Живая сальмонеллезная вакцина

 

Изобретение относится к применению живой сальмонеллезной вакцины и к новым живым сальмонеллезным вакцинам, не применявшимся ранее. Применение живых аттенуированных иммуногенных вакцинных штаммов сальмонелл Salmonella typhimurium Ssq/Sm 60/Rif 42 No. 4242 (депозиционный No. DSM 8433), Salmonella typhimurium Nal 2/Rif 9/Rtt 42 No. 4223 (депозиционный No. DSM 8432), Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12 No. 4266 (депозиционный No. DSM 8435), Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12K No. 4298 (депозиционный No. DSM 9362), Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12g No. 4297 (депозиционный No. DSM 9361), Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 3 No. 4296 (депозиционный No. DSM 9360), Salmonella infantis Ssq/Sm 153/Rif 7 No. 4289 (депозиционный No. DSM 8434), Salmonella anatum Ssq/Sm 81/Rif 21 No. 4279 (депозиционный No. DSM 8441), содержащих маркер, придающий чувствительность к антибиотикам группы макролидов (оболочечный маркер), для получения живой вакцины для цыплят, специфичной к определенному виду хозяина и обеспечивающей в случае развития инфекционного процесса у другого хозяина вследствие контакта со специфичным хозяином возможность проведения эффективных терапевтических мероприятий с использованием макролидов. 9 с. и 7 з. п. ф-лы, 1 ил. , 4 табл.

Изобретение относится к применению живой сальмонеллезной вакцины и к новым живым сальмонеллезным вакцинам, не применявшимся ранее.

Причиной большинства желудочно-кишечных инфекций человека, вызываемых сальмонеллами, являются зараженные продукты животного происхождения, особенно куры и куриные яйца. Будучи зараженными наиболее распространенным серотипом Salmonella enteritidis, они в настоящее время все больше и больше становятся причиной заболеваний. Это относится также ко всем продуктам питания, получаемым из животных при их массовом разведении Многие животные содержатся в тесноте, что провоцирует распространение заболеваний среди них.

Риск передачи инфекции от инфицированных животных человеку может быть уменьшен обычными ветеринарными мероприятиями, направленными на прерывание инфекционных цепей. Дальнейшая передача инфекции предотвращается соблюдением норм пищевой гигиены. Однако последние не всегда соблюдаются в процессе хранения и приготовления пищи.

Следовательно, необходимо исключить с самого начала возможность использования инфицированных животных как источник получения продуктов. Это может быть достигнуто, в частности, вакцинацией животных против сальмонеллезных инфекций.

Сальмонеллезные вакцины, пригодные для этого, должны соответствовать следующим требованиям: 1. Вирулентность вакцинных штаммов, используемых в производстве вакцин, должна быть таковой, чтобы, с одной стороны, гарантировать бессимптомную вакцинальную инфекцию, с другой стороны - обеспечить переживание вакцинных штаммов в тканях хозяина, как условие иммуногенности.

2. Далее, стабильность используемых вакцинных штаммов в отношении их вирулентности и защитных свойств должна быть гарантирована, т. е. должно быть гарантировано, что они не способны к реверсиям в дикий вирулентный штамм.

3. Для того, чтобы уменьшить вероятность инфекций, необходимо гарантировать, что вакцинные штаммы не выделяются постоянно в жизнеспособной форме, а способны только к кратковременному переживанию в окружающей среде.

Три вышеупомянутых условия, которым должна соответствовать живая вакцина, будут подробно рассмотрены ниже. Как указано выше под номером 1, производство подходящей живой сальмонеллезной вакцины основано на уменьшении вирулентности (аттенуации) патогенных сальмонелл при одновременном сохранении антигенных структур, и, таким образом, иммунного ответа со стороны хозяина. Одной из возможностей является использование делеционных мутантов, например pur- или aro-аксиотрофных клонов, в качестве вакцинных штаммов. Степень аттенуации таких вакцинных штаммов зависит от дефицита метаболитов in vivo, что может препятствовать хорошей адаптации в организме иммунизированного хозяина. В частности, в европейской заявке EP 0263528 описаны стабильные asp-мутанты Salmonella typhimurium с различной степенью уменьшения вирулентности. Посредством селекции соответствующих asp-мутантов могут быть получены вакцинные штаммы с уровнем аттенуации, адаптированным к различным видам хозяина.

Дальнейшая возможность аттенуации состоит в использовании вакцинных штаммов, уменьшение вирулентности которых может быть отслежено до уровня метаболических сдвигов (так называемые stwd-мутации или маркеры). Термин "метаболический сдвиг" охватывает все основные ферменты и функционально важные клеточные компоненты; соответственно трансляция, ДНК репликация, ДНК транскрипция и проницаемость в большей или меньшей степени нарушены ввиду функциональных изменений вследствие мутаций рибосомальных белков, РНК полимеразы, гиразы, пермеазы. В дальнейшем такие мутанты демонстрируют устойчивость к специфичным антибиотикам и другим субстанциям (токсичным субстанциям). Самым простым способом Stwd-мутанты могут быть получены в лабораториях как хромосомные антибиотикорезистентные мутанты. В европейской заявке EP 0263528 (которая может рассматриваться в качестве ближайшего аналога) описаны живые аттенуированные иммуногенные вакцинные штаммы, представляющие собой мутанты, резистентные к налидиксовой кислоте (Nal), стрептомицину (Sm) или рифампицину (Rif). Существуют неограниченные возможности для получения желаемого уровня аттенуации вакцинного штамма, адаптированного к каждому отдельному виду хозяина, особенно, если несколько stwd-маркеров инкорпорированы в один вакцинный штамм (двойной или тройной маркер).

Уровень техники в области "Аттенуация посредством stwd-мутаций" описан в следующих патентных публикациях: DD-WP 155294; DD-WP 218834; DD-WP 235828; DD-WP 253182; DD-WP 253184; DD-WP 281118; DD-WP 294420; ЕР 0263528.

Следующее условие, упомянутое выше под номером 2, состоит в том, чтобы аттенуированные вакцинные штаммы, полученные в результате мутаций, не подвергались реверсии в дикий вирулентный штамм. Требуемая стабильность может быть достигнута только при использовании вакцинных штаммов, которые или не обнаруживают реверсии в условиях in vitro, или обнаруживают уровень реверсии не выше 10^-7. Другой путь - использование вакцинных штаммов, имеющих несколько мутаций, которые независимо друг от друга уменьшают вирулентность штамма. При этом вероятность реверсии практически исключается.

Последнее требование к штамму, указанное выше под номером 3, касается "прерывания инфекционных цепей" в отношении риска возможного выделения и неограниченно долгого выживания вакцинного штамма вне вакцинированного хозяина. Желательно уменьшить выделение и способность к выживанию в окружающей среде вакцинных штаммов. С другой стороны, для того, чтобы гарантировать достаточный иммунный ответ, способность к выживанию вакцинных штаммов в тканях хозяина после перорального или парентерального введения не должна быть нарушена или должна быть лишь незначительно изменена.

Вакцинные мутантные штаммы, удовлетворяющие этим условиям, известны, например, из следующих патентных публикаций: DD-WP 218836, DD-WP 231491, DD-WP 253182, DD-WP 253183, DD-WP 253184 и в ЕР 0263528. В уровне техники предлагается для уменьшения выделения и способности к выживанию в окружающей среде оптимизировать вакцинные штаммы путем использования так называемых антиэпидемических маркеров. Понятие антиэпидемические маркеры характеризует широкий спектр мутаций наружной клеточной оболочки, вызывающих функциональное изменение ее проницаемости.

Вакцинные штаммы могут быть снабжены различными антиэпидемическими маркерами в зависимости от предполагаемого способа применения. В настоящее время известные антиэпидемические факторы подразделяются на 3 группы в зависимости от типа изменений в наружной мембране вакцинного штамма. Первая группа включает в себя так называемые hst-маркеры. Включение hst-маркера вызывает повышение чувствительности вакцинного штамма к желчи, анионным детергентам, антибиотикам группы макролидов и некоторым другим токсичным веществам. Благодаря высокой чувствительности к желчи уменьшается выделение штамма с фекалиями, вызванное произошедшей ранее инактивацией штамма в кишечнике. Если выделяются бактерии вакцинного штамма, то время жизни в окружающей среде у них ограничено из-за недостаточного мембранного барьера против tensides, макролидов и других токсичных веществ. Следовательно, при использовании вакцинных штаммов, включающих hst-маркеры, возможность инфекции может быть почти исключена. Однако в обычных дозах вакцинирования вакцинные штаммы, содержащие hst-маркеры, могут быть использованы только парентерально.

При пероральном использовании вирулентность вследствие высокой чувствительности к желчи изменяется в такой степени, что иммунный ответ может быть достигнут только при использовании чрезвычайно высоких доз вакцины.

Следовательно, при пероральном использовании необходимо использовать вакцинные штаммы с антиэпидемическими маркерами из двух других групп маркеров. Одна из групп включает так называемые rbt-маркеры (реверсия по отношению устойчивости к желчи). Rbt-маркер может быть получен путем мутации hst-маркера. Маркер обеспечивает вакцинный штамм такими же антиэпидемическими возможностями, как и hst-маркер. Однако по сравнению с hst-маркером вакцинные штаммы, содержащие rbt-маркер, устойчивы по отношению к желчи и, следовательно, могут быть использованы перорально без уменьшения вирулентности, что могло бы отразиться на эффекте вакцинирования. Та же самая точка зрения распространяется и на следующую группу, так называемые rtt-маркеры (реверсия по отношению к устойчивости к tensides). Rtt-маркер может быть получен мутацией rbt-маркера. Вакцинные штаммы, включающие rtt-маркер, устойчивы к tensides и одновременно обладают достаточными антиэпидемическими свойствами благодаря тому, что сохраняют высокую чувствительность к макролидам и другим токсичным веществам. Штаммы с rtt-маркером также могут использоваться перорально.

Используя данную информацию и материалы приведенных публикаций как основу, можно получить живые вакцины, отвечающие всем требуемым условиям. Адаптация к соответствующему типу хозяина может быть проверена с помощью серии тестов на животных.

Необходимо решить также некоторые другие проблемы.

Соблюдение всех предосторожностей не исключает возможности контакта персонала с вакциной, представленной хотя и аттенуированным, но патогенным штаммом. Это возможно в случае вакцинации животных или при производстве вакцины. В отношении здоровых людей риск инфицирования практически отсутствует. Однако, если иммунная система человека ослаблена (например, вследствие инфицирования вирусом иммунодефицита), то контакт с такими вакцинными штаммами может привести к сальмонеллезной инфекции.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является получение живой сальмонеллезной вакцины против сальмонеллезных инфекций, исходя из данных предшествующих исследований, которая была бы оптимально аттенуирована по отношению к хозяину, подлежащему иммунизации, обеспечивала бы гарантию незначительности выделения дикого штамма при использовании перорально или парентерально и не представляла бы никакого риска или только незначительную степень риска для людей с ослабленной иммунной системой.

Для решения этой задачи в формуле изобретения в независимом пункте 1 предлагается новое применение известной живой сальмонеллезной вакцины, а в независимых пунктах 2 и 6 - специфичная живая сальмонеллезная вакцина.

Сальмонеллезная вакцина в соответствии с п. 1 формулы создается на основе живого вакцинного штамма сальмонелл (см. , например, европейскую заявку ЕР 0263528). Известный сальмонеллезный вакцинный штамм включает оболочечный маркер, а также маркер аттенуации (например, ауксотрофный маркер или stwd-маркер), обеспечивая антиэпидемические свойства (уменьшение выделения из организма хозяина и уменьшение степени выживания в окружающей среде, соответственно). Введенный оболочечный маркер вызывает повышение чувствительности вакцинного штамма в отношении антибиотиков группы макролидов. Факт повышенной чувствительности к антибиотикам используется в дальнейшем для селекции соответствующих оболочечных мутантов, например, в производстве вакцинных штаммов. Согласно настоящему изобретению впервые показано, что повышенная чувствительность вакцинного штамма, содержащего оболочечный маркер, к макролидовым антибиотикам может быть использована в качестве средства безопасности при производстве таких вакцин. В том случае, если вакцинные штаммы, сконструированные подобным образом, вызывают инфекцию в другом хозяине, то с помощью макролидов может быть проведена эффективная терапия инфицированного хозяина. Эта цель достигается относительно легко посредством селекции только таких вакцинных штаммов, содержащих оболочечный маркер, размножение которых может контролироваться использованием макролидовых антибиотиков в разрешенных дозах.

Таким образом, известная живая сальмонеллезная вакцина, применяемая специальным образом согласно пункту 1 формулы изобретения, использует один или более живых сальмонеллезных штаммов, которые обнаруживают чувствительность в отношении макролидов благодаря наличию соответствующего оболочечного маркера.

В дополнение к оболочечным мутантам, имеющим повышенную чувствительность к гидрофобным антибиотикам (макролидам), описаны другие оболочечные мутанты (например, Hancock, R. E. W. : Ann. Rev. Microbiol. 1984, 38, 237-264), имеющие иногда различную степень проницаемости в отношении гидрофильных, гидрофобных и поликатионных антибиотиков. Такие оболочечные маркеры до настоящего времени не имели никакого значения при производстве живых бактериальных вакцин.

Независимый пункт 2 формулы изобретения впервые относится к живым сальмонеллезным вакцинам, содержащим в своем составе хотя бы один аттенуированный живой иммуногенный вакцинный штамм, имеющий приводящую к метаболическому сдвигу мутацию, включающую для достижения аттенуации устойчивость по отношению к антибиотикам к стрептомицину и к рифампицину. При этом живые штаммы сальмонелл, используемые в производстве живой сальмонеллезной вакцины, согласно изобретению дополнительно содержат оболочечный маркер, обеспечивающий им антиэпидемические свойства (прерывание инфекционных цепей) и, факультативно, чувствительность по отношению к макролидам, но в любом случае, чувствительность по отношению к какому-либо другому специфичному, терапевтически эффективному антибиотику группы хинолонов, хлорамфениколов или тетрациклинов. При этом вакцинные штаммы не имеют хромосомной антибиотикорезистентной мутации, исключающей повышенную чувствительность по отношению к указанному антибиотику.

Понятие хромосомной антибиотикоустойчивости в значительной степени включает в себя вышеупомянутые stwd-маркеры. Доказано, что при применении выбранных stwd маркеров и путем специфической комбинации нескольких таких маркеров, соответственно, уровень аттенуации вакцинных штаммов может быть оптимально адаптирован. После селекции таких хромосомных антибиотикозависимых мутаций для аттенуации вакцинных штаммов необходимо гарантировать сохранение ими повышенной чувствительности к терапевтически эффективным антибиотикам, вызванной оболочечным маркером. Следовательно, в процессе усовершенствования вакцинного штамма разумно сперва определить, какой именно терапевтически эффективный антибиотик можно применять для его обработки. В зависимости от этого выбирают вакцинный штамм и, соответственно, его хромосомную антибиотикоустойчивую мутацию для аттенуации вакцинного штамма.

Вакцинные штаммы могут быть относительно легко обнаружены путем использования выбранного специфичного антибиотика, таким образом, производство вакцинного штамма, снабженного соответствующим оболочечным маркером, не представляет большой проблемы. Предполагается, что в случае нежелательной инфекции, вызванной вакциной, будут использованы такие предварительно выбранные антибиотики для достижения хорошего результата в отношении используемого серотипа сальмонелл.

Кроме того, предполагается, что выбранный живой штамм получен из доминирующего серотипа.

Предпочтительные варианты осуществления живой вакцины, описанной в пункте 2 формулы изобретения, предложены в пунктах с 3 по 5.

Из пригодных для использования согласно изобретению оболочечных маркеров, обеспечивающих вакцинный штамм повышенной чувствительностью к антибиотикам группы хинолонов, хлорамфениколов или тетрациклинов, самым предпочтительным является оболочечный маркер, придающий вакцинному штамму повышенную чувствительность к антибиотику ципрофлоксацину, который в настоящее время является наиболее сильным антибиотиком в отношении сальмонелл. При изготовлении такого вакцинного штамма для аттенуации особенно желательно обеспечить мутацию сдвига метаболизма, приводящую к резистентности к стрептомицину и/или рифампицину. Устойчивость к этим антибиотикам не мешает возможной чувствительности вакцинного штамма к антибиотику ципрофлоксацину.

В зависимости от желаемого спектра действия живая сальмонеллезная вакцина в соответствии с изобретением может быть получена от одного или нескольких вакцинных штаммов различных серотипов O-групп В (например, Salmonella typhimurium), D (например, Salmonella enteritidis), С (например, Salmonella infantis) и Е (например, Salmonella anatum) как моно-, би-, три- или тетра-вакцина. В этой связи делаются отсылки к пункту 8 формулы изобретения, в котором определены наиболее подходящие вакцины.

Следующая проблема, о которой уже говорилось выше, заключается в том, что благодаря разной чувствительности каждый хозяин должен получить специфически адаптированную живую вакцину. В этой связи можно сослаться на уже выпускаемую вакцину из Salmonella typhimurium "Zoosaloral Dessau", которая достаточно иммунизирует телят после однократного перорального введения, однако не защищает цыплят от инфекции до тех пор, пока пероральная вакцинация не будет произведена три раза (см. Linde, К. et al. : Vaccine 1990, 8, 278-282). В отношении чувствительности к Salmonella typhimurium, зависящей от вида хозяина, может быть установлена иерархия: мыши > телята > куры. Из этого следует, что, к примеру, вакцинные штаммы Salmonella typhimurium для кур и цыплят должны иметь меньший уровень аттенуации (по сравнению с мышами) для компенсации меньшей чувствительности. Можно предположить, что то же самое относится и к другим серотипам сальмонелл.

Обнаружено, что время генерации живых сальмонеллезных вакцин обычно коррелирует с уровнем их аттенуации. Эта корреляция между временем генерации и уровнем аттенуации особенно заметна, если вакцинные штаммы имеют хромосомные резистентные мутации для аттенуации.

Соотношение между временем генерации и уровнем аттенуации позволяет относительно достоверно выбрать вакцинные штаммы, подходящие для определенного хозяина без предварительных опытов на животных. В связи с этим в пункте 6 формулы изобретения предложена живая вакцина, пригодная для иммунизации кур и цыплят, полученная, по меньшей мере, из одного аттенуированного вакцинного штамма, время генерации которого составляет примерно от 28 до 34 минут.

Штаммы вакцин с таким временем генерации имеют меньший уровень аттенуации (в сравнении с вакцинными штаммами телят и мышей), компенсируя низкую чувствительность кур и цыплят по отношению к Salmonella tyhimurium и другим серотипам сальмонеллы.

Как уже говорилось, эффективная сальмонеллезная вакцина особенно интересна в отношении к хозяину куры/цыплята.

Stwd-мутанты Salmonella typhimurium, которые депонированы или опубликованы к настоящему времени, не имеют прямого отношения к этому виду хозяина. В пункте 6 формулы изобретения представлены вакцины, которые могут быть или уже оптимально аттенуированы для кур/цыплят. В этом отношении вакцинным штаммам S. tm Nal 2/Rif - 9/Rtt придается особое значение, как оптимально аттенуированным для кур/цыплят. То же относится к вакцинному штамму S. tm Nal 2/Rif 9, который еще не депонировался в связи с данной заявкой, но должен быть упомянут в этом аспекте. Указанные вакцинные штаммы имеют время генерации около 32 минут. Исходя из этого факта получен "аттенуационный эквивалент времени генерации" для выбора оптимально аттенуированных других штаммов того же самого или других серотипов. Тем не менее, время генерации в отношении выбора подходящих вакцинных штаммов для кур/цыплят варьирует от 28 до 34 минут. Этот разброс времени отражает тот факт, что цыплята/куры имеют неодинаковую чувствительность к разным штаммам и штамм-зависимым различиям в вирулентности для каждого серотипа, соответственно. Небольшая серия опытов позволяет отобрать из предварительно выбранных вакцинных штаммов с генерационным временем от 28 до 34 минут штаммы, оптимально аттенуированные для кур/цыплят. Преимущество данного подхода в том, что по крайней мере на этапе преселекции эксперименты на животных могут быть опущены.

Удлиненное время генерации, определенное таким образом, затем может служить приблизительной цифрой для дальнейшего выбора будущих вакцинных штаммов (того же серотипа), или быть перенесено на другие серотипы этого рода, как эквивалент аттенуации.

Таким образом, для изготовления вакцины, наиболее подходящей для кур/цыплят, то есть выбранного вакцинного штамма, необходимо, чтобы его время генерации было продлено до 28-34 минут по сравнению с диким штаммом (22 минуты). Применяемый вакцинный штамм может, например, быть получен из дикого штамма, получившего стрептомициновый (Sm) маркер или маркер налидиксовой кислоты (Nal), благодаря чему время генерации удлинилось с 22 до 25-29 минут. Впоследствии был включен рифампициновый (Rif) маркер, как маркер, способствующий удлинению времени генерации.

Далее интересно отметить, что живая сальмонеллезная вакцина, предложенная в изобретении и предназначенная в особенности для хозяина куры/цыплята, содержит вакцинный штамм с повышенной чувствительностью в отношении специфичных, терапевтически эффективных антибиотиков.

Цыплята имеют по сравнению с другими видами хозяина, например по сравнению с человеком, телятами или поросятами, более короткую продолжительность жизни. Обычно их забивают после относительно короткого периода выращивания и продают в свежем или замороженном виде. Можно предположить, что ко времени забоя цыплята содержат живые бактерии вакцинального штамма, так как вакцинация произошла недавно. Бактерии при этом могут попадать в окружающую среду. Для нормальной популяции небольшое количество микробов не вызывает проблем.

Риск инфицирования в этом отношении может быть практически исключен. Тем не менее в индивидуальных случаях для пациентов группы риска с ослабленной иммунной системой (например, людей, инфицированных вирусом иммунодефицита) возможно возникновение инфекционного процесса с клиническими симптомами. Необходимо, особенно по отношению к этой группе людей, чтобы инфекция, вызванная вакциной, была контролируема быстро и без каких-либо проблем. В этом отношении встроенная чувствительность к терапевтически эффективным антибиотикам, как средство безопасности, является важной альтернативой, исключающей вероятность даже теоретически возможных оговорок.

Прототипом такого маркера безопасности и терапии является так называемый ssq-маркер. Имея ssq-маркер, вакцинные штаммы обладают гиперчувствительностью к препаратам из группы хинолонов, особенно к ципрофлоксацину, наиболее мощному современному антибиотику в отношении сальмонеллы. Ssq-маркер, также как и упомянутые выше hst-, rbt-и rtt-мутации, является оболочечным мутантом и, следовательно, также имеет выраженные противоэпидемические свойства, зависящие от толерантности и чувствительности к желчи или анионным детергентам соответственно.

Вакцина согласно настоящему изобретению может быть получена следующим образом: - на первом этапе, с целью получения штаммов с небольшой или средней аттенуацией, получают stwd-мутанты с фенотипом специфичной устойчивости к антибиотикам и временем генерации, удлиненным примерно на 3-6 минут по сравнению с дикими штаммами сальмонеллы; - на втором этапе из этих, незначительно или умеренно аттенуированных мутантов снова выделяют антибиотикорезистентные stwd-мутанты другого фенотипа с генерационным временем, удлиненным дополнительно на 3-6 минут. Таким образом получают серию потенциальных вакцинных штаммов с удлиненным временем генерации от 28 до 34 минут (дикий штамм около 22 минут), которые в отношении к S. tm на модели мыши при парентеральном введении показали нормированное LD₅₀ от 10⁵ до 10⁵ (дикий штамм - около 10¹) КОЕ (так как имеется линейная корреляция между генерационным временем, в случае его удлинения, и логарифмом LD₅₀). Затем цыплят в возрасте не моложе 36 часов иммунизировали однократно отдельными вакцинными штаммами этой группы в дозе 10⁹ КОЕ. Через две недели перорально заражали иммунизированных животных диким штаммом в дозе 10⁶ КОЕ и в заключение поддерживающим штаммом S. tm Nal 2/Rif 9 с удлиненным временем генерации, равным примерно 32 минутам (и при парентеральном введении LD₅₀ мыши около 10⁶ КОЕ), как наиболее подходящим прототипом вакцинного штамма с учетом соотношения "максимально возможное удлинение времени генерации/уровень аттенуации и при оптимально сниженной экскреции дикого штамма" для определения "эквивалента аттенуации удлиненному времени генерации" для других штаммов этого же серотипа и серотипов только со средней или недостаточной вирулентностью по отношению к мышам, соответственно; - на третьем этапе встраивают ssq-маркер "безопасности и терапии" в вакцинные штаммы с двойным маркером, аттенуированные с помощью stwd-мутации, для оптимизации вакцинных штаммов/увеличения возможности приема. Упомянутый ssq-маркер "безопасности и терапии" повышает примерно в четыре раза чувствительность к ципрофлоксацину (хлорамфениколу, доксициклину и т. д. ) и при этом незначительно снижает выделение и способность к выживанию в окружающей среде.

Описанная последовательность является произвольной; также могут быть использованы фенотипы, резистентные к токсичным веществам (см. , например, патент DD-WP 235828).

Далее в описании изобретения приводятся специальные штаммы вакцин сальмонеллы, имеющие время генерации от 28 до 34 минут, а также варианты этих вакцинных штаммов, имеющие более высокие или низкие уровни аттенуации и время генерации между 28 и 34 минутами. Рассматривается применение таких вакцинных штаммов для пероральной иммунизации цыплят также, как и для пероральной или парентеральной иммунизации кур против сальмонеллезных инфекций.

Вакцинные штаммы, указанные в пунктах формулы изобретения и приведенные в примерах выполнения, также, как и депонированные (с наличием или без ssq-мутации), представляют собой примеры вакцинных штаммов, которые могут быть произведены с фиксированной степенью аттенуации. Они пригодны для производства живой иммуногенной вакцины, особенно для цыплят/кур в соответствии с известными методами размножения. В отношении специально отобранных вакцинных штаммов, имеющих ssq-маркер (депозиционные номера 8433, 8435, 9362, 8434, 8441, 8432), указано генерационное время около 32 минут. Далее, специальные штаммы, имеющие ssq-маркеры, имеют генерационное время около 28 минут (депозиционный номер 9361) и около 30 минут (депозиционный номер 9360). Данное положение относительно генерационного времени не должно пониматься, как ограничительное. Принимая во внимание штамм-зависимую разницу в вирулентности (инвазивная способность/колонизационная активность), генерационное время от 28 до 34 минут также возможно как эквивалент аттенуации.

Приведенная табл. 1 показывает соответствие вакцинных штаммов сальмонелл различным серотипам.

Далее изобретение описывается подробно на нескольких примерах выполнения.

Примеры выполнения Материалы и методы Использованные штаммы - дикие штаммы: S. typhimurium (S. tm) 415 (Институт им. Мечникова, Москва), при парентеральном введении LD₅₀ для мыши менее 10¹ КОЕ, генерационное время около 22 минут.

S. enteritidis (S. ent) 318, (Проф. Selbitz, Университет Лейпцига),
при парентеральном введении LD₅₀ для мыши около 10⁵ КОЕ, генерационное время около 22 минут.

S. infantis (S. inf), (Доктор Beer, Veterinaruntersuchungsamt Chemnitz), генерационное время около 22 минут.

S. anatum (S. ana), (Доктор Beer, Veterinaruntersuchungsamt Chemnitz), генерационное время около 22 минут.

- дикие штаммы с нейтральной маркировкой устойчивости по отношению к налидиксовой кислоте и стрептомицину для детектирования уменьшенной экскреции в отношении иммунизированных цыплят/кур:
S. tm Nal/Sm, генерационное время около 22,5 минут
S. ent Nal/Sm, генерационное время около 22,5 минут
S. inf Nal/Sm, генерационное время около 22,5 минут
S. ana Nal/Sm, генерационное время около 22,5 минут
- дикие штаммы как пример для других двух- или трехмаркерных мутантов с низким (или высоким) уровнем аттенуации и, соответственно, с менее или более удлиненным временем генерации.

-S. tm Ssq/Sm 60/Rif 42, генерационное время около 31 мин, лабор. номер 4242; депозиционный номер DSM 8433.

-S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12, генерационное время около 32 мин, лабор. номер 4266, депозиционный номер DSM 8435.

-S. ent Ssq/SM 24/Rif 12k, генерационное время около 32 мин, лабор. номер 4298; депозиционный номер DSM 9362.

-S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12g, генерационное время около 28 мин, лабор. номер 4297; депозиционный номер DSM 9361.

-S. ent Ssq/Sm 24/Rif 3, генерационное время около 30 мин, лабор. номер 4296, депозиционный номер DSM 9360.

-S. inf Ssq/SM 153/Rif 7, генерационное время около 31 мин, лабор. номер 4289; депозиционный номер DSM 8434.

-S. ana Ssq/Sm 81/Rif 21, генерационное время около 32 мин, лабор. номер 4279; депозиционный номер DSM 8441.

-S. tm Nal 2/Rif 9/Rtt, генерационное время около 32 мин, лабор. номер 4223; депозиционный номер DSM 8432.

Они служили прототипом штамма (с оптимальной аттенуацией для цыплят/кур) для определения "аттенуационного эквивалента (удлиненного) генерационного времени".

Питательные среды
-Питательный агар (SIFIN, Berlin-Weissensee, ФРГ)
-Триптозно-фосфатный бульон (Difco, США)
Антибиотики
-налидиксовая кислота (CHINOIN, Budapest), МПК дикого штамма 6,2 мкг/мл
-стрептомицин (Jenapharm), МПК дикого штамма 6,2 мкг/мл
-рифампицин (UBM, Bucarest), МПК дикого штамма 12,5 мкг/мл
-ципрофлоксацин (Bayer), МПК дикого штамма 0,05 мкг/мл
-хлорамфеникол (Berlin-Chemie), МПК дикого штамма 2,0 мкг/мл
-доксициклин (Jenapharm), МПК дикого штамма 4,0 мкг/мл
-эритромицин (Abbot), МПК дикого штамма 60,0 мкг/мл
Подопытные животные и условия содержания
Цыплята от кур, несущих яйца с коричневым оттенком, из разных птицеводческих ферм содержались в клетках по 5-10 особей, получая куриный корм и воду в неограниченном количестве.

Пероральная иммунизация
Через 36 часов после вылупления или (в целях сравнения и определения оптимального возраста иммунизации) на четвертый день жизни цыплята, собранные в группы по 10, получили определенный штамм вакцины в дозе 10⁹, частично 10⁸ КОЕ, которую вводили им в пищевод. Иммунизация в естественных условиях также возможна с помощью питьевой воды (после четырехчасового лишения воды ее количество, выпитое каждым цыпленком в течение трех часов, принимается равным 2 мл).

Пероральное инфицирование
В течение от двух до четырех недель после пероральной иммунизации цыплята с помощью пипетки получили перорально дозу 10⁶ или 10⁷ КОЕ гомолога дикого штамма, меченого нейтрально.

Обнаружение экскреции
- вакцинного штамма S. tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12, S. inf Ssq/Sm 153/Rif 7 u S. ana Ssq/Sm 81/Rif 21:
питательная среда, содержащая 100 мкг рифампицина и 200 мкг стрептомицина/мл;
-вакцинный штамм S. tm Nal 2/Rif 9, имеющий или не имеющий rtt-маркер: питательная среда, содержащая 100 мкг рифампицина и 12,5 мкг налидиксовой кислоты/мл;
-нейтрально Nal/Sm меченые дикие штаммы: питательная среда, содержащая 100 мкг налидиксовой кислоты и 200 мкг стрептомицина.

Для каждой группы цыплят и дня исследования брали пять проб свежих испражнений, суспендировали в 2 мл физиологического раствора хлорида натрия и делали разведения от 10^-1 до 10^-4.

- Количественное определение: по 0,1 мл свежеприготовленной суспензии и разведения с помощью шпателя переносилось на питательный агар, содержащий по 1% лактозы, сахарозы и 0,015% бромтимолового синего (определение количества коли/энтеробактерий). Параллельно они помещались в ту же среду, содержащую соответствующий антибиотик.

В качестве количественной характеристики экскреции и колониеобразующей способности при иммунизации цыплят по сравнению с контролем определяли количество колоний сальмонелл в тысячных по отношению к количеству колоний энтеробактерий.

- Количественное определение: к оставшейся приготовленной суспензии был добавлен питательный раствор с антибиотиком. После инкубации при 37^oС в течение 24 часов сальмонеллы были перенесены на питательный агар, содержащий определенные добавки антибиотиков.

Подтверждение роста именно сальмонелл было получено серологически, биохимически и путем маркерного определения.

Пример 1.

S. tm: Выделение спонтанных хромосомальных антибиотико-резистентных клонов, таких как Nal-twd- одномаркерный и Nal/Rif-stwd- двухмаркерный штаммы с нормированно удлиненным генерационным временем от 29 до 34 минут (дикий штамм - около 22 минут). Изоляция прототипа вакцинного штамма проведена для определения "аттенуационного эквивалента генерационного времени (при его удлинении)" для штаммов того же серотипа или серотипов с умеренной вирулентностью (S. ent) или отсутствием вирулентности (S. inf, S. ana) в отношении мышей.

10⁹ (и 10¹⁰) КОЕ дикого штамма помещали с помощью шпателя в питательный агар, содержащий 100 мкг/мл (или в двухэтапном варианте 50 мкг сначала и 400 мкг впоследствии) и инкубировали в течение приблизительно 2 дней при 37^oС. Резистентные клоны были перенесены в питательный агар и было определено более или менее выраженное уменьшение экстинкции (Spekol, Zeiss-Jena, образцы в пробирках, длина волны 650 нм, начальное количество микробов 10⁷ КОЕ, инкубация в качающейся водяной бане в течение 3 часов при 37^oС). Генерационное время клонов, которые рассматривались как подходящие, измерялось посредством системы Abbott MS-2. Резистентные клоны, полученные, как описано выше, из клона Nal 2 на питательном агаре с 400 мкг/мл рифампицина, имели генерационное время 28 минут. Было определено генерационное время этих резистентных клонов и клоны Nal 2/Rif с нормированно удлиненным генерационным временем от 29 до 34 минут были использованы для определения приблизительных цифр показателя "генерационное время (при его удлинении), как эквивалент аттенуации" (см. пример 3).

Пример 2.

Определение полученной активности колонизации диких штаммов S. tm, S. ent, S. inf и S. ana, меченых нейтрально Nal/Sm в 17-25-дневных цыплятах.

С помощью пипетки цыплята в возрасте от 17 до 25 дней получили 10⁶ (или 10⁷) КОЕ нейтрально меченых диких штаммов. В течение периода с 10 до 15 дней количественно определялась колонизационная плотность сальмонелл в сравнении с числом энтеробактерий.

В данной модели заражения (доза 10⁶-10⁷ КОЕ) после перорального инфицирования, выделение нейтрально меченых диких штаммов с высоким микробным числом наблюдалось или уже через 24 часа, или число сальмонелл в испражнениях постепенно достигало максимума между третьим и шестым днем (50 тысячных от общего числа энтеробактерий). С 8 по 10 день число колоний сальмонелл снижается до значения от 1 до 0,1 тысячной от общей энтеробактериальной флоры и остается на этом уровне долгое время.

Приведенная динамика процесса колонизации указывает на то, что дикие штаммы, меченые нейтрально Nal/Sm, являются пригодными для определения пониженной способности к колонизации в иммунизированных цыплятах.

Пример 3.

Определение прототипа вакцинного штамма S. tm Nal 2/Rif, оптимального в отношении уровня аттенуации/генерационного времени для цыплят/кур посредством сохранения оптимального уровня уменьшения экскреции дикого штамма и максимально возможного удлинения генерационного времени / величины уровня аттенуации. Определен "аттенуационный эквивалент генерационного времени (при его удлинении)" для штаммов того же серотипа или серотипов с умеренной вирулентностью (S. ent) или отсутствием вирулентности (S. inf, S. ana) в отношении мышей.

Цыплята в возрасте не более 36 часов были перорально иммунизированы 10⁹ КОЕ разных штаммов из группы S. tm штаммов с двойным маркером, имеющих генерационное время между 29 и 34 мин, и через две недели перорально инфицированы диким штаммом в дозе 10⁶ КОЕ. Одновременно с этим были перорально инфицированы контрольные цыплята того же возраста.

По сравнению с контролем экскреция дикого штамма (определенная по плотности колонизации энтеробактерий в тысячных долях) у иммунизированных цыплят, получивших вакцинные штаммы с генерационным временем от 29 до 34 минут, была значительно снижена, особенно с пятого по десятый день после перорального введения. Эта разница, уменьшаясь со временем, лежит в интервале до двух порядков. С шестого по десятый день после перорального введения происходит выравнивание показателей плотностей колонизации у иммунизированных и контрольных цыплят (0,1 тысячная от количества энтеробактерий). Однако в индивидуальных случаях даже после десяти дней уровень экскреции у иммунизированных цыплят может быть снижен на одну логарифмическую степень.

Экскреция дикого штамма по отношению к вакцинным штаммам с генерационным временем более или равным 33 мин, снижена значительно меньше, различие с контролем в целом не превышает одного порядка. На основании соотношения "оптимального уровня уменьшения экскреции дикого штамма и максимально возможного удлинения генерационного времени/величины уровня аттенуации" в качестве прототипа вакцинного штамма был определен штамм S. tm Nal 2/Rif 9 с генерационным временем около 32 минут (и при парентеральном введении LD₅₀ для мышей около 10⁶ КОЕ). Пролонгированное генерационное время этого штамма, составляющее около 32 минут, было использовано в качестве ориентировочной цифры "аттенуационного эквивалента".

Пример 4.

Определение предпочитаемого вакцинного штамма, одинаково эффективного против инфекции, оптимально аттенуированного для цыплят/кур, эффективного, как при пероральной иммунизации, так и при парентеральной иммунизации. Определение проведено из штамма S. tm.

Nal 2/Rif 9 (при парентеральном введении LD₅₀ для мышей около 10⁶ (дикий штамм 10¹), удлиненное генерационное время, как аттенуационный эквивалент, от 22 до 32 минут.

а) Предварительные тесты, проведенные путем определения при парентеральном введении LD₅₀ соотношения для S. tm и S. tm. Nal 2/Rif 9 показали чрезвычайно большие различия в чувствительности цыплят/кур и мышей по отношению к Salmonella typhimurium.

В табл. 2 показаны различия в LD₅₀ для парентеральном введении для дикого штамма S. tm и вакцинного штамма S. tm. Nal 2/Rif 9 и дополнительно данные для LD₅₀ при парентеральном введении для дикого штамма в отношении 17-дневных цыплят.

Согласно табл. 2 LD₅₀ уровни для цыплят и мышей демонстрируют меньшую чувствительность цыплят по отношению к S. tm, что компенсируется меньшим уровнем аттенуации вакцинного штамма.

Обнаружено, что вакцинный штамм Salmonella typhimurium (с rtt-маркером или без него), наиболее подходящий для цыплят/кур, при пероральной или парентеральной иммунизации, обладает одинаковым защитным действием против инфекции.

Эквивалентное защищающее действие против инфекции-LD₇₅, полученное двумя неделями позже, и служащее критерием оптимальной аттенуации, может быть достигнуто однократной иммунизацией:
- путем парентерального введения цыплятам на второй день жизни штаммов S. tm Nal 2/Rif 9, S. tm Pur (при парентеральном введении LD₅₀ для мышей, равное 10^7,5 КОЕ) и Zoosaloral, чрезмерно аттенуированного для цыплят (при парентеральном введении LD₅₀ для мышей, равное 10^8,2 КОЕ): см. табл. 3;
- пероральной иммунизацией цыплят в течение 36 часов или на четвертый день после вылупления вакцинными штаммами S. tm Nal 2/Rif 9, S. tm Nal 2/Rif 9/Rtt, а также телячьей вакциной Zoosaloral, чрезмерно аттенуированной для цыплят, см. табл. 4.

Как показано в табл. 3, однократная парентеральная иммунизация любым вакцинным штаммом уменьшает смертность от инфекционного процесса с 75% до менее чем 30%.

Как показано в табл. 4, данное уменьшение смертности может быть получено при однократной пероральной иммунизации вакцинным штаммом S. tm 2/Rif 9 (имеющим или не имеющим rtt-маркер). Данный штамм оптимально аттенуирован для цыплят. Уменьшение смертности получено в противоположность Zoosaloral и мутантам с метаболическим сдвигом, имеющим генерационное время, большее или равное 33 минутам, и LD₅₀ при парентеральном введении, большую или равную 10^6,5 КОЕ.

Следовательно, таблица 3 показывает, что
- телячья вакцина Zoosaloral является чрезмерно аттенуированной,
- наименьшую эффективность защиты в отношении инфекций обеспечивает иммунизация на 4 день жизни. По-видимому, это происходит ввиду высокой устойчивости к колонизации на 4-ый день жизни, что должно влиять на коэффициенты транслокации и проникновения вакцинных штаммов.

Пример 5.

S. tm, S. ent и S. ana: Выделение спонтанных хромосомальных антибиотикоустойчивых клонов, таких как одно- и двухмаркерные вакцинные штаммы, оптимально аттенуированных для цыплят/кур посредством "аттенуационного эквивалента удлиненного генерационного времени" (см. также пример 1).

От 10⁹ до 10¹⁰ КОЕ дикого штамма помещали с помощью шпателя в питательный агар, содержащий 40 мкг/мл стрептомицина, и инкубировали примерно 2 дня при 37^oС. Резистентные клоны переносились в питательный агар, контролируемый в отношении приобретенной устойчивости. В предварительном опыте было определено более или менее выраженное уменьшение экстинции (Specol, Zeiss-Yena, образцы в пробирках, длина волны 650 нм, начальное количество микробов 10⁷ КОЕ, инкубация в качающейся водяной бане в течение 3-х часов при 37^oС). Генерационное время для клонов, которые могли рассматриваться, как подходящие, было измерено с помощью тест-системы Abbot MS-2. Как описано выше, на втором этапе из клонов с увеличенным на 3-6 минут временем генерации были получены клоны, устойчивые к рифампицину (питательный агар с 400 мкг/мл рифампицина). Было определено генерационное время этих клонов и установлено, что Sm/Rif клоны, имеющие время генерации примерно от 28 до 34 минут, наиболее предпочтительны как двухмаркерные вакцинные штаммы. Лучше использовать Sm-stwd-аттенуацию вместо Nal-stwd аттенуации (как гиразной мутации), т. к. ssq-маркер (см. пример 6), как оболочечная мутация, например в Sm/Rif вакцинном штамме, также обеспечивает гиперчувствительность к наиболее эффективному в настоящее время антибиотику ципрофлоксацину.

Пример 6.

Дополнительное включение в дикий и вакцинный штаммы ssq-маркера "безопасности и терапии", оптимизирующего вакцинный штамм и улучшающий его переносимость.

Свежую культуру суспендируют в PBS и обрабатывают 100 мкг/мл N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином (MNG, ZIMET, Jena) до выживаемости, равной 10%. Затем ее выдерживают 2 часа при 37^oС в питательном бульоне, содержащем 0,4 мкг хлорамфеникола, и обрабатывают обычным способом пенициллином 1000 МЕ/мл. Клоны с недостаточным ростом получены с помощью специальных технических приемов на питательном агаре, содержащем 0,4 мкг хлорамфеникола (0,01 мкг ципрофлоксацина, 1,0 мкг доксициклина) на 1 мл. Эти клоны определены как ssq-штаммы, гиперчувствительные к препаратам из группы хинолонов, и использованы как маркеры терапии и безопасности, оптимизируя и усиливая приемлемость вакцинного штамма. Они не дают рост на питательном агаре, содержащем 0,4 мкг хлорамфеникола, 0,01 мкг ципрофлоксацина или 1,0 мкг доксициклина (как и 30 мкг эритромицина) в мл, а также демонстрируют желаемую частоту реверсий, не превышающую 10^-7.

Частоту реверсии оболочечных мутантов лучше определять на питательном агаре, содержащем 20 или 30 мкг/мл эритромицина, чем на среде, содержащей высокие концентрации ципрофлоксацина, хлорамфеникола и доксициклина ввиду необходимости иметь большое количество микробов. Пригодными в качестве вакцинных штаммов являются клоны, имеющие ssq-маркер, у которых после мутагенной обработки вследствие коммутаций не удлиняется или незначительно удлиняется генерационное время / аттенуация.

Пример 7.

Выделение S. typhimurium, S. enteritidis, S. infantis и S. anatum вакцинных штаммов, как оптимально аттенуированных для цыплят/кур путем обнаружения одномаркерных мутантов метаболического сдвига (stwd) и двухмаркерных вакцинных штаммов для цыплят с приобретенной или изначальной инвазивной способностью.

Цыплят в возрасте не более 36 часов перорально инфицировали определенными дикими штаммами, stwd-одномаркерными мутантами и stwd-двухмаркерными мутантами соответственно, в дозе 10⁹ КОЕ. С пятого по восьмой день цыплят забивали, в асептических условиях извлекали печень, гомогенизировали, переносили на питательный агар и оставшийся материал смешивали с питательным раствором. Растущие колонии и, соответственно, культуры проверялись на наличие O-групп и маркера.

Что касается S. typhimurium и S. enteritidis, то через 5 дней число микробов на грамм печени было на уровне примерно 10³ КОЕ, а через 8 дней на уровне 10² КОЕ. Напротив, в отношении S. infantis и S. anatum полученное микробное число оказалось на границе определения, примерно равное от 10¹ до 10² КОЕ, а через 8 дней часто определение могло быть проведено только после дополнительного размножения бактерий. Эти более низкие цифры, полученные в отношении S. infantis и S. anatum, явно коррелируют с высказываниями U. Methner (докторская диссертация. University of Leipzig, Veterinary Medical Faculty, 1991) о том, что S. infantis является менее инвазивной для цыплят, чем другие.

Для успеха вакцинации особенно важен тот факт, что в большинстве случаев полученная инвазивная способность предпочитаемых штаммов, определенная по числу инкубированных колоний, не достигает значений гомологичных диких штаммов (Barrow, P. A. et al. , Res. Microbiol. , 1990, 141, pp. 851-853).

Пример 8.

Определение частоты (%) и продолжительности экскреции вакцинного штамма S. tm Nal 2/Rif 9 (с rtt-маркером или без него) после пероральной иммунизации цыплят не старше 36 часов, а также вакцинного штамма S. tm Nal 2/Rif 9 после пероральной иммунизации четырехдневных цыплят.

Частота экскреции вакцинного штамма с rtt-маркером или без него и максимально обнаруженное время экскреции в тестируемых образцах испражнений, зависящие от возраста цыплят на момент пероральной иммунизации, показано на чертеже.

На чертеже представлены следующие факты:
- в результате иммунизации в пределах 36 часов после вылупления вакцинный штамм S. tm Nal 2/Rif 9 выделяется более 32-х дней эксперимента. После включения rtt-маркера вакцинный штамм редко определяется через 3 недели после иммунизации;
- в результате иммунизации на 4-й день жизни, S. tm Nal 2/Rif 9 (без rtt-маркера) может быть лишь случайно обнаружен после 18-го дня, вероятно, это объясняется уже существующей устойчивостью к колонизации, вызванной анаэробными бактериями;
- частота (%) положительно аккумулированных культур аналогична этому. В отношении пероральной иммунизации в пределах 36 часов, S. tm Nal 2/Rif 9 может быть обнаружен примерно в 90% проб. Что касается вакцинного штамма, оптимизированного rtt-маркером, то только 40% проб являются положительными.

Динамика колониеобразования предпочтительных вакцинных штаммов S. tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12g, S. inf Ssq/Sm 153/Rif 7 и S. ana Ssq/Sm 81/Rif 21, была определена следующим образом: после перорального приема в дозе 10⁹ КОЕ в течение не более 36 часов после вылупления в течение более чем двух недель измерялась часть соответствующего вакцинного штамма в энтеробактериальной флоре образцов испражнений, и предпочтительные вакцинные штамы (см. выше) продемонстрировали характер экскреции, сопоставимый с вакцинным штаммом S. tm Nal 2/Rif 9/Rtt.

Пример 9.

Количественное снижение экскреции нейтрально Nal/Sm меченых гомологичных диких штаммов в иммунизированных цыплятах по сравнению с контролем.

Цыплята в возрасте не более 36 часов, получившие перорально моновалентные вакцинные штаммы S. tm Nal 2/Rif 9/Rtt, S. tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12k, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12g, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 3, S. inf Ssq/Sm 153/Rif 7 и S. ana Ssq/Sm 81/Rif 21 на 17 день жизни были заражены соответствующим гомологичным диким штаммом в дозе, равной 10⁶ (частично 10⁷) КОЕ. Параллельно был поставлен контроль с цыплятами того же возраста.

По сравнению с контролем экскреция дикого штамма (как и в случае с S. tm прототипом вакцинного штамма Nal 2/Rif 9) у иммунизированных цыплят была значительно понижена, особенно в первые 5-10 дней после контрольного заражения. (Измерение в тысячных от плотности колоний энтеробактерий). Эта разница, уменьшаясь со временем, лежит в интервале от десяти до десяти во второй степени. С шестого по десятый день после контрольного заражения происходит выравнивание показателей плотностей колонизации у иммунизированных и контрольных цыплят (0,1 тысячная от количества энтеробактерий). Однако в индивидуальных случаях даже после десяти дней уровень экскреции у иммунизированных цыплят может быть снижен на одну логарифмиическую степень.

Вряд ли можно ожидать полного исключения индивидуального заражения животных бактериями сальмонеллы, так как за исключением S. gallinarum pullorum эти болезнетворные микроорганизмы, вероятно, становятся похожими на "нормальную микрофлору" кур. Сильно уменьшенная экскреция в сочетании с соблюдением мер гигиены должны в недалеком будущем привести к появлению породы, не зараженной сальмонеллой.

Пример 10.

Повышенная чувствительность к детергентам.

По сравнению с дикими штаммами вакцинные штаммы S. tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12k, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12 g, S. ent Ssq /Sm 24/Rif 3, S. inf Ssq/sm 153/Rif 7, S. ana Ssq/Sm 81/Rif 21, S. tm Nal 2/Rif 9/Rtt демонстрируют повышенную чувствительность к анионным детергентам, особенно к SDS (додецил сульфат натрия). Так, вакцинные штаммы не дают роста на подходящей практически безбелковой питательной среде с концентрацией SDS, равной 0,5 мг/мл, в то время как дикие штаммы растут при 5 мг/мл.

Вакцинные штаммы, суспендируемые в физиологическом растворе хлорида натрия при комнатной температуре, претерпевают лизис через 30 минут в объеме 90% в то время, как уровень лизированных диких штаммов приблизительно равен 10%.

Из этих наблюдений можно сделать вывод о том, что вакцинные штаммы являются более чувствительными и, соответственно, имеют пониженную способность к выживанию во внешней среде, особенно, если выполняется санитарно-гигиеническая уборка.

Пример 11.

Отделение вакцинных штаммов от диких.

Отделение диких штаммов, относящихся к:
-S. tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12k, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 12g, S. ent Ssq/Sm 24/Rif 3, S. inf Ssq/Sm 153/Rif 7 и S. ana Ssq/Sm 81/Rif 21, было достигнуто, исходя из их резистентности к рифампицину (100 мкг/мл) и стрептомицину (200 мкг/мл) в питательном агаре так же, как и из отсутствия роста на питательном агаре, содержащем хлорамфеникол 0,4 мкг/мл (или, соответственно, 0,01 мкг ципрофлоксацина, 1,0 мкг доксициклина или 30 мкг эритромицина/мл).

- S. tm Nal 2/Rif 9/Rtt получено, исходя из резистентности к 100 мкг/мл рифампицина и 12,5 мкг/мл налидиксовой кислоты* в питательном агаре, а также из отсутствия роста на питательном агаре, содержащем 30 мкг/мл эритромицина.

* Снижение резистентности rtt-штамма к налидиксовой кислоте по сравнению с исходным Nal 2/Rif 9 штаммом явилось следствием rtt-мутации (включенной позже), ведущей к изменению проницаемости внешней мембраны.

Пример 12.

Массовое культивирование, приготовление и использование вакцинных штаммов.

Для производства живых вакцин вакцинные штаммы с двойным маркером без sqq-маркера, или штаммы с тройным маркером, имеющие ssq-маркер, инкубируются в подходящей полной питательной среде, как жидкая культура, до конца логарифмической фазы роста. Бактериальные суспензии смешивают с общепринятым стабилизатором и лиофилизируют.

Вакцинные штаммы, полученные таким образом, обычно предназначены для иммунизации цыплят не старше 36 часов в однократной дозе от 10⁸ до 10⁹ КОЕ. Куры обычно получают однократную поддерживающую дозу 10⁸ КОЕ перорально или 10⁹ КОЕ парентерально перед началом периода кладки яиц.

Формула изобретения

1. Применение живого аттенуированного иммуногенного вакцинного штамма сальмонелл Salmonella typhimurium Ssq/Sm 60/Rif 42 No. 4242 (депозиционный No. DSM 8433), содержащего маркер, придающий чувствительность к антибиотикам группы макролидов (оболочечный маркер), для получения живой вакцины для цыплят, специфичной к определенному виду хозяина и обеспечивающей, в случае развития инфекционного процесса у другого хозяина вследствие контакта со специфичным хозяином, возможность проведения терапевтических мероприятий с использованием макролидов.

2. Применение живого аттенуированного иммуногенного вакцинного штамма сальмонелл Salmonella typhimurium Nal 2/Rif 9/Rtt No. 4223 (депозиционный No. DSM 8432), содержащего маркер, придающий чувствительность к антибиотикам группы макролидов (оболочечный маркер), для получения живой вакцины для цыплят, специфичной к определенному виду хозяина и обеспечивающей, в случае развития инфекционного процесса у другого хозяина вследствие контакта со специфичным хозяином, возможность проведения эффективных терапевтических мероприятий с использованием макролидов.

3. Применение живого аттенуированного иммуногенного вакцинного штамма сальмонелл Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12 No. 4266 (депозиционный No. DSM 8435), содержащего маркер, придающий чувствительность к антибиотикам группы макролидов (оболочечный маркер), для получения живой вакцины для цыплят, специфичной к определенному виду хозяина и обеспечивающей, в случае развития инфекционного процесса у другого хозяина вследствие контакта со специфичным хозяином, возможность проведения эффективных терапевтических мероприятий с использованием макролидов.

4. Применение живого аттенуированного иммуногенного вакцинного штамма сальмонелл Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12k No. 4298 (депозиционный No. DSM 9362), содержащего маркер, придающий чувствительность к антибиотикам группы макролидов (оболочечный маркер), для получения живой вакцины для цыплят, специфичной к определенному виду хозяина и обеспечивающей, в случае развития инфекционного процесса у другого хозяина вследствие контакта со специфичным хозяином, возможность проведения эффективных терапевтических мероприятий с использованием макролидов.

5. Применение живого аттенуированного иммуногенного вакцинного штамма сальмонелл Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12g No. 4297 (депозиционный No. DSM 9361), содержащего маркер, придающий чувствительность к антибиотикам группы макролидов (оболочечный маркер), для получения живой вакцины для цыплят, специфичной к определенному виду хозяина и обеспечивающей, в случае развития инфекционного процесса у другого хозяина вследствие контакта со специфичным хозяином, возможность проведения эффективных терапевтических мероприятий с использованием макролидов.

6. Применение живого аттенуированного иммуногенного вакцинного штамма сальмонелл Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 3 No. 4296 (депозиционный No. DSM 9360), содержащего маркер, придающий чувствительность к антибиотикам группы макролидов (оболочечный маркер), для получения живой вакцины для цыплят, специфичной к определенному виду хозяина и обеспечивающей, в случае развития инфекционного процесса у другого хозяина вследствие контакта со специфичным хозяином, возможность проведения эффективных терапевтических мероприятий с использованием макролидов.

7. Применение живого аттенуированного иммуногенного вакцинного штамма сальмонелл Salmonella infantis Ssq/Sm 153/Rif 7 No. 4289 (депозиционный No. DSM 8434), содержащего маркер, придающий чувствительность к антибиотикам группы макролидов (оболочечный маркер), для получения живой вакцины для цыплят, специфичной к определенному виду хозяина и обеспечивающей, в случае развития инфекционного процесса у другого хозяина вследствие контакта со специфичным хозяином, возможность проведения эффективных терапевтических мероприятий с использованием макролидов.

8. Применение живого аттенуированного иммуногенного вакцинного штамма сальмонелл Salmonella anatum Ssq/Sm 81/Rif 21 No. 42796 (депозиционный No. DSM 8441), содержащего маркер, придающий чувствительность к антибиотикам группы макролидов (оболочечный маркер), для получения живой вакцины для цыплят, специфичной к определенному виду хозяина и обеспечивающей, в случае развития инфекционного процесса у другого хозяина вследствие контакта со специфичным хозяином, возможность проведения эффективных терапевтических мероприятий с использованием макролидов.

9. Живая сальмонеллезная вакцина для цыплят, содержащая, по меньшей мере, один живой аттенуированный иммуногенный вакцинный штамм, имеющий приводящую к метаболическому сдвигу мутацию, включающую для достижения аттенуации устойчивость к стрептомицину и к рифампицину, отличающаяся тем, что вакцинный штамм выбран из группы штаммов Salmonella typhimurium Ssq/Sm 60/Rif 42 No. 4242 (депозиционный No. DSM 8433) и/или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12 No. 4266 (депозиционный No. DSM 8435), и/или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12K No. 4298 (депозиционный No. DSM 9362), и/или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12g No. 4297 (депозиционный DSM 9361), и/или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 3 No. 4296 (депозиционный No. DSM 9360), и/или Salmonella infantis Ssq/Sm 153/Rif 7 No. 4289 (депозиционный No. DSM 8434), и/или Salmonella anatum Ssq/Sm 81/Rif 21 No. 4279 (депозиционный No. DSM 8441), причем вакцинный штамм снабжен оболочечным маркером, придающим штамму, наряду с факультативной чувствительностью по отношению к антибиотикам группы макролидов, повышенную чувствительность по отношению к антибиотику из группы хинолонов, хлорамфениколов или тетрациклинов, при этом вакцинный штамм не имеет хромосомной антибиотикорезистентной мутации, исключающей повышенную чувствительность по отношению к указанному антибиотику.

10. Живая сальмонеллезная вакцина по п. 9, отличающаяся тем, что оболочечный маркер обеспечивает вакцинному штамму повышенную чувствительность по отношению к антибиотику ципрофлоксацину.

11. Живая сальмонеллезная вакцина по п. 9, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере один вакцинный штамм серотипа О-группы В (например, Salmonella typhimurium), D (например, Salmonella enteritidis), С (например, Salmonella infantis) и Е (например, Salmonella anatum) в виде моно-, би-, три- или тетравакцины.

12. Живая сальмонеллезная вакцина по п. 11, отличающаяся тем, что представляет собой моновакцину и содержит штамм Salmonella typhimurium Ssq/Sm 60/Rif 42 No. 4242 (депозиционный No. DSM 8433), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12 No. 4266 (депозиционный No. DSM 8435), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12K No. 4298 (депозиционный No. DSM 9362), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12g No. 4297 (депозиционный No. DSM 9361), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 3 No. 4296 (депозиционный No. DSM 9360).

13. Живая сальмонеллезная вакцина по п. 11, отличающаяся тем, что представляет собой бивакцину и содержит два вакцинных штамма, выбранных из группы штаммов Salmonella typhimurium Ssq/Sm 60/Rif 42 No. 4242 (депозиционный No. DSM 8433) и Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12 No. 4266 (депозиционный No. DSM 8435), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12K No. 4298 (депозиционный No. DSM 9362), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12g No. 4297 (депозиционный No. DSM 9361), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 3 No. 4296 (депозиционный No. DSM 9360).

14. Живая сальмонеллезная вакцина по п. 11, отличающаяся тем, что она представляет собой тривакцину и содержит три вакцинных штамма, выбранных их группы штаммов Salmonella typhimurium Ssq/Sm 60/Rif 42 No. 4242 (депозиционный No. DSM 8433) и Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12 No. 4266 (депозиционный No. DSM 8435), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12K No. 4298 (депозиционный No. DSM 9362), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12g No. 4297 (депозиционный No. DSM 9361), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 3 No. 4296 (депозиционный No. DSM 9360), и Salmonella infantis Ssq/Sm 153/Rif 7 No. 4289 (депозиционный No. DSM 8434), или Salmonella anatum Ssq/Sm 81/Rif 21 No. 4279 (депозиционный No. DSM 8441).

15. Живая сальмонеллезная вакцина по п. 11, отличающаяся тем, что она представляет собой тетравакцину и содержит четыре вакцинных штамма, выбранных из группы штаммов Salmonella typhimurium Ssq/Sm 60/Rif 42 No. 4242 (депозиционный No. DSM 8433) и Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12 No. 4266 (депозиционный No. DSM 8435), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12K No. 4298 (депозиционный No. DSM 9362), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12g No. 4297 (депозиционный No. DSM 9361), или Salmonella enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 3 No. 4296 (депозиционный No. DSM 9360), и Salmonella infantis Ssq/Sm 153/Rif 7 No. 4289 (депозиционный No. DSM 8434), и Salmonella anatum Ssq/Sm 81/Rif 21 No. 4279 (депозиционный No. DSM 8441).

16. Живая сальмонеллезная вакцина по п. 9, отличающаяся тем, что вакцинный штамм имеет генерационное время примерно от 28 до 34 мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5