Синтетические пептиды, применяемые в биологических тестах для обнаружения инфекций, вызванных вирусами вич-1 группы 0

 

Изобретение относится к новым синтетическим пептидам мономерного типа с 13-33 аминокислотами или димерного типа с 26-66 аминокислотами линейной или циклизованной интерцистеиновыми дисульфидными мостиками формы, соответствующей формуле (I) Δ-Z-Trp Gly Cys-Θ-Cys Tyr Thr Ser-Ω, (I) вкоторойΔозначаетбиотинил,биоцитинил,атомводорода,ацетил(СН₃СО-), алифатическую цепь, которая может содержать одну или несколько тиоловых, альдегидных или аминных функций, при этом алифатическая цепь представляет собой преимущественно алкильную цепь с 1-6 атомами углерода, или алкенильную цепь с 2-6 атомами углерода, или аминоалкилкарбонильную цепь с 2-6 атомами углерода; Z - последовательность пептидов одной из формул в которых Ξ₁ означает пептидную последовательность с 2-9 аминокислотами;Ξ₂ - пептидную последовательность с 0-5 аминокислотами, Θ - пептидную последовательность формулы (XI) -(АА₁)-(АА₂)-(АА₃)-(АА₄)-(АА₅)- (XI), в которой (AA₁) - остаток лизина либо аргинина; (АА₂) - остаток глицина, (АА₃) - остаток лизина либо аргинина, (АА₄) - остаток лейцина либо аланина, (АА₅) - остаток валина при условии, что (AA₁), (AA₂), (АА₃), (АА₄), (AA₅) никогда не образуют вместе пептидные последовательности -Lys Gly Lys Leu Ile- и -Lys Gly Lys Leu Val-; Ω зафиксированная на группе -СО серина, означает: гидроксил, пептидную последовательность формулы (ХII) -Val-Σ-Ψ, где Σ - последовательность формулы (ХIII) -(АА₆)-Тrр-Asn-(АА₇)-(AA₈), в которой (АА₆) - глутамин или аргинин, (АА₇) - глутамин или серин, (AA₈) - треонин и в которой Ψ, зафиксированная на остатке -СО - свободной аминокислоты AA₈, означает группу ОН, пептидную последовательность формулы (ХУ) -Val-Ψ, в которой Ψ имеет указанное выше значение; композициям для обнаружения инфекции, вызванной ВИЧ-1 группы 0, способам диагностики инфекций, вызванных ВИЧ-1 группы 0 и диагностическому набору. Описываемые пептиды при использовании их в композициях, способах диагностики инфекций и в диагностических наборах позволяют получить результаты превосходящие те, что получены при использовании известных пептидов. 7 с. и 7 з.п. ф-лы, 8 табл.

Изобретение относится к синтетическим пептидам, используемым в биологических тестах с целью обнаружения инфекций, вызванных вирусами ВИЧ-1 группы 0, способу их получения, композициям, наборам, содержащие такие пептиды и биологическим тестам с использованием этих пептидов.

Из уровня техники известны ретровирусы ВИЧ-1 группы 0. В европейском патенте 0345375 и в заявке на европейский патент 0657532 описаны изоляты ANT 70 и ANT 70 NA, выделенные у больных из Камеруна. Точнее, в этих материалах описаны антигены и антигенные композиции, содержащие лизаты или протеины упомянутых изолятов, нуклеиновые кислоты, соответствующие геномной РНК, методы гибридизации с использованием указанных нуклеиновых кислот, методы получения упомянутых выше изолятов, а также способы получения протеинов р12, р16, р25, gр41, gр120 указанных ретровирусов.

В заявке на европейский патент 0591914 описан изолят MVP 5180/91. Данный изолят, охарактеризованный с помощью метода Western Blot, имеет, как и предыдущий изолят, отличия от давно известных изолятов ретровируса ВИЧ-1. В заявке на европейский патент 0591914 описывается, в частности, ДНК-последовательность изолята MVP 5180/91 и точно приводится локализация генов gag, pol и env. Кроме того в заявке на европейский патент 0591914 приводится описание синтетических пептидов петлевой последовательности V3, а также иммунодоминантной области (др41). Последние могут применяться в биологических тестах, в частности in vitro для обнаружения антител к ВИЧ-1 группы 0.

В заявке на европейский патент 0673948 описываются синтетические или рекомбинтные пептиды, состоящие из 15-50 аминокислот (АА) и содержащие последовательность -VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR-, в которой Х означает остаток либо цистеина, либо серина. Эти пептиды применяются в диагностической сфере для выявления инфекций, вызываемых некоторыми изолятами ретровируса ВИЧ-1 группы 0.

Известна также заявка на европейский патент 0727483, в которой описывается изолят MVP 2901/94, как составная часть ретровируса семейства ВИЧ-1 группы 0. В этой заявке описываются некоторые антигены с четко определенными пептидными последовательностями. Эти пептидные последовательности соответствуют частично последовательности gp120 и частично последовательности gp41 (иммунодоминантная область) изолята MVP 2901/94.

В заявке WO 96/12809 описаны два новых изолята из семейства ВИЧ-1 группы 0. Имеются в виду изоляты VAU и DUR. В этой же заявке описываются и некоторые последовательности пептидов, выделенных из указанных вирусов, которые могут применяться для обнаружения антител, распознающих пептидные последовательности ВИЧ-1 VAU или DUR.

В заявке WO 96/32293 описаны два антигена из последовательности изолята ANT 70. Имеются в виду антигены MDL061 и MDL056 в иммунодоминантной области др41. Согласно этому изобретению для обнаружения 100% проб в ограниченной коллекции сывороток больных, инфицированных вирусом ВИЧ-1 группы 0, необходимо применять композиции, содержащие эти два пептида, поскольку каждый пептид в отдельности не обеспечивает получения удовлетворительных результатов.

Действительно, ввиду генетической вариабельности изолятов вируса группы 0 почти невозможно гарантировать серологическое выявление зараженных индувидуумов при использовании антигенов одного и того же изолята. Это означает невозможность получения реактивов, гарантирующих 100%-ную чувствительность. Таким образом впервые группа 0 обусловила появление серьезной проблемы: неадекватность некоторых серологических реактивов для распознавания индивидуумов, зараженных неодинаковыми группами или подтипами. Это относится, в частности, к ВИЧ-1 группы 0.

В заявке WO 96/40763 утверждается существование больших различий внутри группы 0. В ней описываются пептиды, включающие в естественной последовательности ВИЧ-1 типа В, несколько незначительных модификаций (одна или две аминокислотные замены). Согласно данной заявке такие гибридные пептиды способны взаимодействовать с антителами к группе 0.

В заявке WO 96/27013 описана серия новых вирусов ВИЧ-1 группы 0, обозначенных, как: BCF 01, BCF 02, BCF 03, BCF 06, BCF 07, BCF 08, BCF 09, BCF 11, BCF 12, BCF 13 и BCF 14, а также соответствующая серия пептидов доминантной области gр41, обозначенных, как ESS/BCF02, FAN/BCF01, LOB/BCF06, MAN/BCF07, NKO/BCF08, POC/BCF03, MAN/BCF11, BCF09, BCF12, BCF13 и BCF14.

Некоторое число этих пептидов мало пригодно в диагностике вследствие их слабой растворимости, в частности пептид BCF 13.

В настоящее время неожиданно было обнаружено, что некоторые синтетические пептиды являются высококачественными диагностическими реактивами, позволяющими достичь хороших результатов в выявлении больных, инфицированных ретровирусами ВИЧ-1 группы 0. Такие пептиды состоят из разных последовательностей, расположенных вокруг коротких, очень консервативных последовательностей, присутствующих в изолятах ретровирусов ВИЧ-1 группы 0. Пептиды согласно изобретению позволяют получать результаты, значительно превосходящие результаты, получаемые при использовании синтетических пептидов, несущих иммунодоминантные эпитопы др41 (env) некоторых изолятов ВИЧ-1 группы 0.

Для обозначения аминокислот ниже применяется трехбуквенная номенклатура.

Синтетические пептиды согласно изобретению соответствуют общей формуле (I): Δ-Z-Trp Gly Cys-Θ-Cys Tyr Thr Ser-Ω, (1) вкоторойΔозначаетбиотинил,биоцитинил,атомводорода,ацетил(СН₃СО-), алифатическую цепь, способную содержать одну или несколько тиоловых, альдегидных или аминных функций, при этом алифатическая цепь представляет собой преимущественно алкильную цепь с 1-6 атомами углерода или алкенильную цепь с 2-6 атомами углерода или аминоалкилкарбонильную цепь с 2-6 атомами углерода, Z означает последовательность пептидов одной из формул -Ξ₁-Ser-Ξ₂-; (II) -Ξ₁-Gln-Ξ₂-; (V)
-Ξ₁-Asn-Ξ₂-; (VIII)
в которых Ξ₁ означает пептидную последовательность с 2-9 аминокислотами, Ξ₂ - пептидную последовательность с 0-5 аминокислотами, Θ - пептидную последовательность формулы (XI)
-(AA₁)-(AA₂)-(AA₃)-(AA₄)-(AA₅)-, (XI)
в которой (AA₁) - остаток либо лизина, либо аргинина; (АА₂) - остаток глицина; (АА₃) - остаток либо лизина, либо аргинина; (АА₄) - остаток либо лейцина, либо аланина; (АА₅) - остаток валина при условии, что (AA₁), (АА₂), (АА₃), (АА₄), (АА₅) никогда не образуют вместе пептидные последовательности -Lys Gly Lys Leu Ile- и -Lys Gly Lys Leu Val-
Ω, зафиксированная на группе -СО серина, означает гидроксил (-ОН), пептидную последовательность формулы (XII)
-Val-Σ-Ψ, (XII)
в которой Σ означает последовательность формулы (XIII)
(AA₆)-Trp Asn-(AA₇-(AA₈) (XIII),
в которой (АА₆) - глутамин или аргинин, (АА₇) - глутамин или серин, (АА₈) - треонин, и в которой Ψ, зафиксированная на остатке -СО- свободной аминокислоты АА₈, означает группу ОН,
пептидную последовательность формулы (XV)
-Val-Ψ, (XV)
в которой Ψ имеет указанное выше значение.

Пептиды формулы (I) относятся к мономерному типу и их размер может составлять от 13 до 33 аминокислот.

Пептиды согласно изобретению могут существовать либо в линейной форме, либо в циклической, образованной с помощью интерцистеиновых дисульфидных мостиков.

Предпочтительными являются пептиды формулы (I), в которой Δ означает биотинил, атом водорода или алифатическую цепь, которая может содержать одну или две тиоловых, альдегидных или аминных функций, причем алифатическая цепь является предпочтительно алкильной цепью с 1-6 атомами углерода или аминоалкилкарбонильной цепью с 2-6 атомами углерода; Z - пептидную последовательность формулы (II) или (V), в которой Ξ₁ означает пептидную последовательность из двух аминокислот, Ξ₂ - аминокислоту или пептидную последовательность формулы (VIII), в которой Ξ₁ означает пептидную последовательность из девяти, восьми или трех аминокислот, а Ξ₂ - пептидную последовательность из пяти аминокислот; Θ означает пептидную последовательность формулы -Lys Gly Arg Leu Val-; -Arg Gly Lys Ala Val-; -Arg Gly Arg Leu Val-; или -Arg Gly Arg Ala Val-; Ω - гидроксильную группу, пептидную последовательность (XV) или одну из следующих последовательностей, соответствующих пептидной последовательности формулы (XII) -Val Arg Trp Asn Glu Thr-Ψ; -Val Gln Trp Asn Glu Thr-Ψ или -Val Gln Trp Asn Ser Thr-Ψ.
Предпочтительно Z означает пептидную последовательность формулы -Leu Leu Ser Ser-; -Leu Leu Asn Ser-; -Leu Leu Gln Ser-; -Arg Leu Asn Ser-; -Ala Leu Glu Thr Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser- или -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu-; -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile-; -Leu Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser-; -Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-.

В состав изобретения входят также синтетические пептиды, содержащие 20-50 аминокислот и соответствующие формуле (Iа):
Δ-Z_a-Trp Gly Cys-Θ-Cys Tyr Thr Ser-Ω_a, (Ia)
в которой Z_a - радикал формул
Ξ_1a-Ser-Ξ_2a; (IIa)
Ξ_1a-Gln-Ξ_2a; (Va)
Ξ_1a-Asn-Ξ_2a, (VIIIa)
в которых Ξ_1a означает пептидную последовательность с 2-5 аминокислотами;Ξ_2a - аминокислоту; Ω_a - пептидную последовательность формулы (XII), такую, как приведена для формулы (I); Δ, Θ, Σ, Ψ имеют те же значения, что и в формуле (I).

Предпочтительными являются пептиды формулы (I) или (Iа), содержащие одну из следующих последовательностей. Последовательности приведены в соответствии с одно- или трехбуквенными номенклатурами.

Синтетические пептиды формулы (I), которые являются предметом настоящего изобретения, могут быть получены твердофазным синтезом с помощью традиционных методов: R.B.Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. (1963), 85, стр. 2149-2154; R. C. Sheppard, "Peptides 1971", Nesvadba H. (ed.) North Holland, Amsterdam, стр. 111; E. Atherton and R.L.Sheppard, "Solid phase peptide synthesis, a practical approach", IRL PRESS, 1989, Oxford University Press, стр. 25-34. В качестве автоматического синтезатора может использоваться синтезатор "9050 Plus Pep Synthesizer" Миллипора (Millipore) или аналогичный ему.

Твердая основа, применяемая при синтезах, должна быть совместимой с используемой техникой и химией. Так, например, для синтеза на синтезаторе "9050 Plus pep. Synthesizer" рекомендуется применять смолу, предназначенную для так называемой технологии "непрерывного потока"; таким критериям отвечают смолы PEG PS. Указанные основы состоят из спейсера на основе полиэтиленгликоля (PEG), расположенного между функциональной группой из полистероловых шариков и точкой закрепления первой аминокислоты. Тип такой точки фиксации может варьироваться в зависимости от выбранной С-терминальной функции. В данном случае применяются различные смолы PEG-PS.

Исходная смола и применяемые в качестве сырья аминокислоты имеются в продаже (PerSeptive-Biosystem или Neosystem).

При синтезе пептидов применяли следующие защитные группы боковых цепей (см. табл. А).

Временная защита первичной аминной функции в положении α применяемых аминокислот обеспечивается группой 9-фторэнилметилоксикарбонил (Fmoc). Удаление защитных групп осуществляется посредством 20%-го раствора пиперидина в диметилформамиде.

Для связи предпочтительно применяется избыточное количество диизопропилкарбодиимида (DIPCDI) и гидрокси-1-бензотриазола (HOBt).

По окончании синтеза смолу промывают органическими растворителями (диметилформамидом, затем дихлорметаном), сушат в вакууме, затем обрабатывают раствором на основе трифторуксусной кислоты (TFA), охлажденным до 0^oС и содержащим соответствующие "очистители" (scavengers). Можно применять, например, реактив К с содержанием 82% трифторуксусной кислоты, 5% фенола, 5% воды, 5% тиоанизола и 3% этандитиола.

После фильтрования смолы пептиды выпадают в осадок и промываются простым эфиром.

После этого искусственные пептиды очищают с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой и определяют их чистоту масс-спектрометрией.

В качестве твердой фазы можно использовать, например, фазу Бондапака (Bondapak) C-18. Пептиды элюируют с применением линейного градиента между двумя буферными растворами, из которых первый раствор преимущественно водный (например, "вода - 0,1%-ая трифторуксусная кислота"), а второй раствор скорее органический (например, смесь, содержащая 60% ацетонитрила, 39,92% воды и 0,08% трифторуксусной кислоты). Полученные чистые фракции объединяют, концентрируют в условиях вакуума и лиофилизуют.

При циклизации искусственные очищенные пептиды растворяют в растворе ацетата аммония (10 мМ). Показатель рН доводят до 8,5 добавкой гидроксида аммония 1 М. Раствор интенсивно перемешивают. Полная циклизация наступает через 18 часов. После этого показатель рН снижают до 6 добавлением уксусной кислоты. Циклизованные пептиды лиофилизуют, затем очищают с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой, как описано выше.

Иммунореактивность пептидов согласно изобретению оценивали с помощью сывороток больных, которые в большинстве своем происходили из Камеруна и были инфицированы ретровирусом ВИЧ-1 группы 0. Проведенные тесты подтвердили, что пептиды согласно изобретению, взятые отдельно или в комбинации (пептидные композиции), позволяют выявить 100% сывороток, инфицированных ретровирусом ВИЧ-1 группы 0.

Синтетические пептиды согласно изобретению могут, следовательно, найти применение при проведении иммунологических тестов для обнаружения инфекций, вызванных ретровирусом ВИЧ-1 группы 0. Возможно также применять комбинации из нескольких синтетических пептидов формулы I. Такие комбинации, в которых могут содержаться два и более пептида формулы I, также входят в состав изобретения. Предпочтительными комбинациями являются те, в которых содержатся пептиды 1 (2В) и 3 (4В).

Также возможно использовать синтетические пептиды формулы (I) согласно настоящему изобретению в сочетании с рекомбинантными пептидами (рекомбинантные протеины) ВИЧ-1 группы 0, такими, которые могут быть получены традиционными методами и которые содержат последовательности, описанные, например, в заявке на европейский патент 0591914. Такие композиции также являются составной частью настоящего изобретения.

Синтетические пептиды согласно изобретению могут применяться, кроме того, в сочетании с другими синтетическими или рекомбинантными пептидами ВИЧ-1 (рекомбинантные протеины) и/или ВИЧ-2, такими, как пептиды, описанные в патентных заявках или в европейских патентах 0387914, 0239425, 0220273, 0267802. Этот перечень патентных заявок и патентов не является исчерпывающим и приводится в качестве примера.

Композиции, содержащие один или несколько синтетических пептидов формулы (I), а также один или несколько синтетических или рекомбинантных пептидов ВИЧ-1 или ВИЧ-2 находят свое применение в диагностике при обнаружении больных, инфицированных ретровирусом ВИЧ. Такие композиции также входят в состав настоящего изобретения.

Способы иммунного дозирования с применением одного или нескольких синтетических пептидов формулы (I), используемых отдельно или в сочетании с рекомбинантными пептидами ВИЧ-1 группы 0, или синтетическими или рекомбинантными пептидами ВИЧ-1 или ВИЧ-2 также относятся к изобретению.

Целью изобретения являются кроме того наборы, предназначенные для использования при иммунодозировании и содержащие пептид формулы (I) или композицию, содержащую по меньшей мере один пептид формулы (I).

Приводимые ниже примеры иллюстрируют изобретение и не являются ограничительными.

ПРИМЕР 1:
Получение соединения согласно изобретению; пептид 2 (3В)
LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET или

Данный пептид был синтезирован в твердой фазе. Технология, разработанная в 1963 году Меррифельдом (Merrifield) (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, стр. 2149-2154), состоит в фиксации первой аминокислоты на полимерной (выполненной из смолы) твердой основе посредством ее кислотной функции и в удлинении пептидной последовательности, начиная с указанной первой аминокислоты, при этом в процессе синтеза пептид сохраняется зафиксированным на смоле.

При синтезе пептида 2 использовали синтезатор "9050 Plus Pep ithesizer" и смолу Fmoc Thr (OtBu) PEG PS.

В таблице I указаны различные этапы синтеза.

По окончании синтеза смолу промывали диметилформамидом, затем хлорметаном и сушили в вакууме.

После этого смолу обрабатывали реактивом к (82% трифторуксусной кислоты, 5% фенола, 5% воды, 5% тиоанизола, 3% этандитиола). Пептид 2 (3В), выделенный осаждением окисью диэтила, промывали тем же растворителем. Таким образом было получено 140 мг пептида 2 (3В).

После этого пептид 2 (3В) очистили с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой. В качестве твердой фазы применяли фазу Бондапака (Bondapak) C-18. Пептид элюировали, применяя линейный градиент между двумя буферными растворами, из которых первый раствор был в основном водным (например, вода-трифторуксусная кислота 0,1%), второй скорее органическим (например, смесь, содержащая 60% ацетонитрила, 39,92% воды и 0,08% трифторуксусной кислоты). Собранные чистые фракции объединяли, концентрировали в вакууме и лиофилизовали.

При циклизации полученный очищенный искусственный пептид растворили в растворе ацетата аммония (10 мМ). Показатель рН довели до 8,5 добавлением гидроксида аммония 1 М. Раствор интенсивно перемешали. Полная циклизация завершилась через 18 часов. Показатель рН снизили после этого до 6 добавлением уксусной кислоты. Циклизованный пептид лиофилизовали, затем очищали с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой, как описано выше.

Получение соединения согласно изобретению "пептид 15 (22В)"
Этот пептид синтезировали подобно пептиду 2 (3В), но в качестве смолы использовали смолу FmocPAL PEG-PS.

В приводимой ниже таблице II указаны различные этапы синтеза.

По окончании синтеза смолу промывали диметилформамидом, затем дихлорметаном и сушили в вакууме.

После этого смолу обрабатывали реактивом К (82% трифторуксусной кислоты, 5% фенола, 5% воды, 5% тиоанизола, 3% этандитиола). Пептид 7 (22В), выделенный осаждением окисью диэтила, промывали тем же растворителем. Таким образом было получено 140 мг пептида 15 (22В).

После этого пептид 15 (22В) очистили жидкостной хроматографией с обратной фазой, циклизовали, лиофилизовали и очищали, как описано выше, для пептида 2 (3В).

Аналогичным образом синтезировали другие соединения согласно изобретению с использованием смол и соответствующих аминокислот.

В таблице III указан молекулярный вес некоторых пептидов формулы (I) в нециклизованном виде, который определяли масс-спектрометрией.

ПРИМЕР 2:
Определение иммунореактивности пептидов согласно изобретению с помощью иммунно-ферментативного теста. Тест 1
Применявшиеся сыворотки ESS, DUR, VAU и HAD были получены от больных французской национальности, инфицированных ретровирусами ВИЧ-1 группы 0. Другие сывороточные пробы, взятые у больных, инфицированных ретровирусами ВИЧ-1 группы 0, были получены Институтом Пастера из Яунде, Камерун, и серотипизированы как группа 0 в соответствии с серологическим алгоритмом, описанным в AIDS, 1977 г., 77, стр. 445-453.

ВИЧ-отрицательные сыворотки (ВИЧ) (n=48) были получены от здоровых доноров.

Применявшиеся синтетические пептиды растворяли в воде в концентрации 1 мг/мл (маточный раствор). На этапе сенсибилизации твердой фазы (coating) 110 мкл раствора с содержанием 2 мкг/мл каждого пептида (получен разбавлением маточного раствора карбонатным буферным раствором 0,1 М) добавляли в каждую лунку плашек для микротитрования Microtiter^TM (NUNC). После инкубации в течение ночи при комнатной температуре микроплашки сначала промывали буферным раствором Tris NaCl, рН 7,4, с содержанием 0,1% Tween® 20 и 0,001% мертиолата натрия, затем насыщали раствором PBS с содержанием 0,5% Regilait^TM (порошок обезжиренного молока). После отсоса раствора насыщения плашки нагревали при 50^oС в течение 10 минут.

Сывороточные пробы разводили в пропорции 1/5 раствором обезжиренного молока (цитратный буфер с добавкой 0,01% фенолового красного, 0,25% хлороформа и 0,25% Kathon®), помещали в лунки плашек и инкубировали в течение 30 минут при 40^oС.

После промывки буферным раствором Tris NaCl, pH 7,4, содержавшим 0,1% Tween® 20 и 0,001% мертиолата натрия 100 мкл раствора коньюгата антител козы anti IgG и IgM человека, меченных пероксидазой хрена, с содержанием в качестве консерванта 0,01% мертиолата натрия в виде раствора в буферном цитратном растворе с добавкой 30% глицерола и 25% нормальной сыворотки эмбриона теленка добавляли в каждую лунку плашки, после чего последние инкубировали в течение 30 минут при 40^oC.

После промывки буфером Tris NaCl, pH 7,4, с содержанием 0,1% Tween® 20 и 0,001% мертиолата натрия окраску получали добавкой в каждую лунку 100 мкл 0-фенилендиамина в виде раствора в перекиси водорода. Затем микроплашки инкубировали в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. После этого прерывали реакцию окрашивания добавкой 100 мкл серной кислоты 4N. Удельное поглощение (А) определялось при 490 и 620 нм.

Относительное удельное поглощение (А490-А620), считываемое в каждой лунке, пропорционально иммунореактивности каждого пептида. Это указывает на способность каждого пептида вступать в реакцию с биологической пробой, используемой в тесте. Пороговая величина (cut-off) удельного поглощения была определена равной 0,15. Она соответствует средней величине отрицательных значений (n=48) плюс 12 типовых отклонений. Реакционную способность пептидов согласно изобретению (пептид 3 (4В), пептид 2 (3В) и пептид 1 (2В), все в циклизованном виде) сравнивали с реакционной способностью двух синтетических пептидов, последовательность которых является частью натуральной последовательности оболочки изолята VAU (ретровирус ВИЧ-1 группы 0) и которые содержат иммунодоминантный эпитоп gр41.

Эти оба пептида имеют последовательность, А (см. в конце описания).

При исследовании пептиды применялись в циклизованном виде. Результаты этого исследования приведены в таблице IV.

Результаты таблицы IV свидетельствуют о том, что пептид 3 (4В) обладает более эффективными свойствами по сравнению с другими пептидами. Этот пептид позволяет более эффективно обнаруживать сыворотки больных, инфицированных ретровирусом ВИЧ-1 группы 0, по сравнению с двумя пептидами, содержащими частично последовательность изолята VAU, соответствующего иммунодоминантному эпитопу gр41. В частности пептиды 2 (3В) и 1 (2В) согласно изобретению обладают более выраженной иммунной реактивностью, чем пептид VAU 22 АА, содержащий такое же число аминокислот.

ПРИМЕР 3:
Оценка иммунореактивности пептидов согласно изобретению с помощью иммунно-ферментативного теста. Тест 2
Сывороточные пробы больных, инфицированных ретровирусом ВИЧ-1 группы 0, были получены Институтом Пастера из Яунде, Камерун, серотипизированы как группа 0 по серологическому алгоритму, описанному в AIDS, 1977 г., 11, стр. 445-453. Одна генотипическая проба (Maryland) поступила из США. Указанные пробы предварительно разбавили в отрицательной человеческой сыворотке до разведении, приведенных в таблице V, с тем, чтобы располагать достаточным объемом при проведении различных тестов на иммунореактивность.

Используемые синтетические пептиды растворили в воде в концентрации 1 мг/мл (маточный раствор). На этапе сенсибилизации твердой фазы (coating) поступали, как описано в примере 2.

Сывороточные пробы разбавили в пропорции 1/5 раствором обезжиренного молока (в нитратном буфере с добавкой фенолового красного 0,01%, хлороформа 0,25% и Kathon® 0,25%), поместили в лунки плашек и инкубировали в течение 30 минут при 40^oС.

После промывки буфером Tris NaCl, pH 7,4, с содержанием 0,1% Tween® и 0,001% мертиолата натрия 100 мкл раствора конъюгата антител козы антиIgG и человеческих IgM, меченых пероксидазой хрена, содержащего в качестве консерванта мертиолат натрия (0,01%) в виде раствора в цитратном буферном растворе с добавкой глицерина (30%) и нормальной эмбриональной телячьей сыворотки (25%), добавили в каждую лунку, после чего плашки инкубировали в течение 30 минут при 40^oC.

После промывки буфером Tris NaCl, pH 7,4, с содержанием 0,1% Tween® 20 и 0,001%, мертиолата натрия окраску проявляли, как описано в примере 2.

Удельное относительное поглощение (DO)(А490-А620), считанное в каждой лунке, пропорционально иммунореактивности каждого пептида. Это указывает на способность каждого пептида вступать в реакцию с биологической пробой, используемой в тесте.

Реакционную способность пептидов согласно изобретению (пептиды 10 (14В), 11 (18В), 12 (19В), 14 (21В), 15 (22В), 16 (23В), все в циклизованном виде, сравнивали с реакционной способностью трех гомологичных синтетических пептидов, последовательность которых является частью натуральной последовательности оболочки ретровируса ВИЧ-1 группы 0. Этими пептидами явились два пептида, производных изолята VAU: пептид VAU 22 АА и пептид MVP 5180 (в таблице V обозначен, как "MVP 5180"). Пептиды VAU 22 АА и VAU 35 АА (их структура приведена в примере 2), а также пептид MVP 5180 содержат иммунодоминантный эпитоп gр41.

Все эти пептиды применялись в циклизованном виде. Последовательность пептида MVP 5180 имеет следующий вид (см. в конце описания).

Результаты данного исследования приведены в таблице V.

Для каждого тестируемого пептида пробы были разбиты на четыре класса (а, b, с, d), которые соответствуют разным уровням относительного удельного хюглощения, считываемого при длине волны А492-А620:
для a: DO<0,100,

Результаты приведены в таблице VI.

Результаты свидетельствуют о том, что все тестированные пептиды согласно изобретению обладают более высокой иммунной реакционной способностью, чем эталонные пептиды из уровня техники, происходящие из естественных иэолятов (MVP 5180, VAU). Пептиды 15 (22В), 14 (21В) и 16 (23В) согласно изобретению оказались наиболее иммуннореактивными.

ПРИМЕР 4:
Оценка иммунореактивности композиций, содержащих пептиды согласно изобретению, посредством иммунно-ферментативного теста
При этом исследовании поступали в соответствии с протоколом, описанным в примере 2, причем применялись одни и те же сыворотки. Применявшиеся микроплашки сенсибилизировали либо циклизованным пептидом 1 (2В), либо циклизованным пептидом 3 (4В), либо композицией, содержащей оба этих пептида (1:1 в отношении частей). В каждую из лунок помещали либо 100 мкл раствора с содержанием 2 мкг/мл пептида 1 (2В), либо 100 мкл раствора с содержанием 2 мкг/мл пептида 3 (4В), либо 100 мкл раствора с содержанием 1 мкг/мл пептида 1 (2В) и 1 мкг/мл пептида 3 (4В).

Результаты исследования приведены в таблице VII.

Приведенные в таблице VII результаты показывают, что композиции из пептидов согласно изобретению в случае их применения в диагностике позволяют обнаружить все сыворотки больных, инфицированных ретровирусами ВИЧ-1 группы 0.

Формула изобретения

1. Синтетические пептиды мономерного типа с 13-33 аминокислотами или димерного типа с 26-66 аминокислотами линейной или циклизованной интерцистеиновыми дисульфидными мостиками формы, соответствующей общей формуле (I)
Δ-Z-Trp Gly Cys-Θ-Cys Try Thr Ser-Ω, (I)
в которой Δ означает биотинил, биоцитинил, атом водорода, ацетил (СН₃СO-), алифатическую цепь, которая может содержать одну или несколько тиоловых, альдегидных или аминных функций, при этом алифатическая цепь представляет собой преимущественно алкильную цепь с 1-6 атомами углерода, или алкенильную цепь с 2-6 атомами углерода, или аминоалкилкарбонильную цепь с 2-6 атомами углерода;
Z - последовательность пептидов одной из формул:
-Ξ₁-Ser-Ξ₂-; (II)
-Ξ₁-Gln-Ξ₂-; (V)
-Ξ₁-Asn-Ξ₂-; (VIII)
в которых Ξ₁ означает пептидную последовательность с 2-9 аминокислотами, Ξ₂ - пептидную последовательность с 0-5 аминокислотами, Θ - пептидную последовательность формулы (ХI)
-(АА₁)-(АА₂)-(АА₃)-(АА₄)-(АА₅)-, (ХI)
в которой (АА₁) - остаток либо лизина, либо аргинина, (АА₂) - остаток глицина, (АА₃) - остаток либо лизина, либо аргинина, (АА₄) - остаток либо лейцина, либо аланина, (АА₅) - остаток валина при условии, что (АА₁), (АА₂), (АА₃), (АА₄), (АА₅) никогда не образуют вместе пептидные последовательности -Lys Gly Lys Leu Ile- и -Lys Gly Lys Leu Val-
Ω, зафиксированная на группе -СО серина, означает гидроксил (-ОН), пептидную последовательность формулы (ХII)
-Val-Σ-Ψ, (XII)
в которой Σ - последовательность формулы (ХIII)
-(АА₆)-Trp-Asn-(АА₇)-(АА₈), (ХIII)
в которой (АА₆) - глутамин или аргинин, (АА₇) - глутамин или серин, (АА₈) - треонин и в которой Ψ, зафиксированная на остатке -СО- свободной аминокислоты АА₈, означает группу ОН,
пептидную последовательность формулы (ХV)
-Val-Ψ, (XV)
в которой Ψ имеет указанное выше значение.

2. Синтетические пептиды формулы (I) по п. 1, в которой (АА₄) в значении Θ означает остаток лейцина.

3. Синтетические пептиды формулы (I) по п. 1, в которой Δ означает биотинил, атом водорода или алифатическую цепь, которая может содержать одну или две тиоловых, альдегидных или аминных функций, причем алифатическая цепь является предпочтительно алкильной цепью с 1-6 атомами углерода или аминоалкилкарбонильной цепью с 2-6 атомами углерода; Z - пептидную последовательность формулы (II) или (V), в которой Ξ₁ - пептидная последовательность из двух аминокислот, Ξ₂ - аминокислота или пептидная последовательность формулы (VIII), в которой Ξ₁ означает пептидную последовательность из девяти, восьми или трех аминокислот, а Ξ₂ означает пептидную последовательность из пяти аминокислот; Θ - пептидная последовательность формул -Lys Gly Arg Leu Val-, -Arg Gly Lys Ala Val-, -Arg Gly Arg Leu Val- или -Arg Gly Arg Ala Val- и Ω означает гидроксильную группу, пептидную последовательность (ХV) или одну из следующих последовательностей, соответствующих пептидной последовательности формулы (ХII):
4. Синтетические пептиды формулы (I) по одному из пп. 1-3, в которой Z означает пептидную последовательность формул -Leu Leu Ser Ser-; -Leu Leu Asn Ser-; -Leu Leu Gln Ser-; -Arg Leu Asn Ser-; -Ala Leu Glu Thr Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser-; -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu-; -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile-; -Leu Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser- или -Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-.

5. Синтетические пептиды по п. 1, содержащие 20-50 аминокислот формулы (Iа)
Δ-Z_a-Trp Gly Cys-Θ-Cys Tyr Thr Ser-Ω_a (Ia)
в которой Z_а - радикал формул
Ξ_1a-Ser-Ξ_2a; (IIa)
Ξ_1a-Gln-Ξ_2a; (Va)
Ξ_1a-Asn-Ξ_2a, (VIIIa)
в которых Ξ_1a - пептидная последовательность из 2-5 аминокислот, Ξ_2a - аминокислота, Ω_a - пептидная последовательность формулы (ХII), такая, как приведена для формулы (I),
Δ, Θ, Σ, Ψ имеют те же значения, что и в формуле (I).

6. Синтетические пептиды формулы (I) по одному из пп. 1-5, содержащие одну из следующих последовательностей (см. графическую часть).

7. Синтетические пептиды по одному из пп. 1-6, имеющие следующую последовательность (см. графическую часть).

8. Композиция для обнаружения инфекции, вызванной ВИЧ-1 группы 0, содержащая один или несколько синтетических пептидов формулы (I) по одному из пп. 1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Композиция по п. 8, содержащая пептид 3 (4В) и пептид 1 (2В).

10. Композиция, содержащая один или несколько синтетических пептидов формулы (I) по п. 1, а также содержащая один или несколько рекомбинантных пептидов ВИЧ-1 группы 0.

11. Композиция, содержащая один или несколько синтетических пептидов формулы (I) по п. 1, а также содержащая один или несколько синтетических или рекомбинантных пептидов ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2.

12. Способ диагностики инфекций, вызванных ВИЧ-1 группы 0, отличающийся тем, что используют один или несколько синтетических пептидов формулы (I) по одному из пп. 1-7.

13. Способ диагностики инфекций, вызванных ВИЧ-1 группы 0, отличающийся тем, что используют композицию по одному из пп. 8-11.

14. Диагностический набор, содержащий по меньшей мере один синтетический пептид формулы (I) по одному из пп. 1-7 или композицию по одному из пп. 8-11 и подходящий твердый носитель.

Приоритет по признакам:
09.04.1997 - пептиды 2В: 3В: 4В, 5В, 6В, N6 и N7;
24.02.1998 - пептиды 12В, 14В, 18В, 19В, 20В, 21В, 22В, 23В.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39