Состав для лечения сквамозно-гиперкератотической формы рубромикоза стоп и кистей

 

Состав содержит следующие компоненты, мас.%: смесь 4-нитро- и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов при соотношении указанных компонентов 30 : 70 0,30-0,60; полиэтиленгликоль 400 79,65-79,80; полиэтиленгликоль 1500 16,95-17,10; диметилсульфоксид 2,80. Состав при наружном лечении сквамозно-гиперкератотической формы рубромикоза стоп и кистей, вызванной грибом Trichophyton rubrum, одновременно оказывает фунгицидный эффект и действие, нормализующее процесс кератинизации. 2 ил., 9 табл.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при лечении сквамозно-гиперкератотической формы рубромикоза стоп и кистей, вызванного патогенным грибом Trichophyton rubrum.

Лечение микозов стоп гладкой кожи представляет большие трудностей у лиц с нарушенным процессом кератинизации, эндокринными нарушениями (гиперкортицизм, сахарный диабет, гипотиреоз, дисбаланс половых гормонов), при таких тяжелых хронических заболеваниях, как туберкулез, болезни крови, онкологические заболевания. Так, у больных ихтиозом, кератодермиями микозы стоп регистрируются почти в половине случаев (В.М. Рукавишникова, Г. И. Суколин, В.Т. Куклин. Лечение и профилактика микозов стоп. Казань, 1994.-81 С. ).

Сквамозно-гиперкератотическая форма микоза на подошвах и ладонях характеризуется наличием на фоне шелушения гиперкератоза различной степени выраженности.

Известно широкое применение для местного лечения рубромикоза стоп и кистей 1). Серно-салициловой мази (сера осажденная -1,5 г; кислота салициловая - 0,9 г; вазелин до 30,0 г) и 2-5% настойка йода (П.Н. Кашкин, Н.Д. Шеклаков. Руководство по медицинской микологии. М.: Медицина, 1978. -324 С.; кн.: Фармакотерапия в дерматовенерологии. Под ред. В.Н. Мордовцева, З.Б. Кешилевой. Алма-Ата, 1994.- 89 С.). 2). Нитрофунгина-раствор, содержащий 2-хлор-4-нитрофенола-1,0 г, триэтиленгликоля - 10,0 г, спирта 50% до 100,0 г (М.Д. Машковский. Лекарственные средства, 1993, М.: Медицина. -С. 435; Справочник Видаль, 1997. Лекарственные препараты в России). Действующим веществом нитрофунгина является 2-хлор-4-нитрофенол. Применяют при поражении эпидермофитией межпальцевых складок стоп 2-3 раза в день. Продолжительность лечения 4-6 недель. Нитрофунгин по структуре и по назначению является прототипом предлагаемого состава, однако довольно частым осложнением после наружного применения является раздражение кожи. Поэтому препарат в настоящее время в клинической практике не применяется. 3). Эконозол - нитрат 1% или певарил в виде 1% крема и геля (В.М. Лещенко. Певарил в лечении микозов. Вестник дерматологии и венерологии. 1995.-N 4.-С.28-29). Препарат используют при гиперкератотических поражениях кожи подошвенных и ладонных областей два раза в день после коллоидной отслойки рогового слоя эпидермиса.

Обычно наружное лечение рубромикоза стоп и кистей состоит из 2 этапов: подготовительного и основного. Подготовительный этап преследует цель - удаление чешуек и гиперкератоза при сквамозно-гиперкератотической форме с помощью серно-салициловой мази, отслойки по Ариевичу молочно-салициловой мазью, салициловым коллодием. Основной этап лечения включает наружное использование антимикотических импортных препаратов (микосептин, нитрофунгин, клотримазол, ламизил и др.). Все вышеперечисленные препараты требуют длительного и многократного применения и не всегда обеспечивают высокий лечебный эффект.

Препаратов, которые при наружном лечении сквамозно-гиперкератотической формы рубромикоза кистей и стоп одновременно оказывают фунгицидный эффект и действие, нормализующие процесс кератинизации, в клинической медицинской практике нет.

Известно, что 4-нитро-5,7-дихлорбензофуроксан (1) и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксан (II) обладает фунгицидной активностью (Л. М. Юсупова, Ж. В. Молодых, Б. И. Бузыкин, И. Ф. Фаляхов, Н.Н. Анисимова, Г.П. Шарнин, В.В. Булидоров, С.И. Свиридов, Ф. С. Левинсон. "4-нитро и 6-нитро- 5,7-дихлорбензофуроксаны, обладающие фунгицидным действием". Патент РФ N 2032678 от 10.04.1995. Опубл. Бюл. N 10).

Известен фунгицидный состав на основе смеси 4-нитро (I) и 6- нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов (II) (И.Ф. Фаляхов, Л.М. Юсупова, Б. И. Бузыкин, Т. В. Гарииов, Ж. В. Молодых, В.Т. Куклин, О.В. Торбина, Р.Ш. Шаймарданов, B. C. Угрюмова, А.З. Равилов. "Фунгицидный состав". Патент РФ N 94018860/15 от 25.05.1994. Опубл. Бюл. 1996. N 11), применяемый для лечения дерматомикозов животных. Фунгицидный состав содержит смесь 4-нитро и 6-нитро-5,7- дихлорбензофуроксанов (Д.В), эмульгатор (ПАВ) и разбавитель (Р) в следующих соотношениях компонентов, мас.%: Д.В. 0,25-1,00; ПАВ 0,50-2,00; P - остальное. В качестве эмульгаторов применяются неионогенные поверхностно-активные вещества (ПАВ): ОП-7, ОП-10, моноалкилфениловые эфиры полиэтиленгликоля на основе полимердистиллята; неонол-натрий алкилполиоксиэтиленсульфат, стеарокс-6-полиэтиленгликоль моностеарат. Лечение животных, больных трихофитией и микроспорией, составами в концентрации Д.В. в них 0,50-1,00% привело к полному выздоровлению животных.

Известен способ получения смеси 4-нитро и 6-нитро-5,7- дихлорбензофуроксанов путем механического смешивания (Ж.В. Молодых, Б.И. Бузыкин, Л.М. Юсупова, И. Ф. Фаляхов. "Фунгицидный состав". Патент РФ N 2076803 от 22.04.1992. Бюл. Изобр. 1997. -N 10. -С. 126) и химическим методом (способ получения смеси 4-нитро и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов, обладающий фунгицидной, бактерицидной, спороцидной и вирулицидной активностью) (Л.М. Юсупова, Б. И. Бузыкин, Ж.В. Молодых, И.Ф. Фаляхов, И.Ш. Абдрахманов, Г.Х. Хисамутдинов, П.Г. Беляев, B.C. Угрюмова, А.3. Равилов, Н.Н. Анисимова, Г.Р. Юсупова. Патент РФ N 2051913 от 22.04.1992. опубл. Бюл. 1996, N 1).

Данные о лечении паразитарных болезней кожи человека, а именно при сквамозно- гиперкератотической форме рубромикоза стоп и кистей средствами на основе 4-нитро и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов (I и II) в литературе отсутствуют.

Задачей данного изобретения является разработка фунгицидного состава для наружного лечения сквамозно-гиперкератотической формой рубромикоза кистей и стоп, вызванных патогенным грибом Trichophyton rubrum.

Поставленная задача решается тем, что фунгицидный состав для наружного лечения сквамозно-гиперкератотической формой рубромикоза кистей и стоп содержит смесь 4-нитро и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов (Д.В. III), полиэтиленгликоли (ПЭГ) 400 и 1500, диметилсульфооксид (ДМСО) в следующих соотношениях компонентов, мас.%, приведенных в табл. 1.

Для лучшего понимания изобретения ниже приводятся примеры.

ПРИМЕР 1. Приготовление смеси 4-нитро и 6-нитро-5,7- дихлорбензофуроксанов (Д,В. III) III готовят путем механического смешивания компонентов 4-нитро и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов (I) и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксана (II) в соотношении 30:70 (мас. %).

ПРИМЕР 2. Получение фунгицидного состава - нитроксановой мази 0,5%.

Растворяют 0,5 г. III в 2,8 мл диметилсульфоксида. Затем порциями при тщательном перемешивании добавляют предварительно расплавленную основу - смесь ПЭГ-400 - 79,7 г. и ПЭГ-1500 - 17,0 г.

Аналогичным способом готовятся мази с другим составом компонентов.

ПРИМЕР 3. Изучение противогрибковой активности 0,5% нитроксановой мази.

Чашечный метод изучения противогрибковой активности мази нитроксановой основан на способности мази оказывать фунгицидное действие на культуру гриба Trichophyton rubrum, высеянную на твердую питательную среду.

Использован бактериологический метод оценки способности III к высвобождению из мази (А.Т. Андреева. Получение и исследование новых ветеринарных лекарственных форм фурагина, фуразолидона и фурацилина. Автореф. дис. канд. М. , 1973. -26 С.). В расплавленную и остуженную до 40-42^oC в среду Сабуро вливают 1 мл густой взвеси культуры гриба Trichophyton rubrum в физиологическом растворе, смесь хорошо перемешивают и вливают по 30 мл в чашки Петри. При застывании агара на его поверхности помещают стеклянный цилиндр с 0,5 г испытываемой мази. По размерам зон ингибирование роста гриба судят о способности мази к высвобождению лекарственного средства.

Результаты исследований показали, что диаметр зоны ингибирования роста гриба Trichophyton rubrum составляет 40 мм (фиг. 1). Полиэтиленгликолевая основа не проявляет фунгицидной активности (вся поверхность чашки заросла мицелием гриба Trichophyton rubrum).

ПРИМЕР 4. Лечение сквамозно-гиперкератотической формы рубромикоза стоп и кистей 0,5% нитроксановой мазью.

Лечение проводят на 2-х группах больных с гиперкератотической формой рубромикоза стоп и кистей по 20 человек в каждой.

Лечение больных I группы проводят 0,5% нитроксановой мазью. Для сравнительного изучения эффективности наружного лечения сквамозно-гиперкератотической формы рубромикоза кожи кистей и стоп проводят лечение больных контрольной II группы серно-салициловой мазью, которая применяется в клинической практике и является в данном случае прототипом по назначению.

Всем больным до начала лечения проводят полное микологическое обследование, включающее прямую микроспорию патологического материла в 20% растворе КОН и посев на среду Сабуро, этиологически подтверждающую грибковую природу заболевания. У всех больных наблюдается типичная клиническая картина заболевания, характеризующаяся мелкоотрубевидным шелушением, особенно ярко выраженным в складках кожи, гиперкератозом различной степени выраженности.

Лечение больных I группы проводят 0,5% нитроксановой мазью путем нанесения на очаги поражения один раз в сутки с последующей фиксацией под повязку. Клинико-лабораторный контроль за результатами терапии проводят на 3-й, 7-й и 14-й дни от начала лечения. Далее больных наблюдают в течение 6 месяцев.

Динамическое наблюдение показало, что в процессе наружного лечения наблюдалась следующая динамика клинических проявлений: мелкоотрубевидного шелушения в складках кожи ладоней и подошв не наблюдалось к 3 дню; истончение гиперкератотического слоя в очагах поражения к 7 дню от начала наружного лечения; пластинчатое шелушение на подошвенной и ладонной поверхности кистей и стоп исчезало к 7 дню от начала терапии. К 7 дню наблюдалось уменьшение гиперкератоза и к 10 дню клинические проявления гиперкератоза исчезают. После 14 дней наружного лечения не проводят. На 21-й день от начала лечения проводят контрольный осмотр: ни одного из наблюдаемых до лечения клинических признаков заболевания (красновато-синюшняя окраска, шелушение и гиперкератоз) не наблюдалось. Прямая микроспория патологического материала в 20% растворе КОН и посев на среду Сабуро дали отрицательный результат (фиг. 2).

В общих анализах крови и мочи до и после лечения статистически достоверных изменений не наблюдалось (табл. 2).

При изучении уровня холестерина, общего белка и белковых фракций осадочных проб сыворотки крови после проведенного лечения статистически значимых различий не выявлено (табл. 3).

Лечение больных II группы проводят серно-салициловой мазью. Методика лечения больных аналогична I группе: серно-салициловую мазь накладывают на пораженные участки кистей и стоп под повязку один раз в сутки. Курс лечения такой же - 2 недели.

Динамическое наблюдение показало, что шелушение и гиперкератоз уменьшаются к концу 14-дневного курса местного лечения при сохранении в очагах эритемы. Микроскопическое исследование патологического материала в 20% КОН были отрицательными, но при повторных клинико-лабораторных исследованиях на 21-й день после начала лечения, т.е. через неделю после окончания лечения, у 6 больных (30%) микроскопически были обнаружены элементы грибов. В общих анализах крови и мочи и аналогичных биохимических анализах сыворотки крови значимых различий до и после лечения не выявлено. Таким образом, при сравнительном изучении эффективности наружной терапии сквамозно-гиперкератотической формы рубромикоза кистей и стоп 0,5% нитроксановой и серно-салициловой мазями выявлено, что положительная динамика клинических проявлений (шелушение, гиперкератоз и эритема) значительно выражена при лечении больных 0,5% нитроксановой мазью. При контроле через 21 день после начала наружного лечения этиологическое выздоровление при лечении 0,5% нитроксановой мазью составило 100%, при лечении серно-салициловой мазью - 70%.

По результатам наших данных 0,5% нитроксановая мазь имеет неоспоримое преимущество перед применяемой для лечения сквамозно-гиперкератотической формы рубромикоза кистей и стоп серно-салициловой мазью в силу более выраженного фунгицидного действия и одновременной нормализации процессов ороговения.

ПРИМЕР 5. Токсикологические исследования смеси 4-нитро и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов (Д.В., III).

I. Исследования токсичности при введении в желудок.

При однократном введении III в желудок определяют параметры токсичности и изучают симптомы острого отравления. Острую токсичность изучают на белых крысах весом 170-200 г. Смесь III вводят в желудок в виде водной суспензии. В качестве эмульгаторов используют ОП-7 или ОП-10. Животным контрольной группы вводят в соответствующих количествах эмульсию, содержащую только эмульгатор. Учитывают следующие показатели: внешний вид и поведение животных, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к корму, подвижность, ритм и частоту дыхания, время возникновения и характер интоксикации, ее тяжесть, обратимость, сроки гибели животных или их выздоровления. Наблюдения за клиническим состоянием животных проводят в течение 14 дней. Для оценки токсичности определяют максимально переносимую дозу - МЦД; дозу, вызывающую гибель 50% животных -ЛД₅₀ и абсолютно смертельную дозу - ЛД₁₀₀, ЛД₅₀ и ее доверительные границы вычисляют по методу Литчфилда и Уилкоксона (М. Л. Беленький. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1963.-153 С.). Результаты исследований приведены в табл. 4.

II. Исследования токсичности при нанесении на кожу.

При однократном нанесении смеси III на кожу определяют параметры токсичности и симптомы острого отравления. На предварительно выстриженный участок кожи крыс (на спине) размером 2х2 см наносят смесь III в дозах от 500 до 5000 мг/кг. Наблюдения за клиническим состоянием животных проводят в течение 14 дней. Результаты исследований представлены в табл. 4.

Местное действие III исследуют на белых крысах массой 120-160 г по методикам (Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.: Медицина, 1970.-344 С.). Для изучения раздражающего действия смеси III опытных крыс делят на 8 групп.

Первой группе животных наносят ежедневно однократные аппликации водных суспензий III в концентрациях 0,25%; 0,50%; 1,00%; 5,00% на наружную поверхность ушной раковины. Второй группе животных водные суспензии в тех же концентрациях наносят на предварительно выстриженный участок кожи спины размером 2х2 см. Животным контрольных групп наносят дистиллированную воду с ПАВ. Обработку крыс всех групп проводят в течение 10-й дней. По истечении указанного времени берут кровь из хвоста для определения количества эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева, гемоглобина, выведение лейкоцитарной формулы по общепринятым методикам (Клиническая лабораторная диагностика ветеринарии. Справочное издание. М.: Агропромиздат, 1985. -287 С.). Учитывают следующие показатели: появление на месте аппликации гиперемии, отека, утолщение кожной складки и расчесов. Полученные данные обрабатывают статистически (И.А. Ойвин. Патфизиология, 1960. N 4. -С. 76-85). При исследовании местного действия на слизистой оболочке III вида водной суспензии в тех же концентрациях вносят однократно в конъюнктивальный мешок кролика в количестве 1-2 капли в течение 7 дней. При внесении оттягивают внутренний угол конъюнктивального мешка, затем в течение одной минуты прижимают слезно-носовой канал. Отмечают появление и выраженность гиперемии, отечность, инъекцию сосудов склеры и роговицы, измеряют ширину зрачка. Обращают внимание на состояние век. Оценивают влияние III на слизистую оболочку по характеру конъюнктивита (поверхностный, глубокий), кератита.

Количественную оценку кожно-резорбтивного действия III проводят на крысах. Животных фиксируют, выстригают на спине шерсть и препарат в виде суспензии наносят на выстриженные участки. Проводят учет клинических признаков отравления от разных доз III. Результаты исследований приведены в табл. 5, 6 и 7.

III. Изучение аллергенных свойств. Исследование сенсибилизирующих свойств проводят по методике (О.Г. Алексеев, Н.И. Шумская. Изучение сенсибилизирующих свойств в эксперименте. В кн. Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.: Медицина, 1970. -С. 275-281) на белых крысах массой 120-160 г и кроликах массой 2-2,5 кг. Перед опытом оценивают первично-раздражающее действие III на крысах путем накожных аппликаций в виде водной суспензии в концентрациях 0,25%, 0,5%, 1% и 10%. У животных предварительно выстригают волосы на участке спины размером 2х2 см у крыс, 5х5 см - у кроликов. Крысам аппликации делают в направлении от задней трети спины к голове, кроликам - в направлении от шеи к хвосту. Опытных крыс делят в разных количествах на 8 групп. Первым трем группам на поверхность кожи наносят и втирают однократно соответственно 0,25%, 0,5%, 1% суспензии в течение 15 дней; вторым трем группам - двукратно в день в течение того же времени. Контрольным группам по той же схеме применяют разбавитель (дистиллированная вода) с эмульгатором. Всего животным наносят на один и тот же участок кожи 10-30 аппликаций. Через 10 дней после нанесения последней аппликации на кожу свежевыстриженного участка спины наносят разрешающие дозы смеси III в тех же концентрациях.

Опытным кроликам выстригают два участка кожи с двух сторон от позвоночного столба, обрабатывают 70% спиртом и наносят скарификатором царапины. Затем на одну сторону наносят 0,01% раствор гистамина гидрохлорида, а на другую - соответственно исследуемые концентрации 0,25%, 0,5% и 1% суспензии смеси III.

Наблюдения за состоянием кожи животных проводят через 30 мин, 24 час, 48 час и 72 час (учитывают возникновение эритем, инфильтрации, изъязвления, некроза ткани). Результаты исследований приведены в табл. 6 и 7.

IV. Изучение кожно-резорбтивного действия.

Исследование кожно-резорбтивного действия смеси III (Ю.И. Кундиев. Методы изучения кожно-резорбтивного действия химических веществ. В кн.: Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.: Медицина, 1970. -С. 275-281). Реакцию организма крыс изучают в концентрациях 0,25%; 0,50% и 1,00% путем часовой экспозиции хвоста крыс в пробирках с суспензией III при температуре 28^oC. Хвосты контрольных животных помещают в пробирки с водой и ПАВ. Все пробирки находятся в водяной бане. О кожно-резорбтивном действии III судят по ежедневному наблюдению за физиологическим состоянием крыс в течение 14 дней.

V. Изучение кумулятивных свойств смеси III.

Кумулятивные свойства III изучают на белых крысах массой 120-160 г с использованием теста субхронической токсичности (Lim R.K., Rink K.G., Qlass H. G. , Soaje-Echaque E. Arch. Intern. Pharm. Therapie. 1961, Vol. 130, NN 3-4. -P. 336). Смесь в III в дозе от ранее установленной однократной ЛД₅₀ (составляющей 0,1) наносят накожно животным опытной группы первые 4 дня. Затем каждые последующие 4 дня дозу III повышают в 1,5 раза и наносят животным. Длительность опыта 24±4 дня. К концу опыта нанесенная доза достигает 8,5 ЛД₅₀. Оценивают результаты исследования по отношению к средним эффективным дозам острого и подострого действия. В течение опыта наблюдают за животными, учитывают: состояние (возбуждение, угнетение), характер и степень активности и координацию движений, реакцию животною на ориентировочные, тактильные и болевые раздражения, наличие тремора, судорог, парезов, параличей, выделений из глаз, носа, изменение цвета кожных покровов, изменение массы тела, пищевая возбудимость.

Приведенные токсикологические исследования показали, что смесь 4-нитро- и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов (III) имеет следующие параметры токсичности (табл. 4).

При нанесении однократно на кожу опытным крысам смесь (III) в дозах 500, 1000, 2500 и 5000 мг/кг не вызывает гибели животных.

Полученные данные позволяют отнести изучаемую смесь (III) к третьему классу умеренно опасных веществ при внутреннем введении и к четвертому классу малоопасных веществ при наружном применении (ГОСТ 12.1.007-76- "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности").

Как видно из полученных данных табл. 5, смесь (III) в концентрациях 0,25%, 0,50% и 1,00% не оказывает на кожу раздражающего действия и не изменяет физиологическое состояние крыс.

Изучение аллергенных свойств смеси (III) показало отсутствие контактного дерматита у крыс от концентраций 0,25- 1,00%. Кожа крыс оставалась в течение 72 час гладкой и блестящей. Показателем силы аллергенного воздействия, кроме местной реакции кожи, является общая реакция организма, проявляющаяся в увеличении числа эозинофилов в периферической крови.

Как видно из табл. 6 и 7, даже 30%-ные концентрации смеси (III) не вызывали повышения количества эозинофилов в периферической крови и оставались на уровне контрольных показателей. Количество эритроцитов и лейкоцитов, гемоглобин остаются в пределах нормы контроля от применения 5 и 10% концентраций III.

В опытах по определению аллергической реакции организма кроликов в ответ на 0,25-0,50% концентрации смеси III не наблюдалась реакция. После аппликаций 1% концентрации III через 24 час появился незначительный валик (уплотнение) по ходу царапины, который через 24 час исчез.

Проведенные исследования показывают, что смесь III в концентрации 0,25-0,50% не обладает аллергизирующим действием. Увеличение концентрации III до 1% может вызвать незначительную реакцию организма.

Как показали результаты по изучению кожно-резорбтивного действия, исследуемая смесь III в концентрациях 0,25, 0,50 и 1% не оказала токсического действия на физиологическое состояние животных. На коже хвостов не отмечено отека, покраснений, шелушения, подкожной инфильтрации, деструктивных явлений.

Однократное накожное применение смеси III даже в дозе 5000 мг/кг не вызывает гибели крыс. Местное действие характеризовалось гиперемией, шелушением кожи и выпадением волос.

В опытах по определению кумулятивных свойств смеси III при накожном применении не удалось вызвать гибели ни одной крысы, хотя каждое животное получило III суммарно в дозе 3813 мг/кг.

Таким образом, смесь 4-нитро и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов III в исследованных концентрациях и дозах не обладает раздражающим, аллергизирующим, кожно-резорбтивным и кумулятивным действием.

ПРИМЕР 6. Исследование генотоксической смеси 4-нитро и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов (нитроксана).

Оценка мутагенной активности проведена с применением теста Эймса. Тест Эймса даст возможность исследовать мутагенность как исходного препарата, так и его метаболитов.

Метаболические превращения соединения происходят в слое полужидкого агара, в который вместе с тест-культурой вносят микросомную фракцию, полученную из клеток печени крыс, предварительно обработанных индукторами монооксигеназ смешанных фракций.

Растворы препарата готовят в диметилсульфоксиде в стандартных концентрациях (1, 10, 100, 1000 и 10000 мкг/мл). Предварительным этапом для оценки на мутагенность является определение токсичности препарата по отношению к тесторным штаммам для исключения возможности получения ложноотрицательных результатов.

В пробирке с 3 мл мясного 0,6% мясопептонного агара (МПА) вносят 0,1 мл бактериальной суспензии нужного разведения и 0,1 мл вещества в исследуемой концентрации. Раствор перемешивают и наслаивают на нижний 2% питательный агар в чашке Петри. В негативный контроль вместо вещества добавляют 0,1 мл растворителя. После 24 час инкубации при 37^oC подсчитывают число колоний в опыте и контроля и вычисляют "процент выживания" или степень токсичности вещества.

Для оценки мутагенности препарата в полуобогащенный 0,6% верхний агар вносят 0,1 мл бактериальной суспензии, 0,1 мл исследуемого соединения, 0,5 мл микросомной активирующей смеси (MAC), содержащей кофакторы, а в случае оценки мутагенной активности метаболитов - дистиллированную воду (неполная MAC) - для оценки мутагенной активности исходного соединения. Все перемешивают и наслаивают на нижний селективный агар.

Полужидкий агар должен покрыть поверхность нижнего минимального агара ровным тонким слоем. Чашку оставляют при комнатной температуре на 30-40 мин и после полного застывания переносят в термостат при 37^oC. В опыте также ставят негативный и позитивный контроль.

В негативном контроле в слой верхнего агара вместе с суспензией бактерий добавляют также полную (либо неполную) MAC и 0,1 мл растворителя. В качестве позитивных контролей используют известные препараты, для которых показан мутагенный эффект в аналогичных модификациях опыта с метаболической активацией или без нее.

Без метаболической активации обычно используют нитрозометилмочевину (100 мкг/мл) для ТА 1535 и ТА 100 и нитрозогуанидин (5 мкг/мл) для ТА 1538 и ТА 98. С метаболической активацией циклофосфан (100 мкг/мл) - для ТА 100; 2 аминофлуорен (30 мкг/мл) - для И ТА 98. Учет результатов проводят через 48 час инкубации. Сравнивают число колоний - ревертантов в опыте и контроле.

Использованы штаммы Salmonella typhimurium TA 98 и TA 100, учитывающие соответственно мутации тина сдвига рамки считывания и замены пар оснований. Метаболическая активация, имитирующая превращение соединения в организме млекопитающих, осуществлялась с применением микросомальной фракции печени крыс. Результаты экспериментов представлены в табл. 8.

Каждое значение представляет собой среднее из трех повторностей, при этом среднеквадратическое отклонение не превышает 5%.

Нитроксан в концентрациях 100 мкг/чаш и 1000 мкг/чаш полностью подавлял рост тесторных бактерий, поэтому для дальнейших исследований в тесте Эймса нами были использованы следующие диапазоны концентраций: 0,1, 1, 10 мкг/чаш.

Результаты исследований препарата на мутагенную активность в тесте Salmonella/микросомы представлены в табл. 9.

Из данных, представленных в табл. 9, следует, что исследуемое соединение в данном диапазоне концентраций не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса без метаболической активации. Однако метаболическая активация in vitro микросомной активирующей смесью на основе микросомной фракции печени крыс приводят к повышению генотоксической активности исследуемого препарата. Нитроксан в концентрации 10 мкг/чаш вызывает почти 8-кратное превышение (7,84 раза на штамме TA 98 и 7,8 раз на штамме TA 100) над спонтанным фоном мутирования.

Таким образом, нитроксан является промутагеном - проявляет слабый мутагенный эффект в присутствии ферментов микросомной фракции млекопитающих.

Следовательно, состав в виде 0,5% нитроксановой мази обладает выраженным комплексным лечебным действием при сквамозно-гиперкератотической форме рубромикоза кистей и стоп, не обладает раздражающим, аллергизирующим, кожно-резорбтивным, кумулятивным и мутагенным действием.

Формула изобретения

Состав для лечения сквамозно-гиперкератотической формы рубромикоза стоп и кистей, вызванной грибом Trichophyton rubrum, содержащий действующее вещество - нитросоединение и разбавитель, отличающийся тем, что в качестве действующего вещества состав содержит смесь 4-нитро- и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов при соотношении указанных компонентов 30 : 70 соответственно, а в качестве разбавителя - смесь полиэтиленгликолей и диметилсульфоксида, при следующем соотношении компонентов, мас.%: Указанная смесь 4-нитро- и 6-нитро-5,7-дихлорбензофуроксанов - 0,30 - 0,60 Полиэтиленгликоль 400 - 79,65 - 79,80 Полиэтиленгликоль 1500 - 16,95 - 17,10 Диметилсульфоксид - 2,80

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11