Новый способ получения n-ацетил-(l)-4-цианофенилаланина ас- (l)-phe(4-cn)-oh и n-ацетил-(l)-n-амидинофенилаланин- циклогексил-глицин--(3-n-метилпиридин ия)-аланина ас-(l)- pаph-сhg-рal мe(3)-nh2

 

Описывается новый способ получения N-ацетил-(L)-4-цианофенилаланина соединения (IA), включающий стадии: а) объединения достаточного количества соединения (I), достаточного количества водного раствора, достаточного количества ацетонитрила и достаточного количества Субтилизина для взаимодействия с существенным количеством соединения (I) для создания реакционной среды и b) доведения рН реакционной среды до соответствующего значения рН в момент добавления Субтилизина и поддержания соответствующего рН до тех пор, пока реакция не закончится с получением соединения (IA). Описывается также способ получения Ac-(L)-pAph-Chg-Pal-Me-NH₂. Технический результат - обеспечение эффективного и действенного разделения рацемата, что позволяет легко выделять целевой продукт с высоким выходом. 2 с. и 28 з.п.ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к новому способу получения "N-ацетил-(L)-4-цианофенилаланина разделением рацемата этилового эфира N-ацетил-(D,L)-4-цианофенилаланина и к новому способу получения стереоизомера Ac-(L)-pAph-Chg-Pal Me(3)-NH₂ с использованием в качестве промежуточного соединения N-ацетил-(L)-4-цианофенилаланина.

Уровень, предшествующий изобретению Рацемические соединения N-ацетил-(D, L)-4-цианофенилаланин и Ac-(L)-pAph-Chg-Pal Me(3)-NH₂ раскрыты и описаны в заявке 08/428404, поданной 25 апреля 1995 г. , которая является частичным продолжением заявки США N 08/233054, поданной 26 апреля 1994 г., которая упоминается здесь в качестве ссылки. Конечный продукт Ac-(L)-pAph-Chg-Pal Me(3)-NH₂ используется как ингибитор фактора Ха.

Для разработки лекарств желательно получение стереоизомеров вместо рацематов, т. к. стереоизомеры могут обладать большими преимуществами по сравнению с рацематами, например, в плане повышенной эффективности меньшего числа побочных эффектов, более низких уровней или отсутствия токсичности и т. д. Иногда эти преимущества стереоизомера по сравнению с рацематом не известны до последних стадий разработки или даже до тех пор, пока лекарство не будет выпущено в продажу. Государственные структуры, которые утверждают выпуск лекарств на рынок, также предпочитают лекарственные средства, содержащие стереоизомеры, а не его рацемат. Поэтому желательна разработка способа получения стереоизомера соединения Ac-(L)-pAph-Chg-Pal Me(3)-NH₂. Ключевым промежуточным соединением для получения этого стереоизомера является стереоизомер N-ацетил-(L)-4-цианофенилаланин.

Для того чтобы разделить рацемат, необходимо выбрать один из множества методов, известных для этой цели. Некоторые примеры образования диастереоизомеров с последующими кристаллизацией или дифференцированной абсорбцией (хроматографией) (как описано в "Enantiomers, Racemates and Resolutions, J. Jacques, A.Collet and S.H.Wilen, Wiley (1981)), хроматографическим разделением в хиральной стационарной фазе, кинетическим разделением и ферментативным разделением. Известно, что разделение с помощью ферментов, в частности гидролаз или эстераз, применяется при разделении аминокислот, как описано в Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, Chapman and Hall, New York, 1984, Chap. 10 pp. 338-353; в Applications of Biochemical Systems in Organic Chemistry, Part I. J. B. Jones, C.J. Sih, и D.Perlman, Wiley, New York, 1976, Chap 4. pp. 107-401; а также в Chemistry of the Amino Acids, vol. 1. Wiley, New York, 1961, Chap 9. pp 728-750.

Даже после того, как способ выбран, специалисту необходимо провести широкую экспериментальную работу, чтобы подобрать нужный растворитель, сорастворитель (если требуется), температуру, продолжительность и другие условия для обеспечения эффективного и действенного разделения рацемата, что обусловило бы легкое выделение целевого соединения, высокие выходы, значительный избыток энантиомера и не слишком трудоемкий способ осуществления процесса. Настоящее изобретение позволяет решить эти проблемы по разделению N-aцетил(D, L)-4-циaнoфенилaлaнинa, L-изомер которого затем используется как промежуточное соединение в процессе получения Ac-(L)-pAph-Chg-Pal Me(3)-NH₂, Соединения (II).

Краткое описание изобретения Изобретением предлагается способ получения N-ацетил-(L)-4-цианофенилаланина соединения (1A): включающий стадии: а) объединения достаточного количества Соединения (I) достаточного количества водного раствора, достаточного количества ацетонитрила и достаточного количества Субтилизина для взаимодействия с существенным количеством соединения (I) для создания реакционной среды; и b) доведения pH реакционной среды до соответствующего значения pH в момент добавления Субтилизина и поддержания соответствующего pH до тех пор, пока реакция не закончится с получением соединения (1A).

Изобретение также касается способа получения соединения Ac-(L)-pAph-Chg-Pal Me(3)-NH₂, Соединения (II):

или его фармацевтически приемлемых солей, включающий стадии:
а) объединения достаточного количества Соединения (I)

достаточного количества водного раствора, достаточного количества Субтилизина для взаимодействия с существенным количеством соединения (I) для создания реакционной среды;
b) доведения pH реакционной среды до соответствующего значения pH в момент добавления Субтилизина и поддержания соответствующего pH до тех пор, пока реакция не закончится с получением Соединения (1A):

с) взаимодействия соединения (1A) с соединением (3):

с получением соединения (4):

d) превращения цианогруппы соединения (4) в амидиногруппу и метилирования азота в пиридильной группе с получением соединения (II).

Подробное описание предпочтительных вариантов
Следующие термины имеют значения, раскрытые ниже:
а) термин "Ас" или "ацетил" относится к функциональному фрагменту формулы:

b) термин "амидино" относится к функциональному фрагменту формулы:

с) термин "пиридил" относится к функциональному фрагменту формулы:

Стереоизомеры - общее название всех изомеров, которые отличаются друг от друга только расположением атомов в пространстве. Они включают изомеры соединений с более чем одним хиральным центром, которые не являются зеркальными отражениями друг друга (диастереомеры или диастереоизомеры). Термин "энантиомер" относится к двум стереоизомерам, которые представляют собой не совпадающие при наложении зеркальные отражения друг друга. Термин "хиральный центр" относится к атому углерода, к которому присоединены четыре различные группы. Номенклатура L/D или R/S используется в соответствии с IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9-37 (1984). Хиральное вещество может либо содержать равные количества R- и S- изомеров (или L- и D - изомеров), при этом оно называется "рацемическим" или "рацематом", либо оно может не содержать равных количеств R и S (или L- и D-изомеров) и тогда оно называется "оптически активным" или "нерацемическим".

Термин "разделение" означает разделение рацемической смеси на ее оптически активные компоненты.

Термин "энантиомерный избыток" или "эи" означает процент, на который один энантиомер, Е1, находится в избытке в смеси двух энантиомеров (Е1 + Е2), так что:

Термин (+) означает плюс энантиомер, (-) означает минус энантиомер.

Значок означает связь, которая направлена вперед от плоскости листа.

Значок означает связь, которая направлена назад (обратно) от плоскости листа.

Термин "фармацевтически приемлемые соли" включает такие соли присоединения кислот, которые получены взаимодействием с кислотами, например соляной, бромистоводородной, серной, азотной или фосфорной кислотами, и такими органическими карбоновыми кислотами, как уксусная, трифторуксусная, пропионовая, гликолевая, малеиновая, щавелевая, лимонная, салициловая, 2-ацетилоксибензойная кислоты, или органическими сульфокислотами, например метансульфокислотой, 4-толуолсульфокислотой и нафталинсульфокислотой. Конечно, и другие кислоты, хорошо известные в фармацевтической области, могут быть также использованы.

В используемом здесь значении под термином "аминокислота" подразумеваются аминокислоты природного происхождения, которые считываются с генетического кода и являются основными составными частями белков. Подразумевается, что "аминокислота" также включает, если иное не указано особо, и (L)-аминокислоты и (D)-аминокислоты, химически модифицированные аминокислоты, например аналоги аминокислот, те природные аминокислоты, которые, как правило, не входят в состав белков.

Аббревиатуры аминокислот, аминокислотных аналогов, подпадающих под объем данной характеристики, приводятся в таблице 1.

Схема 1: Разделение Соединения (1)
Схема 1: Разделение этилового эфира N-Ацетил-(D,L)-4-цианофенилаланина

Рацемат этилового эфира (Соединение (1)) разделяют с получением L-стереоизомера N-ацетил-4-цианофенилаланина (соединение (1A)), содержащего карбоксильную (кислотную) группу, тогда как получаемый D-стереоизомер в эфирной форме (Соединение (D-1)), практически не конвертируется в кислоту. Таким образом может быть осуществлено отделение кислоты, которую хотят получить, от ненужного эфира. В соответствии с нижеследующим более полным описанием кислота, получаемая данным способом, является, главным образом, L-изомером, что подтверждено ее высоким показателем "эи".

В соответствии с заявленным способом, достаточное количество Соединения (1), которое необходимо ввести в реакционную среду, по крайней мере, в два раза должно превосходить количество L-стереоизомера, которое хотят получить. Реакционная среда включает достаточное количество ацетонитрила и достаточное количество водного раствора. Эти достаточные количества требуются для обеспечения взаимодействия между добавляемыми реагентами согласно способу настоящего изобретения. В данном здесь значении "добавляемый реагент" подразумевает любое вещество, которое добавляется в реакционную среду.

Достаточным количеством ацетонитрила должно быть такое, чтобы растворить значительное количество соединения (1) в реакционной среде. Предпочтительно, соединение (1) растворимо в ацетонитриле и водный раствор медленно добавляют до тех пор, пока водный раствор не помутнеет. Помутнение раствора показывает, что часть соединения (1) выпадает в осадок, поэтому может требоваться дополнительное количество ацетонитрила для растворения осадка. Например, достаточное количество ацетонитрила составляет приблизительно от 5 до 95% по объему от объема реакционной среды и более предпочтительно приблизительно от 50 до 60% по объему. Предпочтительно концентрация соединения (1) составляет приблизительно 20-140 г/л реакционной среды и более предпочтительно приблизительно 35-65 г/л.

Достаточным количеством водного раствора должно быть такое, которое растворяет значительное количество фермента Субтилизина в реакционной среде. В используемом здесь смысле "водный раствор" есть раствор, содержащий воду, и более предпочтительно воду и другие добавки, которые способствуют увеличению выхода или фактора "эи". Термин "раствор" не означает обязательно, что какая-либо добавка или реагент, добавляемые к водному раствору, в нем растворены; это может также означать, что добавки диспергированы с образованием суспензии.

Например, водный раствор может также включать в качестве добавки достаточное количество неорганической соли, например хлорида калия, хлорида натрия, хлорида лития и т.п. Предпочтительно неорганической солью является хлорид калия. Считается, что функция неорганической соли заключается в стабилизации Субтилизина. Достаточным количеством неорганической соли является такое, которого достаточно для стабилизации Субтилизина. Это составляет приблизительно от 0,02 моля до приблизительно 0,20 моля на литр водного раствора. Например, 1М раствор хлорида калия вводят в реакционную среду в пределах приблизительно 10-15% по объему.

Достаточным количеством Субтилизина является такое, которое соединяется с соединением (1), ацетонитрилом и водным раствором. Достаточным количеством Субтилизина является такое его количество, которое способно вступать в реакцию с значительным количеством (практически со всем количеством полностью, если возможно) соединения (1). Это составляет от ~ 0,5 до ~ 10 миллиэквивалентов по весу от количества соединения (1).

pH реакционной среды измеряют, когда добавляют фермент и в случае необходимости pH доводят до соответствующего значения. Соответствующим является такое значение pH, при котором фермент осуществляет свою функцию. Предпочтительно соответствующие подходящие значения pH находятся в интервале ~ 5-9 и наиболее предпочтительно от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5. Во время реакции между соединением (1) и Субтилизином поддерживают соответствующее значение pH. Этот период составляет приблизительно от 15 минут до 4 часов, предпочтительно с перемешиванием или другим соответствующим способом, способствующим течению реакции. Любые пригодные средства могут использоваться для поддержания соответствующего pH, например добавление достаточного количества основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид лития, гидроксид аммония, карбонат натрия, карбонат калия предпочтительно в виде 1 М раствора или добавление буферного раствора, такого как, например, ацетат аммония, бикарбонат аммония, бикарбонат натрия, или фосфатного буфера, например кислого фосфорнокислого аммония, кислого фосфорнокислого натрия. Для контроля за pH реакционной среды может использоваться pH-метр.

Соединение (1A) можно выделить и собрать в соответствии с хорошо известными способами, например раствор разбавляют добавлением щелочного раствора неорганической соли, например бикарбоната натрия. Неорганическую фазу промывают органическими растворителями, такими как эфиры, хлорированные растворители, например метиленхлорид, хлороформ, толуол, гептан или этилацетат. Водный раствор подкисляют концентрированной кислотой, например соляной кислотой, до pH приблизительно от 1 до 3 и экстрагируют соединение (1A) органическим растворителем.

Таблица 2 и таблица 3
Таблица 2 и таблица 3 показывают сравнительные данные по ходу реакций с водным раствором и ацетонитрилом (таблица 2) и водным раствором и диметилсульфоксидом вместо ацетонитрила (таблица 3).

Колонка A показывает количество соединения (1) в граммах, используемое в опыте.

Колонка B показывает количество в миллилитрах (мл) диметилсульфоксида (DMCO) или ацетонитрила (CH₃CN), воды и 1 М раствора хлорида натрия, используемое для приготовления водного раствора.

Колонка C показывает используемое количество Субтилизина в миллиграммах (мг) и соответствующее значение в миллиэквивалентах (м-экв.) в расчете на вес соединения 1.

Колонка D показывает продолжительность опыта.

Колонка E показывает энантиомерный избыток полученного соединения (1A).

Колонка F показывает выход полученного соединения (1A).

Примечание:
1. DMCO, присутствующий в соединении (1A), очень трудно удалить.

2. Удаление DMCO выпариванием при 90^oC/8 мм рт.ст., растворением в этилацетате и промывкой водой (х3).

3. Соединение (1A) легко выделяется в твердом виде.

В графе 1 реакция проводится в присутствии неорганической соли (хлорид калия). В графе 2 реакция проводится без неорганической соли.

Эти опыты показывают эффективное и действенное разделение с легким выделением соединения (1A), с высокими выходами и высоким энантиомерным избытком при использовании ацетонитрила.

Схема 2
Схема 2 является продолжением Схемы 1 и показывает процесс получения соединения Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂, соединения (II).

На схеме 2, стадия A, соединение (3) связывается с соединением (1A) и получается соединение (4). Соединение (3) может быть присоединено азотным методом, например соединение (1А) растворяют в подходящем безводном органическом растворителе, таком как безводный диметилформамид или безводный метиленхлорид в атмосфере инертного газа, например азота. К этому раствору добавляют дифенилфосфорилазид, 1-4 эквивалента подходящего основания, например диизопропилэтиламина, и, по крайней мере, один эквивалент защищенной аминокислоты, соединение (3), растворенной в подходящем безводном органическом растворителе, например безводном диметилформамиде или безводном метиленхлориде. Реакция идет при перемешивании от приблизительно 1 до 15 часов. Продукт сочетания соединения (4) затем выделяют и очищают хорошо известными методами, например экстракцией, осаждением, кристаллизацией и флэш-хроматографией. Например, растворители выпаривают, продукт сочетания (4) осаждают этиловым эфиром, промывают и отфильтровывают.

На схеме 2, стадии В и D, цианогруппу соединения (4) переводят в амидиногруппу соединения (II). Этот перевод осуществляют путем аминолиза соответствующего метилтиоимидата соединения (5) (образованного реакцией цианогруппы соединения (4) с сероводородом) по методике, описанной Wagner et al., патент ГДР N 155954, опубл. 21, 1982 (повторно рассмотрен 9 ноября 1988), который здесь упомянут как ссылка.

Например, на схеме 2, стадия В, соединение (4) растворяют в органическом растворителе, таком как диметилсульфоксид. Добавляют органические основания, например пиридин, триэтиламин, диизопропилэтиламин, 2,6-лутидин, коллидин. Через раствор пропускают струей сероводород при комнатной температуре до тех пор, пока не израсходуется соединение (4). Реакцию можно поддерживать при комнатной температуре от 1 до 18 часов. Соединение (5) собирают хорошо известным методом, например осаждением и фильтрацией. Осадок затем промывают органическим растворителем, таким как диэтиловый эфир, и сушат в вакууме.

Схема 2: Синтез Ac-(L)-pAph-Chg-Pal-Me(3)-NH₂

Стадия C

На схеме 2, стадия C, пиридильную группу соединения (5) метилируют до образования соединения (6). Обычно для метилирования используют метилгалиды, например метилиодид, метилбромид или метилхлорид. Могут также быть использованы метилфторсульфонат, диметилсульфат, метил-толуол-п-сульфонат и другие метилирующие агенты, например, описанные в Zoltewicz and Deady, Adv. Heterocycl. Chem. 22, 71-121 (1978) и Duffin, Adv. Heterocycl. Chem. 3, 1-56 (1964), приведенные здесь в качестве ссылки. Предпочтительно используют избыток галоида металла и особенно предпочтителен избыток метилиодида. Реакцию проводят в среде растворителей, таких как спирты, например метанол, этанол, в среде ацетона, хлороформа, ацетонитрила, нитробензола и диметилформамида. Более предпочтительно проведение реакции в смеси ацетона и диметилсульфоксида и при перемешивании при комнатной температуре от одного до 24 часов. Соединение (6) выделяют в соответствии с хорошо известными методами, например избыток метилиодида выпаривают, а соединение (6) осаждают этиловым эфиром, собирают декантацией, промывают и сушат.

На схеме 2, стадия D, метилтиоимидат соединения (6) далее превращают в соответствующую амидиногруппу соединения (II). Предпочтительно соединение (6) растворяют в органическом растворителе, таком как метанол, более предпочтительно в присутствии уксусной кислоты. К раствору добавляют ацетат аммония. Предпочтительно, реакционную смесь нагревают до температуры в пределах от 40^oC до 65^oC, более предпочтительно, в интервале от 50^oC до 60^oC и выдерживают при этой температуре от 2 до 3 часов. Соединение (II) выделяют в соответствии с известной методикой, оно может быть выделено в виде фармацевтически приемлемой соли. Например, растворители выпаривают, остаток может быть растворен в ацетонитриле и осажден добавлением трифторуксусной кислоты, отфильтрован и высушен под вакуумом.

Следующие ниже примеры дают описание типичного синтеза в соответствии с показанным на схеме 1 и схеме 2. Следует иметь в виду, что эти примеры иллюстрируют изобретение, но не предназначены для ограничения объема данного изобретения. Специалисту будет понятно, что порядок выполнения стадий в схемах может быть произвольным.

Исходные вещества коммерчески доступны и легко приготавливаются хорошо известными специалистам способами.

Пример 1
(D, L)-N-ацетил-4-цианофенилаланин
Ac-(D,L)-Phe(4-CN)-OH
Стадия A: Диэтил 4-цианобензилацетамидо-малонат

В диоксане (400 мл) суспендируют диэтилацетамидомалонат (44 г, 0,203 моль), альфа-бром-п-толуолнитрил (40 г, 0,204 моль), иодид калия (10 г) и добавляют раствор этоксида натрия (4,6 г натрия в 200 мл сухого этанола). Смесь нагревают с обратным холодильником в течение 3-4 часов и оставляют на ночь. Выливают смесь на лед (2 л), отфильтровывают осадок, промывают водой и сушат в лиофилизаторе. Рекристаллизуют из метанола с получением 4-цианобензилацетамидомалоната в виде белых кристаллов (61 г, 91%).

Стадия B: Этиловый эфир N-(D,L)-ацетил-4-цианофенилаланина, Ac-(D,L) Phe(4-CN)-OEt.

В этаноле (0,6 л) суспендируют 4-цианобензил диэтилацетамидомалонат (41,97 г, 0,126 моль). Добавляют гидроксид натрия (6 М) со следующими интервалами: 10 мл (60 ммоль) в 0 минут, 10 мл (60 ммоль) через 30 минут, 5 мл (30 ммоль) через 3 часа. Перемешивают реакционную смесь с добавлением гидроксида натрия (6 М), пока не исчезнет исходное вещество (ТСХ, этилацетат, Rf = 0,63). Раствор разбавляют водой (100 мл) и доводят pH до 3 добавлением концентрированной соляной кислоты. Этанол выпаривают и полутвердый продукт подвергают лиофилизации в течение ночи с получением N-ацетил-4-цианобензил моноэтил-ацетамидомалонат.

Полученный таким образом N-ацетил-4-цианобензил моноэтилацетамидомалонат суспендируют в безводном диоксане (0,5 л) и нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 2,5-3 часов. Диоксан отгоняют, твердый осадок суспендируют в этилацетате (250 мл) и экстрагируют насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (3х), водой, соляной кислотой (0,5 М) и раствором соли (рассолом). Этилацетатный раствор сушат над сульфатом магния, фильтруют и выпаривают. Продукт рекристаллизуют из смеси этилацетат/гексан с получением 28,95 (88%) этилового эфира N-(L,D)-ацетил-4-цианофенилаланина.

Пример 2
Ферментативное разделение Ac-(D, L)Phe (4-CN)-OEt (6:4; D:L) и получение (L)-N-ацетил-4- цианофенилаланина, Ас-(L) Phe(4-CN)-ОН.

К раствору AC-(D, L)Phe (4-CN)-OEt (6:4; D:L; 67 г) в ацетонитриле (1 л) добавляют раствор хлорида калия (1 М, 241 мл) и воду (600 мл). pH раствора доводят от 7,3 до 6,9 и добавляют раствор Субтилизина Carlsberg (50 мг) в водном растворе хлорида калия (8 мл, 0,1 М), pH раствора поддерживают подтитровыванием гидроксидом натрия (1 М). Спустя 1 час добавляют раствор субтилизина (50 мг) в водном растворе хлорида калия (8 мл, 0,1 М) и поддерживают pH раствора, прикапывая гидроксид натрия (1 М). Спустя 2,5 часа добавляют раствор бикарбоната натрия (800 мл) и экстрагируют этилацетатом (4 х 800 мл). Этилацетатный раствор сушат над сульфатом магния и смесь отфильтровывают. Фильтрат концентрируют с получением Ac-(D) Phe (4-CN)-OEt в твердом виде (38 г, 95%, 90% эи). Водный слой подкисляют концентрированной соляной кислотой (56 мл) до pH 1. Экстрагируют водный слой этилацетатом (4 х 800 мл). Органический слой высушивают над сульфатом магния и смесь отфильтровывают. Фильтрат концентрируют и получают Ас-(L)Phe (4-CN)-ОН в твердом виде (21 г, 88%). Т пл. 124-126^oC. 99,4% эи.

Пример 3
N-Ацетил-(L)-п-амидинофенилаланин, Ac-(L)-pAph- (L)-Chg-(L)-PalMe(3)-NH₂.

Стадия A: N-t-бутилоксикарбонил-(L)- β -(3-пиридил)- аланинамид. Boc-(L)-Pal-NH₂,

Суспендируют Boc-(L)-Pal-OH (1,34 г, 5 ммоль) в метиленхлориде (50 мл) и охлаждают до -15^oC. Добавляют диизопропилэтиламин (963 мкл, 5,5 ммоль) и изобутилхлорформиат (715 мкл, 5,5 ммоль). Смесь перемешивают 15 мин при -15^oC. Через раствор пропускают сильный ток безводного аммиака (над твердым гидроксидом натрия) в течение около 3 минут. Смесь перемешивают 10 мин при -15^oC и 20 мин при комнатной температуре. Выпаривают метиленхлорид, добавляют этилацетат (70 мл) и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Сушат над сульфатом магния и выпаривают. Кристаллизуют из смеси этилацетат/гексан и получают Boc-(L)-Pal-NH₂ (0,98 г, 75%).

Стадия B: (L)- β -(3-пиридил)-аланин амид гидрохлорид Н-(L)-Pal-NH₂•2HCl.

Суспендируют Boc-(L)-Pal-NH₂ (0,98 г) в метиленхлориде (15 мл) при легком нагревании и добавляют раствор соляной кислоты (4 М, 10 мл) в диоксане. Спустя 30 мин выпаривают метиленхлорид и диоксан. Твердый остаток растворяют в метаноле, осаждают добавлением эфира и отфильтровывают продукт, получая H-(L)-Pal-NH₂•2HCl (0,86 г, 98%).

Стадия C: N-трет-бутилоксикарбонил-(L)-циклогексилглицин-(L)- β -(3-пиридил)аланин амид Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂.

В течение ночи в диметилформамиде (15 мл) перемешивают H-(L)-Pal-NH₂•2HCl (432 мг, 1,82 ммоль), Boc-(L)-Chg-OH (609 мг, 2,37 ммоль, 1,3 эквивалента), дициклогексилкарбодиимид (494 мг, 2,4 ммоль), гидроксибензотриазол (324 мг, 2,4 ммоль) и диизопропилэтиламин (4 ммоль) в ДМФА (15 мл). Диметилформамид выпаривают, добавляют этилацетат и оставляют смесь при комнатной температуре на 1 час. Отфильтровывают образовавшуюся диизопропилкарбодиимидциклогексилмочевину, экстрагируют раствор насыщенным раствором бикарбоната натрия (3х), сушат над сульфатом магния и выпаривают. Кристаллизуют при добавлении гексана с получением Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ (598 мг, 81%).

Стадия D: (L)-циклогексилглицин-(L)- β -(3-пиридил)- аланин-амида гидрохлорид H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂•2HCl.

Суспендируют Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ (1,27 г, 3,12 ммоль) в метиленхлориде (50 мл) и добавляют соляную кислоту (10 мл, 4 М в диоксане). Спустя 30 мин выпаривают диоксан и метиленхлорид, растворяют твердый остаток в метаноле и осаждают продукт добавлением эфира (200 мл), отфильтровывают, получая H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂•2HCl (1,12 г, 95%).

Стадия Е: N-Ацетил-п-цианофенилаланин-(L)-циклогексилглицин-(L)- -(3-пиридил)-аланин-амид Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂.

Перемешивают в течение ночи H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂•2HCl (1,13 г, 3 ммоль), Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH (0,84 г, 3,6 ммоль) диизопропилэтиламин (10 ммоль) и дифенилфосфорилазид (803 мкл, 3,6 ммоль) в диметилформамиде (30 мл). Выпаривают диметилформамид, осаждают эфиром, фильтруют и промывают эфиром до получения Ac-(L)-Phe (4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ (1,282 г, 82%).

Стадия F: N-Ацетил-(L)-п-тиоамидфенилаланин-(L) циклогексилглицин-(L)- β -(3-пиридил)-аланин амид Ac-(L)Phe (4-тиамид)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂.

В диметилсульфоксиде (20-40 мл) растворяют Ас-(L)-Phe(4-CN)- (L)-CHg-(L)-Pal-NH₂ (1,18 г, 2,28 ммоль) и добавляют пиридин (40 мл) и триэтиламин (14 мл). Через раствор при комнатной температуре в течение 30 мин пропускают сероводород. Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение ночи, выпаривают до малого объема и осаждают продукт диэтиловым эфиром. Помещают в холодильник на несколько часов, отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме до получения Ас-(L)-Phe (4-тиоамид)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ (1,26 г) в виде твердого желтого продукта.

Стадия G: Иодистоводородная соль N-Ацетил-п-метилтиоамидат-фенилаланин-циклогексилглицин-(L)-β -(3- метилпиридиний)-аланина Ac-(L)-Phe(4-метил тиоамидат)-(L)- Chg-(L)-Pal(Me)-NH₂•2HI

Суспендируют Ac-(L)-Phe (4-тиоамид)-(L)-Chg(L)-Pal-NH₂ (1,2 г) в диметилсульфоксиде (10-20 мл) и ацетоне (80 мл). Добавляют метилиодид (14 мл, 50 эквив. ). Оставляют реакционную смесь на ночь при комнатной температуре, выпаривают ацетон и избыток метилиодида. Осаждают диэтиловым эфиром (0,5-1,1). После выдержки при 4^oC в течение нескольких часов декантируют или отфильтровывают диэтиловый эфир и полутвердый продукт, оставшийся на стенках, промывают диэтиловым эфиром и этилацетатом. Продукт высушивают в вакууме и получают Ac-(L)-Phe (4-метилтиоамидат)-(L)- Chg (L)-Pal (Me)-NH₂•2HI (1,31 г).

Стадия H: Соль N-Ацетил-(L)-п-ацетамидофенил-аланин-циклогексилглицин-(L) β -(3-N-метилпиридиниум)-аланин-амида трифторуксусной кислоты.

Растворяют Ac-(L)-Phe (4-метилтиоамидат)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH₂•2HI (1,31 г) в метаноле (50 мл). Добавляют ацетат аммония (0,8 г). Нагревают смесь до 55^oC в течение 3 часов, выпаривают, растворяют в смеси ацетонитрил/вода: (0,1% трифторуксусная кислота) (1:1), фильтруют и подвергают лиофилизации с получением Ac(L)-pAphe-(L)-Chg-(L) -PalMe- NH₂•TFA (1,22 г).

Настоящее изобретение относится к получению промежуточного соединения (1A)-производного N-ацетил-L-фенилаланин, используемому в процессе получения Ас-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂, соединения (II). Последнее соединение пригодно для ингибирования белков свертывания крови и особенно для ингибирования ферментного фактора свертывания крови "Ха", как более полно описано в Заявке US 08/428404, поданной 25 апреля 1995 года, которая упоминается здесь в качестве ссылки. В используемом здесь смысле выражение "активность фактора Ха" означает способность фактора Ха, самого по себе или в совокупности с субъединицами, известными как протромбиназный комплекс, катализировать превращение протромбина в тромбин. Относительно "активности фактора Ха" термин "ингибирование" подразумевает как прямое, так и косвенное ингибирование активности фактора Ха. Прямое ингибирование активности фактора Ха может быть, например, осуществлено связыванием фактора Ха с пептидом или с протромбиназой таким образом, что предотвращается связывание протромбина с активным сайтом протромбиназного комплекса.

В данном здесь смысле термин "специфичный" при использовании относительно ингибирования активности фактора Ха подразумевает, что соединение ингибирует активность фактора Ха без значительного ингибирования активности других специфичных протеаз (при использовании одной и той же концентрации ингибитора). К таким иным специфичным протеазам относятся, например, такие, которые включены в каскадный процесс коагуляции, например тромбин, плазмин, трипсин и эластаза.

Несмотря на то, что при определенных болезненных состояниях образование кровяных тромбов внутри системы кровообращения является само по себе источником заболеваемости, абсолютно подавлять систему свертывания крови нежелательно, т.к. может возникнуть угрожающее жизни кровотечение.

Процесс свертывания крови является сложным, комплексным, включающим постепенно распространяющуюся серию энзимно-активируемых реакций, в которых проферменты плазмы последовательно активируются при ограниченном протеолизе. Упрощенно каскадный процесс свертывания крови делят на два направления - "внутреннее" и "внешнее". Эти направления сводятся к активации фактора X с последующей выработкой тромбина, действующего на протяжении всего "общего течения процесса".

Эти данные наводят на мысль о том, что "внутреннее" течение процесса играет важную роль в поддержании уровня и повышении образования фибрина, тогда как "внешнее" направление является решающим в плане начальной фазы коагуляции крови. Сейчас в целом признается, что свертывание крови физически инициируется образованием комплекса тканевый фактор/фактор VIIа. Однажды образовавшийся этот комплекс быстро вызывает коагуляцию путем активирования факторов IX и X. Вновь образованный Ха затем формирует комплекс (один к одному) с фактором VIIA и фосфолипидами. Этот так называемый протромбиназный комплекс ответственен за превращение растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин. По мере того как со временем развивается активность комплекса, фактор VIIa/тканевый фактор (внешний путь) протеазой Kunitz-типа подавляется ингибиторный белок, TFPI, который при образовании комплекса с фактором Ха может непосредственно ингибировать протеолитическую активность комплекса фактор VIIa/тканевый фактор. Для того чтобы поддерживать процесс коагуляции в присутствии ингибированной "внешней" системы, дополнительное количество фактора Ха вырабатывается за счет тромбин-медиированной активности "внутреннего" пути. Таким образом, тромбин играет двойственную "автокаталитическую" роль, опосредованную его собственной выработкой и превращением фибриногена в фибрин.

Автокаталитическая природа выработки тромбина есть важная гарантия безопасности от неконтролируемых кровотечений. Это обеспечивает тот факт, что при однажды заданном пороговом уровне протромбиназы, коагуляция крови пройдет полностью, результатом чего будет, например, прекращение кровотечения. Таким образом, чрезвычайно желательной является разработка средств, которые ингибируют коагуляцию при отсутствии прямого ингибирования тромбина.

Соединение Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂ является пептидным аналогом, синтезированным способом согласно изобретению, и представляет собой полезный ингибитор активности фактора Ха без существенного подавления активности других протеаз, участвующих в процессе свертывания крови.

Формула изобретения

1. Способ получения N-ацетил (L)-4-цианофенилаланина, соединение IA

включающий стадии: а) объединения достаточного количества соединения I

достаточного количества водного раствора, достаточного количества ацетонитрила и достаточного количества Субтилизина для взаимодействия с существенным количеством соединения I для образования реакционной среды и b) доведения рН реакционной среды до соответствующего значения рН к моменту добавления Субтилизина и поддержания соответствующего рН до тех пор, пока реакции не завершится с получением соединения IA.

2. Способ по п. 1, в котором достаточное количество ацетонитрила составляет от приблизительно 5 до 95% от объема реакционной среды.

3. Способ по п. 1, в котором достаточное количество ацетонитрила составляет приблизительно от 50 до 60% от объема водного раствора.

4. Способ по п.1, в котором водный раствор содержит достаточное количество неорганической соли.

5. Способ по п.4, в котором достаточное количество неорганической соли составляет приблизительно от 10 до 15% в расчете на объем 1 молярного водного раствора неорганической соли.

6. Способ по п.5, в котором неорганическая соль представляет собой хлорид калия.

7. Способ по п.1, в котором соответствующее значение рН реакционной среды доводят и поддерживают добавлением достаточного количества основания.

8. Способ по п.7, в котором основанием является гидроксид натрия.

9. Способ по п.1, в котором соответствующее значение рН реакционной среды доводят и поддерживают добавлением достаточного количества буфера.

10. Способ по п.9, в котором буфером является раствор фосфата.

11. Способ по п. 1, в котором соответствующее значение рН реакционной среды устанавливают и поддерживают в интервале примерно от 5 до 9.

12. Способ по п. 1, в котором соответствующее значение рН реакционной среды устанавливают и поддерживают в интервале примерно от 0,5 до 7,5.

13. Способ по п.1, далее включающий перемешивание реакционной среды до тех пор, пока не завершится реакция между достаточным количеством Субтилизина и существенным количеством соединения I в течение приблизительно от 15 мин до 4 ч.

14. Способ по п.1, в котором достаточное количество Субтилизина составляет приблизительно от 0,5 до 10 миллиэквивалентов по весу от количества соединения I.

15. Способ по п.1, включающий следующую стадию - выделение соединения IA из реакционной среды.

16. Способ получения соединения Ас-(L)-pAph-Chg-PalMe-NH₂, соединение II

или его фармацевтически приемлемых солей, включающий стадии: а) объединения достаточного количества соединения I

достаточного количества водного раствора, достаточного количества ацетонитрила и достаточного количества Субтилизина для взаимодействия с существленным количеством соединения I для образования реакционной среды, и b) доведения реакционной среды доя подходящего значения рН к моменту добавления Субтилизина и поддержания соответствующего рН до тех пор, пока реакция не закончится с получением соединения IA

с) сочетания соединения IA с соединением 3

с получением соединения 4

d) превращения цианогруппы соединения 4 в амидиногруппу и метилирования азота пиридильной группы для получения соединения II.

17. Способ по п.16, в котором достаточное количество ацетонитрила составляет от приблизительно 5 до 95% от объема водного раствора.

18. Способ по п.16, в котором достаточное количество ацетонитрила составляет приблизительно от 50 до 60% от объема водного раствора.

19. Способ по п.16, в котором водный раствор содержит достаточное количество неорганической соли.

20. Способ по п.19, в котором достаточное количество неорганической соли составляет приблизительно от 10 до 15% от объема 1 молярного водного раствора неорганической соли.

21. Способ по п. 20, в котором неорганическая соль представляет собой хлорид калия.

22. Способ по п.16, в котором соответствующее значение рН реакционной среды доводят и поддерживают добавлением достаточного количества основания.

23. Способ по п.22, в котором основанием является гидроксид натрия.

24. Способ по п.16, в котором соответствующее значение рН реакционной среды доводят и поддерживают добавлением достаточного количества буфера.

25. Способ по п.24, в котором буфером является раствор фосфата.

26. Способ по п.16, в котором соответствующее значение рН реакционной среды устанавливают и поддерживают в интервале примерно от 5 до 9.

27. Способ по п.16, в котором соответствующее значение рН реакционной среды устанавливают и поддерживают в интервале примерно от 6,5 до 7,5.

28. Способ по п.16, включающий также перемешивание реакционной среды до тех пор, пока не завершится реакция между достаточным количеством Субтилизина и существенным количеством соединения I в течение приблизительно от 15 мин до 4 ч.

29. Способ по п.16, в котором достаточное количество Субтилизина составляет приблизительно от 0,5 до 10 миллиэквивалентов по весу от количества соединения I.

30. Способ по п.16, включающий также стадию выделения соединения IA из реакционной среды.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3