Изобретение относится к области контроля загрязнения окружающей среды, в частности, фосфорорганическими отравляющими веществами, инсектицидами, карбаматами и токсинами сине-зеленых водорослей. Комплект для определения ингибиторов холинэстеразы состоит из холинэстеразы сыворотки крови лошади, субстрата - бутирилтиохолина и индикатора на тиольную группу - 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевой соли. При этом фермент и субстрат с индикатором равномерно распределены соответственно на ферментном и субстрат-индикаторном элементах; иммобилизацию холинэстеразы проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в которой одновременно по двум каналам раздельно подаются буферный раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади и раствор глутарового альдегида. Импрегнирование проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который подают субстрат в органическом растворителе. Анализ проводят с использованием прижимного блока, который выполнен в виде двухстворчатой коробки. Достигается снижение предела обнаружения анализируемого соединения, погрешности результатов анализа и стоимости анализа. 3 з.п. ф-лы.
Изобретение относится к области контроля загрязнения окружающей среды, в частности, фосфорорганическими отравляющими веществами, инсектицидами, карбаматами и токсинами сине-зеленых водорослей.
В полевых условиях целесообразно использование для определения ингибиторов холинэстеразы (далее по тексту ХЭ) наиболее простых по устройству и удобных в эксплуатации технических средств типа "индикаторных билетов". Предложен ряд простейших технических средств на основе холинэстеразной реакции [1, 2].
Известен комплект для индикации ингибиторов холинэстеразы [1], состоящий из двух- или трехстворчатой подложки, на которой зафиксированы ферментный и субстратный элементы, изолированные друг от друга масками из фольги, а также контейнер с дистиллированной водой (далее по тексту индикаторный билет).
Конструкция индикаторного билета предусматривает расположение вокруг обоих элементов кромки, выступающей над уровнем подложки. Причем диаметры кромок вокруг субстратного и ферментного элементов выбраны в таких размерах, чтобы достигалось совмещение этих элементов при сложении билета пополам. Контейнер с водой размещен под ферментным элементом или на соседней (третьей) створке.
В состав комплекта также входит блок для предохранения от нарушения масок из фольги, изолирующих ферментный и субстратный элементы, а также контейнера с водой в процессе хранения.
Устройство для совмещения ферментного и субстратного элементов выполнено в виде щипцов для колки орехов. Данный комплект принят в качестве аналога предлагаемого технического решения. Аналог [1] имеет ряд недостатков.
Для производства аналога [1] необходима сложная технология, что существенно его удорожает. Не представляется целесообразным размещение контейнера на подложке индикаторного билета по соседству с ферментным элементом, поскольку нарушение целостности контейнера может привести к уменьшению срока хранения фермента и субстрата.
Необходимую для проведения контрольного анализа дистиллированную воду целесообразно хранить отдельно, например в глазной капельнице с герметично завинчивающейся пробкой. Недостатком аналога является и необходимость хранения каждого индикаторного билета в устройстве для совмещения ферментного и субстратного элементов во избежание нарушения ободков вокруг этих элементов, маски из фольги на ферментном элементе, а также контейнера с водой.
Известно техническое средство, названное авторами "биосенсор" [2], состоящее из двух элементов: Ферментного и субстрат-индикаторного. Ферментный элемент, содержащий ацетилхолинэстеразу, изготовлен из хлопковой ткани, модифицированной окислением перекисью водорода в щелочной среде в присутствии хлорида магния. Второй элемент изготовлен из фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором субстрата ацетилтиохолинйодида и реактива на тиольную группу 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) (реактива Эллмана).
Ферментный элемент изготовляют путем погружения полоски из модифицированной хлопковой ткани в буферный раствор ацетилхолинэстеразы (далее по тексту АХЭ) на 30 мин с последующей сушкой его на воздухе. Аналогично, путем погружения фильтровальной бумаги в спиртовый раствор ацетилтиохолинйодида и реактива Эллмана (с последующей сушкой на воздухе при 20
oС) получают субстрат-индикаторный элемент. Анализ зараженности пробы проводят погружением ферментного элемента в анализируемую воду (водный экстракт) на 30 минут, затем вынимают, совмещают с субстрат-индикаторным элементом и визуально наблюдают изменение окраски: в случае желтого окрашивания элемента делают заключение об отсутствии в пробе ингибитора ХЭ, отсутствие желтого окрашивания является критерием наличия в пробе ингибитора ХЭ.
Представленный выше "биосенсор" для определения ингибиторов ХЭ принят нами в качестве ближайшего аналога (далее по тексту прототипа).
Данный прототип имеет ряд недостатков. Как наиболее существенный среди них, следует отметить использование в качестве индикатора на тиольную группу реактива Эллмана, который с тиохолином (продуктом ферментативного гидролиза ацилтиохолинйодида) образует окрашенный в желтый цвет анион, с полосой поглощения в коротковолновом диапазоне видимого спектра (
mах:410 нм). Однако анализируемые пробы воды (водных экстрактов) сами могут быть окрашены в желтые и коричневые тона, что может приводить к увеличению погрешности результатов анализа, а подчас и к невозможности его выполнения. Наблюдение желтого окрашивания также может быть затруднено в сумерках и при искусственном освещении.
Другим недостатком прототипа является использование химического способа иммобилизации, который в данном случае предусматривает необходимость использования только высокоактивных, высокой степени очистки препаратов ХЭ, на что указывают сами авторы прототипа. Необходимость использования препаратов ХЭ высокой степени очистки ведет к существенному удорожанию "биосенсора", что усугубляется большим расходом препарата из-за его нанесения методом погружения.
Следует также отметить, что способ получения ферментного элемента путем погружения полосок модифицированной ткани в буферный раствор ХЭ не обеспечивает равномерность иммобилизации ХЭ на поверхности различных полосок из модифицированной ткани, а следовательно, и необходимую воспроизводимость результатов анализа. При использовании указанного способа изготовления субстрат-индикаторного элемента также не обеспечивается равномерность нанесения субстрата и индикатора на его поверхность.
Предлагаемое решение направлено на снижение предела обнаружения анализируемого соединения, погрешности результатов анализа и стоимости анализа.
Технический результат достигается тем, что в предлагаемом комплекте в качестве индикатора на тиольную группу используется индикатор 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль (далее по тексту БАС), продукт взаимодействия которой с тиохолином (продуктом ферментативного гидролиза субстрата карбоксилтиохолинйодида) окрашен в сине-фиолетовый цвет, т.е. имеет полосу поглощения в более длинноволновой области спектра (
max:580 нм) и значение мольного коэффициента поглощения
![](https://img.findpatent.ru/chr/949.gif)
для
max составляет 42000 л
![](https://img.findpatent.ru/chr/8226.gif)
моль
-1![](https://img.findpatent.ru/chr/8226.gif)
см
-1, что в три раза выше, чем для продукта взаимодействия реактива Эллмана с тиохолином, для которого значение
![](https://img.findpatent.ru/chr/949.gif)
для
max составляет 13600 л
![](https://img.findpatent.ru/chr/8226.gif)
моль
-1![](https://img.findpatent.ru/chr/8226.gif)
см
-1. Использование индикатора БАС существенно облегчает визуальную регистрацию аналитического эффекта, а также снижает погрешность результата анализа и предел обнаружения анализируемого соединения.
Для изготовления ферментного элемента использовалась холинэстераза сыворотки крови лошади, как наиболее стабильная и доступная.
В качестве субстрата при изготовлении субстрат-индикаторного элемента использовался бутирилтиохолинйодид, поскольку этот субстрат характеризуется более высокой гидролитической устойчивостью, чем ацетилтиохолинйодид, использовавшийся в прототипе. Преимуществом бутирилтиохолинйодида также является более высокая специфичность к нему холинэстеразы.
Следует отметить, что предлагаемое устройство, основанное на указанных выше реагентах, способно работать как в водной, так и воздушной среде. Принцип же работы предлагаемого устройства на примере экологического контроля водной пробы изложен ниже.
Технический результат также достигается тем, что в предлагаемом комплекте равномерность иммобилизации ХЭ на поверхности элемента достигается путем нанесения буферного раствора ХЭ на ленту из хроматографической бумаги (или ленту из другого пористого материала) в специальном устройстве для пропитки лент (производства КБ Тулаавтоматика), модифицированном путем замены пропиточной ванны открытым реактором с дисковой мешалкой, в который одновременно по различным каналам подаются буферный раствор препарата холинэстеразы и раствор глутарового альдегида (или другого связующего агента); иммобилизация холинэстеразы осуществляется при перемещении ленты из хроматографической бумаги с постоянной скоростью под открытым реактором. (Описание указанного открытого реактора представлено в авторском свидетельстве СССР 1384637, приоритет от 27 августа 1986 года) [3]. В данном случае для подачи в открытый реактор пропиточных растворов использовался двухканальный перистальтический насос. Предложенный способ иммобилизации обеспечивает не только равномерность нанесения ХЭ на поверхность ленты, но и ее несмываемость при погружении в анализируемую пробу воды или водного экстракта.
Изготовление субстрат-индикаторного элемента также проводилось в пропиточном устройстве с открытым реактором по той же технологии с тем лишь отличием, что в открытый реактор подавалась смесь бутирилтиохолинйодида и БАС в органическом растворителе (в частном случае в метиловом спирте).
Из изготовленных указанным выше способом лент вырезали соответствующие ферментный и субстрат-индикаторный элементы.
Для удобства проведения анализа и повышения воспроизводимости его результатов целесообразно введение в состав комплекта прижимного блока для совмещения ферментного и субстрат-индикаторного элементов. Прижимный блок выполнен из инертного прозрачного материала, например оргстекла, в виде двухстворчатой коробки, на внутренней поверхности нижней створки которой расположены два гнезда, предназначенные для совмещения ферментного и субстрат-индикаторного элементов. В одном из гнезд проводится анализ пробы, во втором - контрольный анализ с дистиллированной водой для оценки исходной активности иммобилизованной ХЭ в конкретных условиях проведения анализа пробы.
Определение содержания в анализируемой пробе воды (водного экстракта) ингибитора ХЭ проводилось следующим образом: ферментный элемент погружали в анализируемую воду (водный экстракт) на 10 мин (или наносили 3-4 капли анализируемой пробы на элемент с ХЭ, помещенный в одно из гнезд прижимного устройства). Через 10 мин ферментный элемент вынимали из анализируемой пробы, помещали в гнездо прижимного устройства, затем на ферментный элемент помещали субстрат-индикаторный элемент и через 3 минуты после совмещения элементов наблюдали окраску со стороны ферментного элемента. В случае отсутствия ингибитора в анализируемой пробе наблюдается сине-фиолетовое окрашивание. Отсутствие сине-фиолетового окрашивания ферментного элемента позволяет судить о наличии в анализируемой пробе ингибитора холинэстеразы.
Итак, предложен комплект для определения ингибиторов холинэстеразы в воде и водных экстрактах, состоящий из ферментного элемента с иммобилизованной холинэстеразой и субстрат-индикаторного элемента, импрегнированного субстратом - карбоксилтиохолином и индикатором на тиольную группу, что совпадает с существенными признаками прототипа.
При этом в качестве фермента используется холинэстераза сыворотки крови лошади, в качестве субстрата - бутирилтиохолин, в качестве индикатора на тиольную группу - 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль.
Кроме того, холинэстераза сыворотки крови лошади, равномерно распределена на ферментном элементе, а бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,3-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль равномерно распределены на субстрат-индикаторном элементе.
Кроме того, иммобилизацию проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который одновременно по двум каналам раздельно подаются буферный раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади и связующего реагента, а импрегнирование проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который подаются бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль в органическом растворителе.
Кроме того, в качестве связующего реагента использован глутаровый альдегид.
Кроме того, комплект содержит прижимный блок, который выполнен в виде двухстворчатой коробки, на внутренней поверхности коробки расположены два гнезда с плоским дном, предназначенные для совмещения ферментного и субстрат-индикаторного элементов, причем, в одном из гнезд проводится анализ пробы, во втором - контрольный анализ с дистиллированной водой для оценки исходной активности иммобилизованной ХЭ.
Далее покажем, что именно совокупность заявленных признаков обеспечивает достижение заявленного технического результата: снижения предела обнаружения анализируемого соединения, погрешности результатов анализа, а также уменьшения стоимости заявленного комплекта для определения ингибиторов холинэстеразы.
То, что в качестве фермента используется холинэстераза сыворотки крови лошади, в качестве субстрата - бутирилтиохолин, в качестве индикатора на тиольную группу - 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль, снижает стоимость исходного сырья, повышает надежность и точность результатов анализа вследствие более высокой гидролитической устойчивости субстрата и специфичности его реакции с ферментом, а также из-за того что цвет индикаторной окраски смещен в сине-фиолетовую область спектра, поддающуюся более точному визуальному контролю. Благодаря более высокому значению мольного коэффициента поглощения индикатора 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль достигается снижение предела обнаружения анализируемого соединения.
То, что холинэстераза сыворотки крови лошади равномерно распределена на ферментном элементе, а бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,6-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль равномерно распределены на субстрат-индикаторном элементе, способствует снижению погрешности результатов анализа, поскольку при этом снижается ошибка, связанная с неоднородностью цвета визуально контролируемой окрашенной области индикаторного элемента.
То, что иммобилизацию проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который одновременно по двум каналам раздельно подаются буферный раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади и связующего реагента, а импрегнирование проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который подаются бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль в органическом растворителе, также повышает точность измерений за счет повышения качества изготовления комплекта с использованием регулярной технологии. При этом также снижается себестоимость изделия за счет увеличения производительности, при одновременном повышении точности измерений за счет повышения равномерности нанесения реагентов на несущие поверхности.
То, что в качестве связующего реагента использован глутаровый альдегид, повышает надежность комплекта, его сохранность, в процессе хранения и использования.
То, что комплект содержит прижимный блок, который выполнен в виде двухстворчатой коробки, на внутренней поверхности коробки расположены два гнезда, предназначенные для совмещения ферментного и субстрат-индикаторного элементов и их прижима друг к другу, причем, в одном из гнезд проводится анализ пробы, во втором - контрольный анализ с дистиллированной водой для оценки исходной активности иммобилизованной ХЭ в условиях проведения анализа, повышает надежность произведенного анализа, поскольку обеспечивает повторяемость и регулярность производимых манипуляций.
Таким образом, показано, что совокупность существенных признаков предлагаемого решения обеспечивает достижение заявленного технического результата.
Проведенные эксперименты подтвердили работоспособность предложенного изобретения.
Использованные источники 1. WO 85/04424, 10 Oktober 1985, C 12 Q 1/46, С 12 N 11/12, Detector kit for indication of nerve gases and other cholinesterase-ingibitors.
2. WO 94/05808, 17 March 1994, C 12 Q 1/46, C 12 N 11/12, Biosensor for and distinguishing between cholinesterases ingibitors (прототип).
3. Авторское свидетельство СССР 1384637, приоритет от 27 августа 1986 года.
Формула изобретения
1. Комплект для определения ингибиторов холинэстеразы, состоящий из ферментного элемента с иммобилизованной холинэстеразой и субстрат-индикаторного элемента, импрегнированного субстратом - карбоксилтиохолином и индикатором на тиольную группу, отличающийся тем, что а качестве фермента содержит холинэстеразу сыворотки крови лощади, в качестве субстрата - бутирилтиохолин, в качестве индикатора на тиольную группу - 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо-)-фенилдисульфида тетракалиевую соль.
2. Комплект по п. 1, отличающийся тем, что холинэстераза сыворотки крови лошади равномерно распределена на ферментном элементе, а бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевая соль равномерно распределены на субстрат-индикаторном элементе.
3. Комплект по п. 1, отличающийся тем, что холинэстераза сыворотки крови лошади иммобилизована путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который одновременно по двум каналам раздельно подают буферный раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади и раствор связующего реагента, а импрегнирование проводят путем продвижения ленты из волокнистого материала под открытым реактором с дисковой мешалкой, в который подают бутирилтиохолин и 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевую соль в органическом растворителе.
4. Комплект по п. 3, отличающийся тем, что в качестве связующего реагента используют глутаровый альдегид.