Тетрапептид, стимулирующий функциональную активность гепатоцитов, фармакологическое средство на его основе и способ его применения

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано как средство, стимулирующее функциональную активность гепатоцитов, для профилактики и лечения заболеваний и поражений печени. Предлагается билогически активное соединение тетрапептид лизил-глутамил-аспартил-аланин общей формулы Lys-Glu-Asp-Ala, стимулирующий функциональную активность гепатоцитов, и фармакологическое средство, содержащее в качестве активного начала эффективное количество тетрапептида формулы Lys-Glu-Asp-Ala или его солей, предназначенное для парентерального, интраназального и перорального введения. Согласно изобретению способ стимуляции функциональной активности гепатоцитов включает лечебное введение пациенту фармакологического средства в дозах 0,01-100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Технический результат: средство, стимулирующее функциональную активность гепатоцитов, восстанавливает синтез неспецифических белков, нормализует метаболизм, активизирует процессы пролиферации и дифференцировки клеток печени. 4 с. и 6 з.п.ф-лы, 3 ил, 5 табл.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано как средство, стимулирующее функциональную активность гепатоцитов, для профилактики и лечения заболеваний и поражений печени.

Среди аналогов известна группа гепатопротекторных средств, улучшающих метаболические процессы в печени, повышающих ее устойчивость к патогенным воздействиям, ускоряющих восстановление ее функций при различных повреждениях (1). В настоящее время в качестве специальных гепатопротекторных средств используются некоторые препараты флавоноидной структуры (силибинин, силибор, катерген), близкие по структуре к витаминам группы P (рутин, кварцетин), и препараты из лекарственных растений (Лив-52, валилив и др.). Действие этих препаратов, в основном, связано с повышением активности ферментных систем печени, общей антиоксидантной и антигипоксической активностью. При приеме этих препаратов возможны диспептические явления и индивидуальная непереносимость. Прием некоторых из этих препаратов противопоказан при тяжелых поражениях паренхиматозных органов, острых воспалительных процессах в желче- и мочевыводящих путях.

Известен комплексный лекарственный препарат эссенциале (2), применяемый при хронических заболеваниях и поражениях печени. Препарат уменьшает желтуху, улучшает течение ферментативных процессов, биохимические показатели, микроциркуляцию. Однако применение эссенциале не дает лечебного эффекта при острых поражениях печени.

Известен лекарственный препарат сирепар (3), принятый за прототип по отношению к фармкомпозиции и способу стимуляции и представляющий собой гидролизат печени. Сирепар способствует восстановлению паренхимы печени, предупреждает жировую инфильтрацию, влияет на синтез холина и метионина. Однако при применении сирепара терапевтическое действие препарата выражено слабо и возможны аллергические реакции.

Недостатком вышеперечисленных лекарственных препаратов является также слабовыраженное специфическое регуляторное влияние на функциональную активность гепатоцитов.

Известен фактор роста гепатоцитов, синтезируемый клетками печени. Добавление фактора роста гепатоцитов в культуру изолированных гепатоцитов способствовало увеличению скорости синтеза ДНК в клетках (4). Применение фактора роста гепатоцитов у крыс, которым была произведена перевязка ветвей воротной вены печени, вызывало увеличение синтеза ДНК в клетках неблокированных долей печени и снижало уровень билирубина у крыс с желтухой (5). Увеличение уровня эндогенного фактора роста гепатоцитов в плазме крови у крыс с экспериментальным циррозом печени замедляло процесс образования фиброзной ткани и ингибировало апоптоз гепатоцитов (6).

Однако в настоящее время установлено, что фактор роста гепатоцитов синтезируется также в эпителиальных клетках роговицы, кератиноцитах и эндотелиальных клетках, а рецепторы к этому фактору имеются в клетках роговицы (7). Вследствие этого, фактор роста гепатоцитов стимулирует пролиферацию клеток роговицы и вызывают их миграцию, что свидетельствует об отсутствии выраженного тканеспецифического действия. Кроме этого, получение рекомбинантного фактора роста гепатоцитов связано с определенными технологическими трудностями, затрудняющими его внедрение в клиническую практику.

Заявляемое изобретение направлено на получение нового биологически активного соединения пептидной природы, стимулирующего функциональную активность гепатоцитов.

Заявляемое пептидное соединение - тетрапептид - структурных аналогов не имеет.

Согласно изобретению заявляется тетрапептид лизил-глутамил-аспартил-аланин общей формулы Lys-Glu-Asp-Ala.

Тетрапептид лизил-глутамил-аспартил-аланин со следующей аминокислотной последовательностью: Lys-Glu-Asp-Ala, отвечающий изобретению, проявляет биологическую активность, а именно стимулирует функциональную активность гепатоцитов за счет восстановления синтеза тканеспецифических белков, нормализации метаболизма, активации процессов пролиферации и дифференцировки клеток печени.

Тетрапептид получают классическим методом пептидного синтеза в растворе (8).

Стимулирующее действие тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala на функциональную активность гепатоцитов выявлено при его экспериментальном изучении. Изучение биологической активности проводили в монослойной культуре гепатоцитов, на эксплантатах печени, исследуя тканеспецифическое действие тетрапептида, на крысах, изучая структурно-функциональные показатели печени при токсическом повреждении и опухолевом росте.

Согласно изобретению фармакологическое средство, обладающее гепатопротекторной активностью, содержит в качестве активного начала эффективное количество тетрапептида формулы лизил-глутамил-аспартил-аланин (Lys-Glu-Asp-Ala) или его солей.

Согласно изобретению фармакологическое средство, стимулирующее функциональную активность гепатоцитов, может содержать соли по аминогруппе (ацетат, гидрохлорид, оксалат), или по карбоксильным группам (соли металлов - натрия, калия, кальция, лития, цинка, магния, а также других органических и неорганических катионов - аммония, триэтиламмония).

Согласно изобретению фармакологическое средство предназначено для парентерального, интраназального или перорального применения.

Заявляемое фармакологическое средство, стимулирующее функциональную активность гепатоцитов, способно восстанавливать метаболизм и репаративную способность поврежденных структур печени.

Понятие "фармакологическое средство", используемое в данной заявке, подразумевает использование любой лекарственной формы, содержащей тетрапептид или его соли, которые могут найти профилактическое и/или лечебное применение в медицине в качестве средства для восстановления структурно-функциональной целостности ткани печени.

Понятие "эффективное количество", используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Понятие "фармацевтическая композиция", используемое в данной заявке, подразумевает различные лекарственные формы препарата.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, предлагаемый тетрапептид или его фармацевтически приемлемые производные смешиваются как активный ингредиент с фармацевтическим носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм, например, парентерального, интраназального или перорального.

При изготовлении композиций в предпочтительной дозированной форме для перорального применения могут использоваться любые известные фармацевтические компоненты.

Для парентерального (интраназального) введения носитель обычно включает стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности, или для сохранения стерильности.

Согласно изобретению способ включает профилактическое или лечебное введение пациенту заявляемого фармакологического средства в дозах 0,01 - 100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта - 10-40 дней в зависимости от характера течения патологического процесса.

Согласно изобретению тетрапептид активен при введении его в дозах 0,01-100 мкг/кг массы тела, хотя могут быть использованы и более низкие (высокие) дозы в зависимости от характера течения патологического процесса.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза тетрапептида формулы лизил-глутамил-аспартил-аланин (Lys-Glu-Asp-Ala) (пример 1), примерами испытания токсичности и биологической активности тетрапептида (примеры 2, 3, 4, 5, 6), а также примером результатов клинического применения тетрапептида, демонстрирующим его фармакологические свойства и подтверждающим возможность достижения профилактического и/или лечебного эффекта (пример 7).

Пример 1. Синтез тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala 1. Название соединения: лизил-глутамил-аспартил-аланин.

2. Структурная формула: 3. Брутто-формула без противоиона: C₁₈H₃₁N₅O₉.

4. Молекулярный вес без противоиона: 461,48.

5. Противоион: ацетат.

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме, приведенной в конце текста.

В качестве растворителя использовали N,N'-диметилформамид, при введении аспарагиновой кислоты использовали защиту α-COOH группы солеобразованием с триэтиламином. Деблокирование BOC-защитной группы проводили раствором трифторуксусной кислоты (TFA), Z-защитных групп каталитическим гидрогенолизом. Выделение и очистка препарата осуществлялись методом препаративной ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой.

Характеристики готового препарата: аминокислотный анализ Lys 0,97; Glu 1,02; Asp 1,01; Ala 1,00.

содержание основного вещества: 98,75% (по ВЭЖХ, 220 нм); ТСХ - индивидуален, R_f = 0,71 (ацетонитрил-вода 1:1); содержание влаги: 7%; pH 0,001% раствора: 5,54; удельное оптическое вращение: [α]²_D³: -28,0^o (c = 1,0; H₂O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

Пример синтеза: 1) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (I), N-трет.бутилоксикарбонил- (γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартат.

N-оксисукцинимидный эфир N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутаминовой кислоты BOC-Glu(OBzl)-OSu 4,34 г (0,0100 моль) растворяют в 20 мл диметилформамида, добавляют триэтиламин 1,72 мл (0,0125 моль) и β-бензиласпартат 2,80 г (0,0125 моль). Перемешивают при комнатной температуре 24 час. Продукт высаживают 0,5 н. раствором серной кислоты (150 мл), экстрагируют в этилацетат (3х30 мл), промывают 0,5 н. раствором серной кислоты (2х20 мл), водой, 5% раствором бикарбоната натрия (1х20 мл), водой, 0,5 н. раствором серной кислоты (2х20 мл), водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Этилацетат фильтруют, упаривают в вакууме при 40^oC, остаток сушат в вакууме над P₂O₅. Получают масло 5,68 г (≈100%).

R_f = 0,42 (бензол-ацетон 2:1, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление УФ и хлор/бензидин).

2) TFA·H-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (II), трифторацетат (γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартата.

N-трет. бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартат (1) 5,68 г (≈ 0,01 моль) растворяют в 20 мл смеси дихлорметан-трифторуксусная кислота (3: 1). Через 2 часа растворитель упаривают в вакууме при 40^oC, упаривание повторяют с новой порцией дихлорметана (2х10 мл), остаток сушат в вакууме над NaOH. Получают масло 5,80 г (≈100%).

R_f = 0,63 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:12).

3) Z-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (III) N,Nε-дибеизилоксикарбониллизил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартат.

Трифторацетат (γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартата (II) 5,65 г (0,01 моль) растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют триэтиламин 2,80 мл (0,02 моль) и N-оксисукцинимидный эфир N,Nε-дибензилоксикарбониллизина 6,64 г (0,013 моль). Смесь перемешивают 24 часа при комнатной температуре.

Продукт высаживают 0,5н раствором серной кислоты (150 мл), экстрагируют в этилацетат (3х30 мл), промывают 0,5н раствором серной кислоты (2х20 мл), водой, 5% раствором бикарбоната натрия (1х20 мл), водой, 0,5н раствором серной кислоты (2х20 мл), водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Этилацетат фильтруют, упаривают в вакууме при 40^oC, остаток закристаллизовывают в системе этилацетат/гексан. Продукт отфильтровывают и сушат в вакууме над P₂O₅. Выход 6,04 г (72%). T.пл. = 142^oC.

R_f = 0,60 (бензол-ацетон, 1:1).

4) Z-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Ala-OBzl (IV), бензиловый эфир N,Nε-дибензилоксикарбониллизил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартил-аланина.

HCl·H-Ala-OBzl, гидрохлорид бензилового эфира аланина 0,65 г (3 ммоль) суспендируют в 15 мл тетрагидрофурана и при перемешивании добавляют триэтиламин 0,4 мл (3 ммоль), далее через 5 мин N,Nε-дибензилоксикарбонил-лизил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартат (III) 1,68 г (2 ммоль), N-оксибензотриазол 0,27 г (2 ммоль) и охлаждают смесь до 0^oC. Затем добавляют охлажденный до 0^oC раствор N,N'-дициклогексилкарбодиимида 0,42 г (2 ммоль) в 5 мл тетрагидрофурана, перемешивают смесь при этой температуре 2 часа и оставляют на ночь перемешиваться при комнатной температуре. Осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в 30 мл, промывают раствор 1 н. раствором соляной кислоты, водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой, 1 н. раствором соляной кислоты, водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают в вакууме и продукт закристаллизовывают в системе этилацетат/гексан. Выход 1,28 г (64%). T.пл. = 156-160^oC.

R_f = 0,67 (бензол-ацетон, 2:1).

5) H-Lys-Glu-Asp-Ala-OH (V), лизил-глутамил-аспартил-аланин.

Бензиловый эфир N,Nε-дикарбобензоксилизил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартилаланина (III) 1,10 г гидрировали в системе метанол-вода-уксусная кислота (3:1:1) над катализатором Pd/C. Контроль за полнотой деблокирования в ТСХ системах бензол-ацетон (2:1) и ацетонитрил-уксусная кислота-вода (5:1:3). По окончании реакции катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме и остаток закристаллизовывали в системе вода/метанол. Продукт сушили в вакууме над KOH. Выход 0,484 г (95%).

R_f = 0,7 (ацетонитрил-вода, 1:1).

Для очистки 470 мг препарата растворяли в 4 мл 0,01% трифторуксусной кислоты (pH пробы 2,23) и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50х250 мм Diasorb-130-C16T, 7 μ. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования A: 0,1% TFA; B: 50% MeCN/0,1% TFA, градиент B 0 ---> 16% за 240 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при 215 нм, сканирование 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию 94-135 мин.

Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40^oC, упаривание многократно (5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты. Окончательно остаток растворяли в 20 мл деионизованной воды и лиофилизовывали. Получено 255 мг очищенного препарата в виде аморфного белого порошка без запаха.

Для получения соответствующих солей по карбоксильным группам к свободному тетрапептиду добавляют рассчитанное количество водного раствора гидроокиси соответствующего металла (NaOH, KOH, Zn(OH)₂, LiOH, Ca(OH)₂, Mg(OH)₂, NH₄OH). Для получения триэтиламмониевой соли обработку проводят аналогичным образом, используя в качестве основания триэтиламин.

6) Анализ готового препарата.

Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Supelco LC-18-DB 4,6х250 mm, gard. LC-18-DB. A: 0,1% TFA; B: 50% MeCN/0,1% TFA; grad. B 0 ---> 20% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, проба 20 мкл. Содержание основного вещества 98,75%.

Аминокислотный анализ проводили на анализаторе AAA"T-339" Prague. Гидролиз в 6н HCl при 125^oC 24 час.

Lys 0,97; Glu 1,02; Asp 1,01; Ala 1,00.

ТСХ: индивидуален, R_f = 0,71 (ацетонитрил-вода 1:1, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

Содержание влаги: 7% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100^oC).

pH 0,001% раствора: 5,54 (потенциометрически).

Удельное оптическое вращение: [α]²_D³: -28^o (c = 1.0 H₂O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

Пример 2. Изучение токсичности тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala
Изучение возможного токсического влияния на организм тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala проводилось в соответствии с "Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)".

Цель изучения состояла в определении переносимых токсических доз препарата, оценке степени и характера патологических изменений в различных органах и системах организма и выявлении зависимости токсических эффектов от дозы и длительности применения препарата.

Определение острой токсичности тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala проводили по методу Кербера. Исследование проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах массой 20-22 г, содержавшихся на стандартном режиме и получавших стандартное питание в условиях вивария. Животные были разделены случайным распределением на 6 равных групп по 12 мышей в каждой. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в объеме 0,25 мл в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг (в несколько тысяч раз превышающих терапевтическую дозу, рекомендуемую для клинического изучения). Животным контрольной группы в том же объеме вводился физиологический раствор.

В течение 72 часов и далее через 14 суток ни в одной группе животных гибели мышей не обнаружено. Не отмечено каких-либо изменений общего состояния, поведения, двигательной активности, волосяного и кожного покрова, физиологических отправлений животных.

Таким образом, тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala в дозах, превышающих терапевтическую, рекомендуемую для клинических испытаний, в несколько тысяч раз, не вызывает острых токсических реакций, что указывает на большую терапевтическую широту препарата.

Исследование подострой токсичности тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala проведено на 64 белых беспородных крысах массой 170-250 г. Ежедневно однократно животным опытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мкг/кг, 0,3 мг/кг, 3 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора. Животным контрольной группы вводили в том же объеме физиологический раствор.

На протяжении всего периода исследования животные находились под ежедневным наблюдением. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Проводили еженедельное взвешивание животных. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Хроническую токсичность тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala, полученного заявляемым способом, изучали при длительном введении его крысам массой 170-250 г. Животным ежедневно вводили внутримышечно препарат в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора в течение 6 месяцев. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Взвешивание животных проводилось ежедневно в первые 3 месяца эксперимента, затем 1 раз в месяц. Через 3 месяца после начала введения и при завершении эксперимента проводили гематологические и биохимические исследования. Оценивали функции сердечно-сосудистой системы, печени, поджелудочной железы, почек и надпочечников. После окончания введения препарата часть животных подвергали патоморфологическому исследованию с целью оценки состояния различных отделов головного и спинного мозга, сердца, аорты, легких, печени, почек, органов эндокринной и иммунной систем.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Изучение подострой и хронической токсичности тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз.

Пример 3. Влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala на интенсивность синтеза белка в монослойной культуре гепатоцитов крыс разного возраста
Интенсивность синтеза белка исследовали в культуре гепатоцитов крыс в возрасте 4, 8 и 18 месяцев.

Для изоляции гепатоцитов печень крысы перфузировали бескальциевым раствором Хенкса с 0,5 мМ ЭГТА и затем 0,05% раствором коллагеназы в среде 199. Клеточную суспензию фильтровали и центрифугировали. Взвесь гепатоцитов в концентрации 5·10⁵ вводили в чашки Петри, на дне которых были стекла, покрытые коллагеном. Использовали среду 199 без бычьей сыворотки с добавлением 0,2 мг/мл альбумина и 5 мкг/мл инсулина. Чашки со стеклами помещали в термостат при 37^oC, аэрированный воздухом с добавлением CO₂. Через 2 часа стекла с прикрепившимися клетками отмывали и среду заменяли на такую же. Через сутки, отмыв культуры, исследовали синтез белка в культурах. При указанной концентрации клеточной взвеси к 24 часам образуются монослойные культуры с плотным расположением гепатоцитов.

Синтез белка оценивали по включению [³H]лейцина с поправкой на пул свободного меченого лейцина в той же культуре. Использовали лейцин с молярной активностью 150 Ки/мМ. Время инкубации с меченым лейцином было 10 мин. После инкубации культуры с меченым лейцином отмывали средой и для выделения не включившегося лейцина обрабатывали холодной (4^oC) хлорной кислотой 90 мин. Ту же культуру споласкивали этиловым спиртом и затем растворяли белки гиамином. Радиоактивность пула свободного внутриклеточного лейцина и (в гиаминовой фракции) клеточных белков после добавления соответствующих сцинтилляторов измеряли на счетчике радиоактивности SL-30.

Интенсивность синтеза белка рассчитывали по формуле
I_corr = I_i · P_av/P_i (cpm),
где I_corr - включение лейцина с поправкой на пул свободного лейцина, _i - измеренная радиоактивность белков определенной культуры i, P_av - средняя радиоактивность белков и пула для культур данного опыта, P_i - суммарная радиоактивность белков и пула той же культуры.

Культуры гепатоцитов инкубировали с тетрапептидом Lys-Glu-Asp-Ala в концентрации 0,005 мкг/мл в течение 4 ч.

На фиг. 1 показано влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala на кинетику синтеза белка в монослойной культуре гепатоцитов крыс разного возраста.

Установлено, что с возрастом в культурах гепатоцитов снижается уровень синтеза белка (фиг. 1). Добавление в культуры тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala повышало уровень синтеза белка в гепатоцитах крыс разного возраста, причем наибольший эффект наблюдался в клетках старых животных. Наряду с этим в гепатоцитах старых крыс существенно увеличивалась амплитуда колебаний синтеза, что позволяет предполагать повышение степени синхронизации активности клеточной популяции (фиг. 1).

Пример 4. Влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala на развитие эксплантатов печени
Эксперименты проведены на 53 фрагментах печени 10-11-суточных эмбрионов цыпленка. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед. /мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты печени помещали в эту среду и культивировали в чашках Петри в термостате при 36,7^oC в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala в концентрациях 2, 10, 20, 50, 100, 200, 400 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента коры. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.

На фиг. 2 показано влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala на развитие эксплантатов печени.

Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации тетрапептида 20 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 24% по сравнению с контрольными значениями ИП (фиг. 2). При исследовании эксплантатов печени на более длительных сроках культивирования (7 дней) было выявлено аналогичное стимулирующее действие тетрапептида в той же концентрации.

Таким образом, в отношении ткани печени тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.

Пример 5. Влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala на течение острого токсического гепатита у крыс
Острый токсический гепатит у крыс вызывали введением четыреххлористого углерода (CCl₄) в рафинированном подсолнечном масле в соотношении 1:1. Свежеприготовленный, подогретый до 30-35^o раствор вводили в область бедра ежедневно по 0,5 мл из расчета на 100 г массы животного в течение 5 дней.

Животным первой группы тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala вводили по 1 мкг на крысу внутримышечно в течение 5 дней на фоне применения CCl₄. Через 5 дней после окончания введения тетрапептида крыс забивали и оценивали результаты исследования.

Животным другой группы тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala вводили после окончания воздействия CCl₄ по 1 мкг на инъекцию ежедневно внутримышечно в течение 15 дней. Через 20 дней после начала эксперимента крыс забивали.

Животные контрольных групп по аналогичным схемам получали инъекции физиологического раствора.

Состояние печени у животных оценивали по данным биохимического анализа, определяя концентрацию белка, билирубина, холестерина, аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ).

С целью выявления морфологических изменений печени проводили гистологическое исследование. Фиксацию кусочков тканей осуществляли в 10%-ном растворе формалина в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (pH 7,4). Гистологические препараты окрашивали гематоксилином-эозином, окраску на жир осуществляли суданом-3, окраску на гликоген - по Мак-Манусу.

В результате проведенных исследований было установлено, что у животных через 5 дней после воздействия CCl₄ развивались выраженные нарушения в печени. Наблюдалось уменьшение содержания общего белка, уровня билирубина и холестерина. Резко возрастала активность аминотрансфераз (табл. 1).

При патоморфологическом исследовании обнаружены признаки крупнокапельной жировой дистрофии (табл. 2). В 84,6% случаев гепатоциты имели включение жира. В гепатоцитах отмечались признаки плазмолиза на фоне нарушенного синтеза гликогена. Отмечалось застойное полнокровие, кровоизлияния, рассеянная лимфоидно-клеточная инфильтрация, отек пространства Диссе.

Данные биохимических и морфологических исследований свидетельствуют о том, что у животных в результате воздействия гепатотропного яда развился острый гепатит с признаками деструкции гепатоцитов.

При одновременном введении CCl₄ и тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala биохимические показатели свидетельствовали о менее выраженной деструкции печени. Содержание общего белка и холестерина, концентрация билирубина в крови увеличивались. Активность аминотрансфераз была выше, чем у здоровых крыс, но меньше, чем у животных с гепатитом (табл. 1).

У крыс, получавших в период воздействия CCl₄ тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala, патология органа была менее выражена. Жировая дистрофия отмечена в 40-50% гепатоцитов (табл. 2). Сохранялась лимфоидно-клеточная инфильтрация перипортальных трактов. Видны признаки регенерации в виде единичных 2-ядерных гепатоцитов. В 45% гепатоцитов отмечен синтез гликогена.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что исследуемый тетрапептид ограничивает развитие патологического процесса в печени. Он уменьшает ферментемию, ограничивает признаки гепатоцеллюлярной недостаточности и тромбогеморрагического синдрома, увеличивая очаги регенерации в печени.

На 20 сутки после начала эксперимента у животных контрольной группы биохимические показатели крови имели тенденцию к восстановлению, но не достигали нормы (табл. 1).

В печени сохранялась жировая дистрофия в 16,7% гепатоцитов. Наблюдались участки регенерации на фоне лимфоидно-клеточной инфильтрации. Гликоген в гепатоцитах с жировой дистрофией не встречался, а в других клетках находился в виде мелкой зернистости (табл. 2).

У животных, получавших после окончания воздействия CCl₄ в течение 15 дней тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala, концентрация белка, билирубина, холестерина и аминотрансфераз в крови восстановилась до нормальных значений (табл. 1).

Признаков дистрофии печени у этих крыс не отмечалось. Гепатоциты с мелкозернистой цитоплазмой, округлыми ядрами. В дольках находятся единичные лимфоциты. Архитектоника долек не нарушена. Характерным признаком регенерации является наличие двухядерных гепатоцитов с гиперхромированными ядрами. Гликоген в виде мелких зерен равномерно распределен в цитоплазме. Окраска на жир в 90% гепатоцитах отрицательна (табл. 2).

Проведенные исследования показали, что применение тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala у крыс с острым токсическим гепатитом способствует нормализации пигментного обмена, уменьшению ферментемии и признаков гепатоцеллюлярной недостаточности, вызывает очаги регенерации в пораженной печени и приводит к более быстрому выздоровлению животных.

Пример 6. Влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala на рост перевитой гепатомы-27
Исследование проведено на 37 крысах-самках массой 150-200 г, которым подкожно в область правого бедра была перевита гепатома-27. Животным опытной группы вводили подкожно ежедневно в течение 10 дней, начиная со следующего дня после перевивки опухоли, тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala в дозе 1 мкг/кг. Животные контрольной группы по аналогичной схеме получали инъекции физиологического раствора. В качестве положительного контроля использовали циклофосфан в дозе 100 мкг/кг однократно внутрибрюшинно. В опытах регистрировали динамику роста опухолей и выживаемость животных.

На фиг. 3 показано влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala на рост гепатомы-27 у крыс.

Установлено, что введение тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala ингибировало опухолевый рост на довольно поздних сроках, хотя впервые торможение роста гепатомы зарегистрировано уже на 21-й день после перевивки (фиг. 3). В то же время этот эффект становился устойчивым, начиная с 30-го дня опыта. У животных, получавших тетрапептид, размер опухоли на 30-е сутки опыта оказался в среднем в 2,5 раза меньше, чем у контрольных крыс. Этот эффект сохраняется вплоть до окончания измерений на 50-й день опыта. Таким образом, введение пептида печени приводило к стойкому торможению опухолевого роста. У трех животных на 16-й, 25-й и 43-й день после перевивки отмечено полное рассасывание опухоли.

Применение циклофосфана вызывало стойкое снижение темпа опухолевого роста, начиная с 16-х суток после перевивки опухоли (фиг. 3). В этой группе полное рассасывание опухолей отмечено у трех животных на 28-й, 32-й и 41-й день опыта.

На поздних сроках после перевивки часть опухолей у подопытных животных стала подвергаться изъязвлению, как и в контроле. Установлено, что тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala оказывал влияние на частоту и вероятность появления язв. Применение тетрапептида, начиная с 39-го дня после перевивки, когда более чем у половины контрольных животных были отмечены язвы на поверхности кожи на месте опухолевого поражения, способствовало достоверному снижению процента животных с изъязвлениями. Циклофосфан оказал подобное влияние лишь на 43-и сутки.

Анализ выживаемости лабораторных животных после перевивки гепатомы показал, что при введении тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala отмечалась тенденция к увеличению продолжительности их жизни (табл. 3).

Таким образом, применение тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala вызывало торможение роста гепатомы-27, что способствовало нормализации функции печени, улучшению общего состояния животных и увеличению средней продолжительности их жизни.

Пример 7. Эффективность применения тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala у больных с хроническим персистирующим гепатитом
Исследование проведено на 23 больных в возрасте 32-53 лет. Длительность заболевания составляла от 10 до 20 лет. У 79% больных в анамнезе был перенесенный вирусный гепатит A, у 11% - вирусный гепатит B.

Большинство больных предъявляли жалобы на боли в правом подреберье, общую слабость и быструю утомляемость, у 45% больных отмечались диспептические расстройства.

Все больные ранее получали периодически традиционные лекарственные средства.

Тетрапептид Lys-Glu-Asp-Ala вводили внутримышечно 1 раз в день в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела в течение 10-40 дней в зависимости от степени тяжести заболевания. Контрольная группа состояла из 12 аналогичных больных, которым назначалось традиционное лечение.

В динамике оценивали жалобы больных, проводили общеклиническое исследование крови и мочи, биохимическое изучение крови на аппарате "РЕФЛОТРОН" (Boehringer Mannheim, Германия), иммунологическое исследование периферической крови (определение Ig по Манчини). Ультразвуковое исследование печени проводили на УЗИ-аппарате (ALOKA, Япония).

На фоне проводимого лечения 93% больных отмечали исчезновение слабости, повышение аппетита и работоспособности. У 51% больных значительно снизилась интенсивность болевого синдрома.

Наиболее значительное внимание при проведении обследования больных уделялось оценке результатов биохимических исследований, характеризующих аминотрансферазную активность, пигментную и белковообразовательную функции печени.

У 72% обследованных больных отмечались гипербилирубинемия, повышение уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) и незначительное увеличение γ-глобулиновой фракции белков крови, в основном за счет IgM, что свидетельствует об определенной активности хронического воспалительного процесса.

Применение тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala способствовало нормализации уровня билирубина и активности АЛТ (табл. 4).

Исследование иммуноглобулинов периферической крови, являющихся существенным критерием активности воспалительного процесса, после курса лечения тетрапептидом показало снижение уровня IgM (табл. 5).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что применение тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala у больных хроническим персистирующим гепатитом способствует нормализации метаболических процессов в печени, снижению активности воспалительного процесса и предотвращает гибель гепатоцитов.

Источники информации
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства (Пособие для врачей). - Ч. I. - М.: Медицина, 1993. - С. 610-615.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства (Пособие для врачей). - Ч. II. - М.: Медицина, 1993 - С. 47-56.

3. Лекарственные препараты зарубежных фирм в России: Справочник. - М.: АстраФармСервис, 1993. - С. 501-502.

4. Grunnet N., Peng X., Tygstrup N. Growth factors and gene expression in cultured rat hepatocytes // J. Hepatol. - 1999. - Vol. 31, N 1. - P. 117-122.

5. Kaido T. , Yoshikawa A. , Seto S. et al. Hepatocyte growth factor supply accelerates compensatory hypertrophy caused by portal branch ligation in normal and jaundiced rats // J. Surg. Res. - 1999. - Vol. 85, N 1. - P. 115-119.

6. Ueki T., Kaneda Y., Tsutsui H. et al. Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats // Nat. Med. - 1999. - Vol. 5, N 2. - P. 226-230.

7. Imanishi J., Kamiyama K., Iguchi I. et al. Growth factors: importance in wound healing and maintenance of transparency of the cornea // Prog. Retin. Eye Res. - 2000. - Vol. 19, N 1. - P. 113-129.

8. Якубке Х.-Д., Ешкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. - М.: Мир, 1985. - 456 с.

Формула изобретения

1. Тетрапептид лизил-глутамил-аспартил-аланин общей формулы Lys-Glu-Asp-Ala.

2. Тетрапептид лизил-глутамил-аспартил-аланин общей формулы Lys-Glu-Asp-Ala, обладающий способностью стимулировать функциональную активность гепатоцитов.

3. Фармакологическое средство, стимулирующее функциональную активность гепатоцитов, содержащее активное начало и фармацевтически приемлемый носитель, отличающееся тем, что в качестве активного начала содержит эффективное количество тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala или его солей.

4. Средство по п.3, отличающееся тем, что оно содержит соли по аминогруппе, например, ацетат, гидрохлорид, оксалат.

5. Средство по п.3, отличающееся тем, что оно содержит соли по карбоксильным группам, например, соли натрия, калия, кальция, лития, цинка, магния или органических и неорганических катионов, например, аммония, триэтиламмония.

6. Средство по п.3, отличающееся тем, что оно предназначено для парентерального введения.

7. Средство по п.3, отличающееся тем, что оно предназначено для интраназального введения.

8. Средство по п.3, отличающееся тем, что оно предназначено для перорального введения.

9. Способ стимуляции функциональной активности гепатоцитов, заключающийся во введении пациенту фармакологического средства, содержащего эффективное количество тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala или его солей по аминогруппе, например, ацетат, гидрохлорид, оксалат, или его солей по карбоксильным группам, например, солей натрия, калия, кальция, лития, цинка, магния, а также органических и неорганических катионов, например, аммония, триэтиламмония в дозе 0,01 - 100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что средство вводят парентерально, интраназально или перорально.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8