков в препарате. Кроме того повышенное количество белка увеличивает антацидные свойства препарата.

Высокая концентрация клеток в жидкой бактериальной суспензии позволяет их использовать в препарате в сухом виде в концентрации 0,1 - 10% с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/мл.

Питательная среда с жидким концентратом бифидобактерий, предназначенным для иммобилизации и сушки, дополнительно обогащена важнейшими заменимыми и незаменимыми аминокислотами, обладающими анаболическими и антиоксидантными свойствами: глутаминовая кислота, глутамин, лейцин, аргинин и цистеин.

Перед сушкой антиоксидантные свойства жидкого концентрата усиливаются дополнительно, с помощью специальной защитной среды, создающей максимальные условия анаэробиоза перед сушкой, которые важны для анаэробов-бифидобактерий, особенно при длительном их хранении в обычной атмосфере, содержащей кислород. Основными веществами защитной среды, которые обеспечивают анаэробиоз составляют аминокислота цистеин и аскорбиновая кислота.

В качестве дополнительного пробиотика может быть введена бактериальная суспензия ацидофильных бактерий одного или нескольких штаммов, которые обладают колонизационной активностью в кишечнике.

Иммобилизующий материал-сорбент помимо адсорбции бактерий-пробиотиков в крупных макропорах, сорбирует в мелких микропорах незаменимые аминокислоты с анаболическими и антиоксидантными свойствами, а также аскорбиновую кислоту из бактериальной суспензии и доставляет их в нижние отделы кишечника - толстый кишечник, где наиболее активно протекают процессы дезтоксикации организма. Кроме этого такие аминокислоты, поступая из сорбента в кровь, активизируют детоксицирующую работу почек и защищают их от повреждений. Аминокислоты также снижают определенную индивидуальную непереносимость организма некоторых индивидов к СУМСУ в той относительно большой дозе, которая рекомендована для обычного применения (1 г/кг массы тела), и 2-3 г/кг в случае острых отравлений.

Носитель-сорбент представляет собой механически прочные частицы порошка или гранулы или таблетки, выполненные из оксида алюминия, поверхность которых модифицирована углеродом при получении сорбента типа СУМС черного цвета. Сорбенты имеют удельную поверхность до 300 м²/г и развитую структуру мезо- и макропор. Размеры макропор сорбента соизмеримы с размерами микробных клеток, что позволяет заполнять макропоры указанными клетками. Регулированием процентного содержания углерода в сорбенте с последующими окислительно-восстановительными его обработками обеспечивается получение носителя с заданными гидрофильно-гидрофобными и другими топохимическими характеристиками. Сорбенты типа СУМС в меньшей степени, чем другие аналогичные материалы, извлекают витамины и гормоны из организма и не нарушают перистальтику, что делает возможным их применение длительными курсами. Наличие в сорбенте оксида алюминия придает его поверхности определенные буферные антацидные свойства, что способствует лучшему сохранению активности и выживанию иммобилизованных на нем микробных клеток, например, при прохождении препарата через желудок (устраняет отрицательное влияние желудочного сока на микробные клетки) или при других неблагоприятных условиях (низких pH).

Макропористая структура носителя-сорбента, ячейки которого заполнены микробными клетками, также способствует защите этих иммобилизованных клеток от инактивирующих факторов внешней среды. Причем, микробные клетки, находящиеся в порах, и клетки, находящиеся близко к внешней поверхности носителя-сорбента, отличаются по своим десорбционным способностям, и такая неоднородность свойств клеток, обеспечивает пролонгированное действие препарата и способствует колонизации не только верхних, но и нижних отделов кишечника. Пористый носитель, являясь энтеросорбентом, снимает эффекты местного (а через него и общего) токсикоза, что способствует выживаемости бактерий препарата и микрофлоры кишечника, а также снижает нагрузку на органы детоксикации человека или животного.

Кроме того при использовании в препарате в качестве микробных клеток бифидобактерий или смеси бифидо- и лактобактерий обеспечивается не только вытеснение из желудочно-кишечного тракта патогенных микроорганизмов (за счет антагонистических свойств указанных бактерий), но и восстановление сильно сокращенной микрофлоры кишечника при дисбактериозе и других заболеваниях.

При свободном объеме пор сорбента менее 0,01 см³/г не обеспечивается достаточное количество иммобилизованных микробных клеток в препарате (менее 0,1%). Препарат с содержанием микробной биомассы менее 0,1 мас.% имеет низкий биотитр с преобладанием прочно связанных с сорбентом клеток, т.е. действует преимущественно как энтеросорбент.

Свободный объем пор используемых носителей-сорбентов на основе оксида алюминия составляет не более 1,0 см³/г, то есть количество микробной биомассы (клетки и компоненты питательной среды), которое может быть размещено в порах сорбента, не превышает 1,0 см³ на 1 г сорбента, т.е. на сорбенте может быть иммобилизовано микробных клеток до 50 мас.%. Однако количество микробных клеток, вводимых в препарат, не превышает 10 мас.% вследствие чего вся биомасса бактерий препарата находится в защищенном состоянии. При этом энтеросорбент СУМС в препарате сохраняет основные свои свойства, обеспечивающие связывание и выведение из кишечника токсинов, продуктов незавершенного метаболизма и патогенных микроорганизмов.

Ниже приведены примеры составов предлагаемого комплексного бактериального препарата.

Пример 1. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде порошка с размером частиц (40-100) мкм (мас.%):
Сухой концентрат бифидобактерий B. bifidum 791 с питательной средой и титром 10¹⁰ КОЕ/г - 0,1
защитная среда, в том числе:
Желатин - 0,085
Аскорбиновая кислота - 0,008
Хлористый натрий - 0,017
Сахароза - 0,89
Носитель-сорбент в виде порошка - остальное до 100%
Пример 2. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде порошка с размером частиц (40-100) мкм (мас.%):
Сухой концентрат бифидобактарий B.adolescentis MC-42 с питательной средой и титром 10⁸ КОЕ/г - 10,0
защитная среда, в том числе:
Желатин - 0,85
Аскорбиновая кислота - 0,08
Хлористый натрий - 0,17
Сахароза - 8,9
Носитель-сорбент в виде порошка - Остальное до 100%
Пример 3. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде порошка с размером частиц (40-100) мкм (мас.%):
Сухой концентрат бифидобактерий B.longum с питательной средой и титром 10⁹ КОЕ/г - 5,0
защитная среда, в том числе:
Желатин - 0,575
Аскорбиновая кислота - 0,06
Хлористый натрий - 0,15
Сахароза - 4,215
Носитель-сорбент в виде порошка - Остальное до 100%
Пример 4. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде гранул размером (0,5-5,0) мм (мас.%):
Сухой концентрат бифидобактерий B.bifidum ЛВА-3 с питательной средой и титром 10⁸ КОЕ/г - 10,0
защитная среда, в том числе:
Желатин - 0,85
Аскорбиновая кислота - 0,08
Хлористый натрий - 0,17
Сахароза - 8,9
Носитель-сорбент в виде гранул - Остальное до 100%
Пример 5. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде гранул размером (0,5-5,0) мм (мас.%):
Сухой концентрат бифидобактерий B. bifidum N 1 с питательной средой и титром 10⁹ КОЕ/г - 5,0
защитная среда, в том числе:
Желатин - 0,575
Аскорбиновая кислота - 0,06
Хлористый натрий - 0,15
Сахароза - 4,215
Носитель-сорбент в виде гранул - Остальное до 100%
Пример 6. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде гранул размером (0,5-5,0) мм (мас.%):
Смесь Bifidum bifidum N 1, 791, ЛВА-3, Bifidobacterium longum 379, Bifidobacterium adolescentis MC-42, взятых в равных весовых долях с питательной средой и титром 10⁹ КОЕ/мл - 7,0
защитная среда, в том числе:
Желатин - 0,85
Аскорбиновая кислота - 0,08
Хлористый натрий - 0,17
Сахароза - 8,9
Носитель-сорбент в виде гранул - Остальное до 100%
Пример 7. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде таблеток (мас.%):
Сухой концентрат бифидобактерий B.bifidum 791 с питательной средой и титром 10⁹ КОЕ/г - 3,0
защитная среда, в том числе:
Желатин - 0,575
Аскорбиновая кислота - 0,06
Хлористый натрий - 0,15
Сахароза - 4,215
Носитель-сорбент в виде таблеток - Остальное до 100%
Пример 8. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде таблеток (мас.%):
Сухой концентрат бифидобактерий B.longum 379 с питательной средой и титром 10⁹ КОЕ/г - 5,0
защитная среда, в том числе:
Желатин - 0,575
Аскорбиновая кислота - 0,06
Хлористый натрий - 0,15
Сахароза - 4,215
Носитель-сорбент в виде таблеток - Остальное до 100%
Пример 9. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде таблеток (мас.%):
Смесь сухого концентрата бифидобактерий B.bifidum 791 и сухой закваски ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus типа AB в соотношении 1:8 соответственно (с питательной средой и титром 10⁹ КОЕ/г) - 5,0
защитная среда, в том числе:
Желатин - 0,575
Аскорбиновая кислота - 0,06
Хлористый натрий - 0,15
Сахароза - 4,215
Носитель-сорбент в виде таблеток - Остальное до 100%
Пример 10. Технология получения готовых форм препарата "Экофлор"
По специальной технологии готовят исходные сорбенты типа СУМС (патент РФ N 2026733), в котором оксид алюминия модифицирован углеродом, с требуемой пористой структурой, химической природой поверхности и размером частиц (или гранул, или таблеток).

Перед иммобилизацией бактерий-пробиотиков носитель-сорбент типа СУМС стерилизуют при температуре 121^oC в течение 20 минут и охлаждают.

В емкость при комнатной температуре загружают носитель-сорбент в виде порошка или гранул или таблеток и жидкий концентрат бифидобактерий или смесь жидкого концентрата бифидобактерий и закваски лактобактерий с компонентами питательной и защитной сред при определенных соотношениях и биологической активности бактерий-пробиотиков, соответствующих примерам 1-9. Смесь периодически перемешивают в течение (1,0-1,5) часа при температуре +4^oC для полной иммобилизации клеток на носитель. Процесс иммобилизации возможно вести на качалке в стеклянной посуде или на роллерной установке.

Далее продукт однократно промывают в изотоническом растворе NaCl. Мутный раствор стерильно сливают, отбирают пробы и проводят контроль полноты процесса иммобилизации по МУК 4.2.577-96 (Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", п.7.1 и п.7.10). Процесс считается завершенным, если в растворе осталось не более 50% от исходного количества бифидо- и лактобактерий.

Отмытый продукт замораживают в низкотемпературном холодильнике типа "Кельвинатор" при температуре минус (40-45)^oC в течение (24-48) часов. Кассеты с предварительно замороженным препаратом перегружают в сушильную камеру при достижении температуры плит минус (20-30)^oC и камеру вакуумируют. Готовый препарат "Экофлор" в сухой иммобилизованной форме фасуют во флаконы и герметично закрывают пробками. Массовая доля влаги составляет не более 3,5%.

Пример 11. Исследование влияния препарата "Экофлор" на кишечную микрофлору лабораторных животных
Для проверки эффективности действия созданного препарата "Экофлор" и его отсроченный полезный эффект по колонизации кишечника были проведены исследования на лабораторных неинбредных мышах обоего пола колонии ICR.

Препараты СУМС-1, содержащий только один энтеросорбент, и заявляемый "Экофлор" вводили мышам перорально, задавая его с кормом, в дозе 0,5 г/кг веса тела (для одних опытных групп мышей) и 2,0 г/кг веса тела (для других опытных групп мышей) в течение 15 дней. При приеме "Экофлора" нарастание веса животных происходило плавно и соответствует нормам, принятым в популяционном стандарте. При приеме одного энтеросорбента СУМС-1 динамика изменения веса у мышей носила переменный характер с резкими подъемами и спадами. Это объясняется сильным сорбционно-детоксикационным эффектом энтеросорбента СУМС-1, в результате действия которого улучшается всасывание питательных веществ, поступающих в организм. В препарате "Экофлор" последствия сорбционно-детоксикационного эффекта сглаживаются и организм испытывает меньше стрессовых нагрузок.

Данные по микробиологическим исследованиям состава микрофлоры кишечника мышей путем бактериологического анализа их фекалий приведены в табл. 1 и 2.

Анализ данных табл. 1 позволяет сделать заключение, что длительное введение в течение 15 дней энтеросорбента СУМС-1 и заявляемого препарата "Экофлор" в дозировке 0,5 г/кг веса тела вызывает не только количественные, но и качественные изменения в составе микробных ассоциаций кишечного тракта.

Так, если в контрольной группе выявлено наличие Citrobacter spp. и лактозонегативной Escherichia, то через 15 дней применения препарата "Экофлор" из кишечника исчезает вся условно-патогенная флора, возврата которой не наблюдается через 6 и 12 контрольных дней после отмены препарата. При этом отмечается увеличение количества аутохтонной микрофлоры бифидо- и лактобактерий с 10⁵ до 10⁷ КОЕ в 1 г фекалий.

Несколько иным является эффект воздействия энтеросорбента СУМС-1 в такой же дозировке - 0,5 г/кг веса тела животного в течение 15 дней. Данные микробиологического анализа состава кишечной микрофлоры мышей показал, что СУМС-1, адсорбируя на своей поверхности бактерии, полностью выводит из кишечника Citrobacter spp., в то время как лактозонегативной Escherichia - только частично. При этом СУМС-1 также адсорбирует и полезную микрофлору - бифидо- и лактобактерий, а также лактозоположительную Escherichia (lac+), снижая их концентрации с величин порядка 10⁵-10⁶ до 10⁴-10⁵ КОЕ в 1 г фекалий. Кроме того, в случае применения "Экофлора", у мышей исчезал запор - характерный побочный эффект при приеме СУМСа. Через 12 дней после отмены приема "Экофлора" концентрация полезных бактерий в кишечнике - бифидо- и лактобактерий, напротив, возрастает в 10 раз.

Таким образом, результаты табл. 1 свидетельствуют, что в отличие от "Экофлора", энтеросорбент СУМС вызывает уменьшение в 10 раз концентрации полезной микрофлоры в кишечнике (бифидобактерий и лактобактерий)- "вымывание полезных бактерий".

Введение в организм максимальных доз - 2 г/кг веса тела животных в течение 15 дней энтеросорбента СУМС-1 и препарата "Экофлор" показало неэффективность действия доз, превышающих 0,5 г/кг веса тела. Данные приведены в табл. 2. Из анализа данных табл. 2 следует, что применение препарата "Экофлор" в дозе 2 г/кг способствует полному вытеснению условно-патогенной микрофлоры. У мышей контрольной группы такого не наблюдается. Однако при этом происходит недостаточное повышение количества бифидо-, лактобактерий и Escherichia (lac+). У животных, потреблявших СУМС-1, как видно из табл. 2, наблюдается сильный дисбактериоз, поскольку активно-полезная микрофлора содержится в количествах, не превышающих 10⁵ КОЕ в 1 г фекалий.

В результате через 15 дней после применения СУМСа и через 12 дней после его отмены, освобожденные от полезных бактерий места на слизистой кишечника, занимают условно-патогенные и патогенные бактерии (слабоферментирующая кишечная палочка, протей, сальмонеллы), особенно при применении СУМСа в повышенной дозе ( см. табл. 2).

Пример 12. Исследование биологической активности препаратов в иммобилизованной форме в процессе их хранения
Для исследования биологической активности препаратов-пробиотиков в иммобилизованной форме в процессе воздействия инактивирующих факторов внешней среды (температура, кислород воздуха, длительность воздействия и другие факторы) используют стандартную процедуру ускоренного хранения биопрепарата при температуре 37^oC. Результаты биотитрования стандартным методом серийных разведений на питательных средах в колонийобразующих единицах (КОЕ) на 1 г препарата (КОЕ/г) приведены в табл. 3.

Анализ табл. 3 показывает, что по результатам ускоренного теста на хранение заявляемые препараты-пробиотики на основе концентрата бифидобактерий или смеси их с закваской лактобактерий в иммобилизованной форме имеют биологическую активность в 1,5-2,0 раза выше, чем комплексный препарат-прототип и на 1-2 порядка выше, чем другие препараты-аналоги.

Хранение заявляемых препаратов в течение 1,5 года при температуре не выше +10^oC в условиях холодильника показало, что их биологическая активность (в КОЕ/г) осталась практически неизменной несмотря на наличие атмосферного воздуха в препарате над флаконом, что подтверждает данные ускоренного теста, приведенного в табл. 3. Это объясняется защитным антиокислительным действием имеющихся в "Экофлоре" аминокислот-антиоксидантов.

Таким образом, заявляемый комплексный бактериальный препарат обеспечивает более эффективное лечебно-профилактическое действие на организм человека или животного за счет более высокой колонизационной активности в кишечнике, а также имеет более длительные сроки хранения.

Промышленная применимость. Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии.

Формула изобретения

1. Препарат-пробиотик в сухой иммобилизованной форме, включающий носитель, представляющий собой сорбент, и клетки эубиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки эубиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см³/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1 - 5,0) мм, или в виде таблеток, отличающийся тем, что препарат дополнительно содержит защитную среду, а клетки эубиотиков с питательной средой представляют собой сухой концентрат бифидобактерий на молочной основе с титром 10⁸ - 10¹⁰ КОЕ/г и содержанием аминокислот (мг/100 г сухой биомассы):
Глутаминовая кислота - 15,0 - 68,0
Глутамин - 8,0 - 20,0
Лейцин - 10,0 - 50,0
Аргинин - 20,0 - 30,0
Цистеин - 50,0 - 80,0
при следующем соотношении компонентов препарата в сухом виде, мас.%:
Клетки эубиотиков с питательной средой и титром 10⁸ - 10¹⁰ КОЕ/г - 0,1 - 10,0
Защитная среда - 0,1 - 10,0
Носитель-сорбент - Остальное до 100%
2. Препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что в качестве защитной среды используют желатин, сахарозу, аскорбиновую кислоту и хлористый натрий при следующем содержании компонентов, мас.%:
Желатин - 8,5 - 11,5
Аскорбиновая кислота - 0,8 - 1,2
Хлористый натрий - 1,7 - 3,0
Сахароза - Остальное до 100%
3. Препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например, энтеросорбент типа СУМС, модифицированный углеродом.

4. Препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что препарат в качестве бактерий-эубиотиков дополнительно содержит сухую закваску вязких штаммов ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus типа AB, соотношение которых с сухим концентратом бифидобактерий составляет 1 : (8 - 9) соответственно.

5. Препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что в качестве бифидобактерий в сухом концентрате используют бактерии Bifidobacterium bifidum N 1, или N 791, или ЛВА-3, или Bifidobacterium longum 379, или Bifidobacterium adolescentis МС-42, или смесь бактериальных клеток указанных штаммов, взятых в равных весовых долях.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

PC4A Государственная регистрация перехода исключительного права без заключения договора

Лицо(а), исключительное право от которого(ых) переходит без заключения договора:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"

(73) Патентообладатель:
Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека"

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 19.04.2010 № РП0000714

Извещение опубликовано: 27.05.2010        БИ: 15/2010

QC4A Государственная регистрация расторжения зарегистрированного договора

Дата и номер государственной регистрации расторгаемого договора:
28.07.2004 № 19581

Вид договора: лицензионный

Лицо(а), передающее(ие) исключительное право:
Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Лицо, приобретающее право использования:
Закрытое акционерное общество "Вектор-БиАльгам"

Дата и номер государственной регистрации расторжения договора: 01.03.2011 РД0077360

Дата публикации: 10.04.2011