Способ получения клавулановой кислоты и/или ее солей

 

Способ проводят в непрерывном или полунепрерывном режиме с использованием штамма Streptomyces clavuligerus ATCC 27064. Процесс ферментации осуществляют при строгом контроле уровня растворимого фосфата в среде как в начале процесса, так и в ходе его. В качестве источника углерода могут быть использованы липиды, предпочтительно триглицериды. Получают существенно повышенный выход клавулановой кислоты и/или ее солей. 7 з.п. ф-лы, 5 табл.

В настоящем изобретении описан способ получения клавулановой кислоты и/или ее солей путем ферментации с помощью выбранных штаммов Streptomyces clavuligerus при строгом контроле концентрации присутствующего во время ферментации растворимого фосфата и при необязательном использовании источников углерода, таких как липиды, предпочтительно, триглицериды.

Уровень техники Клавулановая кислота представляет собой молекулу формулы полезность которой основана на ее способности ингибировать ферменты, называемые бета-лактамазами, которые имеют некоторые Грам-отрицательные и Грам-положительные патогенные микробы, такие как Escherichia coli, Klebsiella aerogenes и подобные, и которые, благодаря своему действию, придают им устойчивость к некоторым бета-лактамным антибиотикам. В результате, смешивание клавулановой кислоты с упомянутыми антибиотиками приводит к расширению антибактериального спектра последних.

Известно, что получение клавулановой кислоты осуществляют несколькими штаммами, принадлежащими роду Streptomyces, например, такие как Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 и подобные.

Как было раскрыто в более ранних патентах (Европейский Патент 0 182 522 В1), получение клавулановой кислоты может быть повышено при проведении периодической ферментации, когда ассимилируемый источник углерода, такой, например, как глицерин или мальтоза, добавляют также во время ферментации, а не только изначально. Однако, при использовании такого способа увеличения в получении достаточно низкое. В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является разработка способа получения клавулановой кислоты и/или ее солей и достижение уровня производительности, превосходящего известные показатели для существующих способов ее получения.

Многие авторы продемонстрировали ингибирующее воздействие фосфата на получение антибиотиков (Martin, J.F., 1977, Adv. Biochem.Eng. 6:105-127). Конкретно, было обнаружено ингибирование фосфата на синтез цефалоспоринов штаммом Streptomyces clavuligerus (Lubbe, С. et al. 1985, Arch. Microbiol. 140: 317-320 and Lubbe, C. et al. 1984, FEMS Microbiol. Lett. 25:75-79; Aha-ronowithz, Y. et al. 1977, Arch. Microbiol. 115:169-173; Jhang, J. et al. 1989, FEMS, 57: 145-150), а также ингибирующее воздействие фосфата на синтез клавулановой кислоты упомянутым микроорганизмом (Lebrihi, А. et al., 1987, Appl. Microbiol. Biotechnol. 26:130-135; Romero, J. et al. 1984, Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:318-325).

В отличие от результатов, полученных в вышеупомянутых работах, было обнаружено, к удивлению, что вместо отрицательного воздействия фосфата на получение клавулановой кислоты, наблюдается значительное повышение в получении клавулановой кислоты и/или ее солей, когда уровень растворимого фосфата в культуральной среде достигает оптимальных значений и поддерживается в этом диапазоне. Более того, было обнаружено, что строгий контроль концентрации растворимого фосфата в культуральной среде в большей степени влияет на повышение уровня получения системы, чем действительное добавление питательных веществ. Для получения клавулановой кислоты, так же, как и других антибиотиков или молекул, типичных для вторичного метаболизма, была использована периодическая или полунепрерывная (порционная подача) культура Streptomyces clavuligerus. В контексте настоящего изобретения термин "периодическая культура" относится к процессу ферментации, в котором питательные вещества вводят в культуральную среду только в начале процесса, и питательную среду экстрагируют из ферментационного чана только по окончании процесса. Термин "полунепрерывная (порционная подача) культура" подразумевает ферментацию, в которой питательные вещества вводят в культуральную среду не только в начале процесса, но также на протяжении всей ферментации, и питательную среду экстрагируют из ферментационного чана только в конце процесса. Способ получения клавулановой кислоты в периодическом режиме или режиме порционной подачи характеризуется некоторыми специфическими признаками ферментации, в связи с чем получают изначально значительное повышение вязкости, что сопряжено с трудностью поддержания приемлемого уровня растворенного кислорода для пролонгирования фазы получения до более длительных периодов времени. Следовательно, в таком случае не избежать фрагментации мицелия, снижения вязкости и снижения уровня продуцирования в конце всего процесса.

Непрерывную культуру используют предпочтительно для получения биомассы, аминокислот и других первичных метаболитов (Hospodka, J. 1966, Theoretical and Methodo-logical Basis of Continuous Culture of Microorganisms, pp. 493-645; Malek, J. and Fencl, Z. eds. Academic Press New York).

Однако, использование непрерывной культуры для получения вторичных метаболитов (антибиотиков) фактически не было описано, или было раскрыто с ограниченной эффективностью (Vu-Trong, К. and Grey, 1982 Biotechnol. Bioengineering 24: 1093-1103; Trangott C.S. et al. 1993 Apol. Microbiol. Biotechnol. 39:433-437; Noack. D. 1988, J. Bas. Microbiol. 28:101-106).

В контексте настоящего описания термин "непрерывная культура" означает ферментацию, в которой питательные вещества вводят в культуральную среду как в начале процесса, так и в течение ферментации, при этом некоторое количество питательной среды экстрагируют из ферментационного чана в ходе ферментации, а не только по его окончании. Было обнаружено, что при добавлении растворимого фосфата к культуральной среде и/или при контролировании и фиксации его концентрации в течение ферментации возможно достичь высоких выходов клавулановой кислоты и/или ее солей в непрерывной культуре. В непрерывном способе, разбавляя соответствующим образом культуру, достигают постепенного снижения вязкости в течение процесса, позволяя тем самым поддерживать концентрацию растворенного кислорода (>40%) в течение более длительного периода времени, без усиления перемешивания, избегая фрагментации мицелия и пролонгирования (увеличения) периода получения клавулановой кислоты. В результате добавления питательных веществ и воды достигается, в целях поддержания соответствующего рабочего объема, полное заполнение имеющейся емкости, которая требует постоянной экстракции питательной среды в ходе процесса ферментации либо в прерывистом режиме, либо постоянно. Таким способом и путем контролирования процесса добавлением в культуральную среду в процессе растворимого фосфата, достигают удлинения ферментационного цикла и увеличения общей производительности процесса, что, в свою очередь, приводит к увеличению выхода производительности на геометрическую имеющуюся емкость.

Описание изобретения Настоящее изобретение, в соответствии с вышесказанным, обеспечивает способ получения клавулановой кислоты и/или ее солей посредством культивирования отобранных штаммов Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 и/или их мутантов в условиях глубинной ферментации при проведении аэрации и перемешивания и при осуществлении процесса в периодическом, полунепрерывном или непрерывном режиме, в котором концентрация растворимого фосфата, присутствующего в культуральной среде, в начале ферментации и в процессе ферментации фиксирована и/или поддерживается в установленном диапазоне значений, в зависимости от каждого типа используемой культуры, причем эти значения составляют, в случае периодической культуры, от 500 до 4000 мг/л в начале ферментации или, в случае полунепрерывной (порционная подача) или непрерывной культуры, от 150 до 600 мг/л в начале ферментации и от 20 до 150 мг/л в ее ходе.

Процесс получения клавулановой кислоты и/или ее солей, в соответствии с настоящим изобретением, осуществляют в присутствии ассимилируемых источников С и N и не обязательно неорганических солей. Ферментацию проводят в аэробных условиях и в глубинной культуре.

Оптимальная температура ферментации составляет предпочтительно от 20^oС до 40^oС и особенно от 22^oС до 30^oС.

Источники С могут быть добавлены в виде простых или сложных питательных веществ, соответственно: только в начале (в случае периодической культуры), или в течение ферментации путем средств прерывистого или непрерывного добавлений в случае полунепрерывной (порционной подачи) или непрерывной культуры. В зависимости от используемого штамма, такие источники С включают углеводы (декстрины, крахмалы, мальтозу и др.), полиолы, такие как глицерин, например, липиды (главным образом триглицериды или натуральные или синтетические) и, в целом, любой другой источник С, который способствует росту микроорганизмов. В частности, было обнаружено, что липиды и особенно натуральные или синтетические триглицериды, можно рассматривать как один из предпочтительных источников для осуществления способа настоящего изобретения, при этом в известном уровне техники такие указания отсутствуют. Фактически, было найдено, что, используя такие источники углерода, можно даже только при условии их однократного исходного добавления в культуральную среду (периодическую культуру) заметно повысить получение клавулановой кислоты и/или ее солей, при этом нужно просто следить за тем, чтобы концентрация растворимого фосфата оставалась в пределах, определенных в настоящем изобретении.

Культуральная среда должна также содержать (нести) источники ассимилируемого органического или неорганического N, такие как, например, соевая мука, кукурузный экстракт, растворимые дистилляты, дрожжевые экстракты, хлопковая мука, пептон, казеин или сульфат аммония.

В культуральную среду могут быть включены также различные неорганические соли, такие как хлориды, сульфаты и фосфаты натрия, калия, аммония, железа, кальция и магния.

Концентрацию клавулановой кислоты можно определять микробиологически с использованием микробов, продуцирующих бета-лактамазу, таких как, например, Klebsiella aerogenes, хотя, предпочтительно проводить такое определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Экстрагирование клавулановой кислоты или ее солей из питательной среды можно проводить тем же способом, что используется для экстракции других антибиотиков, особенно, других бета-лактамов с применением для этого ионообменных смол или растворителей или любых других известных в технике традиционных методов.

Уровень растворимого фосфата в исходной среде может быть определен с помощью простой и быстрой процедуры, например с использованием коммерческого набора (Boehringer Mannheim Automated Analysis for BM/Hitachi System 704). Метод основан на реакции неорганического фосфора с молибдатом аммония. Затем неорганический фосфор выражают в виде фосфата. Для проведения анализа растворимого фосфата образец (гомогенно взятый из культуральной питательной среды) предварительно фильтруют для удаления твердых веществ через ультрамикропористый мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм или с близкими размерами. Указанный образец следует отбирать после стерилизации культуральной среды, поскольку концентрация растворимого фосфата может колебаться в соответствии с процессом стерилизации. Образцы можно также отбирать в ходе ферментации.

Анализ общего фосфата проводят путем отбора 1 мл из общей питательной среды и добавлением 1 мл серной кислоты и 5 мл азотной кислоты. Этот раствор выпаривают при нагревании до получения конечного объема 1 мл прозрачного раствора. Полученный конечный объем доводят до 25 мл дистиллированной водой и анализируют с помощью вышеуказанного метода уровень растворимого фосфата.

Было показано, что, если ферментация осуществляется в периодическом режиме, оптимальный уровень растворимого фосфата в начале ферментации составляет от 500 до 4000 мг/л и предпочтительно, от 800 до 1600 мг/л.

Если, благодаря природе используемых исходных материалов и их концентраций, уровень растворимого фосфата оказывается выше или ниже указанных пределов, его следует корректировать. В таком случае, если уровень его ниже нижнего предела, то перед или после стерилизации добавляют большее количество неорганического фосфата, например, в виде калиевой или натриевой соли, вплоть до достижения нужного уровня. Альтернативно, когда указанный уровень слишком высок, часть растворимого фосфата может быть осаждена путем добавления любого осадителя, например, соединения кальция, такого как гидроксид или ацетат кальция, или с использованием другой системы, которая обеспечивает достижение нужного результата.

Согласно настоящему изобретению наблюдается повышение продукции до 5 раз в сравнении с системой ферментации, без контроля начального уровня растворимого фосфора в среде в периодической культуре. В таблице I приведены данные нескольких ферментаций, осуществленных с оптимальным уровнем растворимого фосфата и вне этого уровня.

Процентное повышение (%) обозначает получение клавулановой кислоты и/или ее солей, выраженное в виде результата от умножения конечного значения с мкг/мл на 100 и деления полученной величины на 311 (в случае 72-часовой инкубации) или на 420 (при 96-часовой инкубации), и которая представляет результаты ферментации, в которой уровень растворимого фосфата находится за пределами оптимальных значений.

Этот фосфат должен обладать растворимостью в ферментационной питательной среде, как видно из данных, приведенных в таблице II, в соответствии с которыми подобные уровни общего фосфата приводят к ферментациям с очень несопоставимыми результатами, зависящими от того, попадает ли или нет концентрация растворимого фосфата в диапазон оптимальных значений.

По всей видимости, различие в получении (производительности) с разницей в росте микроорганизма для различных уровней фосфата, по крайней мере, это не главный фактор. Как видно из данных таблицы III, при близких показателях роста могут отмечаться различные уровни производительности так, что уровень фосфата вновь следует назвать причиной повышения получения (производительности). Объем мицелия был определен при центрифугировании со скоростью 2500 g в течение 10 минут (g обозначает силу гравитации).

Возможно осуществлять процесс добавления порционной подачи фосфата в ходе ферментации, а также оставшихся питательных веществ, распределенных в ходе всей ферментации. Было обнаружено, что оптимальный уровень общего растворимого фосфата (первоначального и добавленного) несколько меньше, чем его уровень в периодическом режиме, соответствующий значениям от 400 до 2000 мг/л.

Такая подача должна осуществляться таким образом, чтобы исходный уровень находился в диапазоне от 150 до 600 мг/л, и чтобы уровень растворимого фосфата в ходе процесса ферментации составлял от 20 до 150 мг/л. В таком случае, в целях поддержания уровня фосфата в указанных пределах, приемлемо, как в случае периодической ферментации, осуществлять подачу иона растворимого фосфата или любого осаждающего кальциевого соединения, в зависимости от того, что требуется: повысить или снизить уровень фосфата. В таблице IV приведены данные, показывающие результаты нескольких полунепрерывных ферментаций, осуществленных с различными концентрациями растворимого фосфата, присутствующего изначально или добавленного.

Можно отметить, что общее количество добавленного фосфата значительно выше без уменьшения производительности, когда такое добавление осуществляют в течение всего процесса ферментации, а не только в его начале. Все выполненные тесты поддерживали концентрацию растворимого фосфата в ходе всего процесса ферментации на указанном уровне, за исключением ферментации 8, 9 и 10, в ходе которых уровень был ниже требуемого, и 16, где этот уровень был выше.

В непрерывной культуре с помощью подходящего разбавления культуры вязкость постепенно снижается на протяжении всего процесса, что позволяет поддерживать концентрацию растворенного кислорода (>40%) в течение более длительного периода времени без усиления перемешивания, что позволяет избежать фрагментации мицелия и удлинить период получения клавулановой кислоты. В результате добавления питательных веществ и воды достигается, в целях поддержания соответствующего рабочего объема, полное заполнение имеющейся емкости, которая требует непрерывной экстракции питательной среды. Таким способом и путем контроля процесса путем добавления в культуральную среду в ходе процесса растворимого фосфата, достигают удлинения ферментационного цикла и увеличения общей производительности, что, в свою очередь, приводит к увеличению выхода производительности на геометрическую имеющуюся емкость.

Как и в предыдущих случаях, в непрерывной культуре, при осуществлении процесса в периодическом и полунепрерывном режимах осуществляют первоначальное добавление растворимого фосфата. Обычно величина такого добавления меньше, чем в случае периодических полунепрерывных культур, и составляет порядка 150-600 мг/л, предпочтительно начальная концентрация составляет от 200 до 400 мг/л, а последующий уровень в питательной среде того же порядка, т.е. 20-150 мг/л, поддерживается в течение более длительного периода времени (50-100 часов).

В непрерывных культурах, как при периодической или полунепрерывной ферментации, с целью установления в каждом случае нужных начальных концентраций и поддержания требуемых концентраций в ходе ферментации, осуществляют подачу растворимых фосфатных солей или кальциевых соединений или других эффективных связывающих веществ (Sequestering agents). Добавление общего количества растворимых фосфатных солей близко или несколько выше соответствующей величины, используемой при полунепрерывной ферментации.

Кроме того, для поддержания вязкости питательной среды на уровнях ниже 700 сП в культуральную среду, начиная с 32 часа и далее, добавляют воду, что позволяет увеличивать количество добавляемых в традиционные системы питательных веществ, сохраняя тем самым уровень растворенного кислорода выше 40% и удлиняя период получения клавулановой кислоты до 150-170 часов.

В ходе всего процесса обычно достигается общее разбавление от 1,5 до 1,6, в сравнении со значениями от 0,9 до 1,1 для традиционных культур, что в свою очередь делает рентабельным производство с геометрически увеличивающейся производительностью. Способ осуществляют путем добавления питательных веществ к исходной среде непрерывно в ходе всей ферментации. Эти питательные вещества представляют собой главным образом источники углерода. Начиная со 100 часов и далее осуществляют непрерывную или прерывистую экстракцию питательной среды в пропорции, составляющей от 2,5 до 14% от объема ферментера в день, с целью поддержания постоянного объема вязкости среды ниже 700 сП. Процесс может быть продлен до 160-170 часов.

Таблица V иллюстрирует данные примеров 19-25, в которых используют культуры порционной подачи и непрерывные культуры, различные питательные вещества и различные уровни или подачи растворимого фосфора.

С целью иллюстрации приводятся следующие примеры: Пример 1 (Сравнительный) Готовят инокуляционную среду, которая имеет следующий состав: Рыбная мука - 2 г Глицерин - 1,5 г Растворимый крахмал - 1,5 г
Карбонат кальция - 0,2 г
Дистиллированная вода (до баланса) - 100 мл
Значение рН доводят до 6,7 и среду распределяют в 250-мл колбах Эрленмейера порциями по 40 мл на колбу. Колбы закрывают пробками и стерилизуют при температуре 121^oС в течение 20 мин.

Приготовленную таким образом среду инокулируют суспензией спор мутантного штамма, который сверхпроизводит клавулановую кислоту, получение посредством стадии мутации Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином и нескольких стадий мутации ультрафиолетовым светом. Эту суспензию готовят из косячка агара или из плоской чашки с питательной средой, способной позволять рост и спорообразование.

После инокуляции среду инкубируют в течение 2 дней при 25^oС на вращающейся мешалке с эксцентриситетом 5 см при скорости 250 об/мин.

Полученную таким образом культуру используют для инокулирования в пропорции 5% ферментационной среды с следующим составом:
Соевая мука - 4 г
Кукурузный декстрин - 1 г
MOPS буфер - 1 г
(3-[N-морфолино]пропансульфоновая кислота)
Хлорид кальция - 10 мг
Хлорид натрия - 10 мг
Хлорид магния - 10 мг
Ацетат натрия - 0,1 г
Соевое масло - 2 г
Дистиллированная вода (до баланса) - 100 мл
Значение рН среды доводят до 7,0 и среду распределяют в 250-мл колбах порциями по 30 мл на колбу. Колбы закрывают пробками и стерилизуют при температуре 121^oС в течение 20 минут. После стерилизации измеряют содержание растворимого сульфата в одной из колб, получая значение 100 мг/л.

По ходу примера и с целью иллюстрации результатов ферментации 1, приведенной в таблице 1, в каждую колбу добавляют по 0,5 мл 0,5% раствора гидроксида кальция. После добавления, в одной из колб снова анализируют уровень растворимого фосфата и получают уже величину 18 мг/л, что соответствует уровню, при котором осуществляют упомянутую ферментацию 1.

Приготовленную и инокулированную таким образом ферментационную среду инкубируют при 25^oС на роторной мелашке с эксцентриситетом 5 см при скорости 250 об/мин. К 96 часам инкубации уровень продуцирования полученной клавулановой кислоты составляет, по данным ВЭЖХ, 420 мкг/мл.

Пример 2 (Сравнительный)
В данном примере используют ту же процедуру, что и в Примере 1, с тем исключением, что не добавляют гидроксид кальция. В результате ферментацию осуществляют в среде, содержащей растворимый фосфат в количестве 100 мг/л. К 96 часам инкубации уровень продуцирования клавулановой кислоты составляет, по данным ВЭЖХ, 790 мкг/мл (см. ферментацию 2 в таблице I).

Пример 3
В данном примере используют ту же процедуру, что и в Примере 1, с тем исключением, что не добавляют гидроксид кальция, а 0,12% первичный кислый фосфат калия, добавляемый перед доведением рН, включают в состав ферментационной среды. В одной из колб после стерилизации анализируют растворимый фосфат и устанавливают, что ферментация проходит в среде, содержащей растворимый фосфат в количестве 900 мг/л. К 96 часам инкубации уровень продуцирования клавулановой кислоты составляет, по данным ВЭЖХ, 2210 мкг/мл (см. ферментацию 3 в таблице I).

Пример 4
В данном примере используют ту же процедуру, что и в Примере 3, но в этом случае в состав ферментационной среды включают 0,21% первичный кислый фосфат калия. В одной из колб после стерилизации анализируют растворимый фосфат и устанавливают, что ферментация проходит в среде, содержащей растворимый фосфат в количестве 1580 мг/л. В этом случае проводят определение также общего фосфата и получают, как видно из данных таблицы II, значение в 2380 мг/л. К 96 часам инкубации уровень продуцирования клавулановой кислоты составляет, по данным ВЭЖХ, 2240 мкг/мл (см. ферментацию 4 в таблице I).

Пример 5
В данном примере используют ту же процедуру, что и в Примере 3, но в этом случае в состав включают 0,4% первичный кислый фосфат калия. В одной из колб после стерилизации анализируют растворимый фосфат и устанавливают, что ферментация проходит в среде, содержащей растворимый фосфат в количестве 3000 мг/л. К 96 часам инкубации уровень продуцирования клавулановой кислоты составляет, по данным ВЭЖХ, 1750 мкг/мл (см. фенментацию 5 в таблице I).

Пример 6 (Сравнительный)
В данном примере используют ту же процедуру, что и в Примере 3, но в этом случае в состав включают 0,95% первичный кислый фосфат калия. В одной из колб после стерилизации анализируют растворимый фосфат и устанавливают, что ферментация проходит в среде, содержащей растворимый фосфат в количестве 7000 мг/л. К 96 часам инкубации уровень продуцирования клавулановой кислоты составляет, по данным ВЭЖХ, 780 мкг/мл (см. ферментацию 6 в таблице I).

Пример 7 (Сравнительный)
В данном примере используют ту же процедуру, что и в Примере 3, но в этом случае в состав включают 0,245% трехосновный фосфат кальция (первичный кислый фосфат калия не включают). В одной из колб после стерилизации анализируют растворимый фосфат, в результате получают растворимый фосфат в количестве 230 мг/л. В этом случае проводят определение также общего фосфата и получают значение 2265 мг/л (см. ферментацию 7 в таблице II). К 96 часам инкубации уровень продуцирования клавулановой кислоты составляет, по данным ВЭЖХ, 920 мкг/л.

Примеры 8-18 (см. таблицу IV)
Готовят среду для инокуляции такого же состава, как и среда, описанная в Примере 1, и распределяют ее в 2000-мл колбы Эрленмейера с 500 мл среды. Колбы закрывают пробками и стерилизуют при температуре 121^oС в течение 20 минут.

Если инокулирование осуществляют суспензией спор, похожей с той, что была использована в Примере 1, среду инкубируют в течение 2 дней при 25^oС на роторной мешалке с эксцентриситетом 5 см при скорости 250 об/мин.

Отбирают 400 мл этой культуры и используют для инокулирования емкости с 150 л среды следующего состава:
Соевая мука - 2 г
Декстрин - 2 г
Первичный кислый фосфат калия - 0,04 г
Соевое масло - 0,1 г
Пеногаситель UCON (Полиалкиленгликоль) - 0,1 г
Вода (до баланса) - 100 мл
рН среды доводят до значения 7,3 и среду стерилизуют при температуре 121^oС в течение 20 мин. Инкубирование происходит при 28^oС в течение около 30 часов при перемешивании со скоростью 115 об/мин, аэрации 0,5 объем/объем/мин и при давлении под куполом 1 кг/см².

Отбирают 45 л культуры, инкубированной в указанных выше условиях, и переносят в резервуар с 450 л среды следующего состава:
Соевая мука - 4 г
Декстрин - 2 г
Соевое масло - 0,1 г
Пеногаситель UCON - 0,1 г
Хлорид магния - 0,02 г
Хлорид железа (3) - 0,003 г
Хлорид кальция - 0,01 г
Вода (до баланса) - 100 мл
рН среды доводят до значения 7,0 и среду стерилизуют при 121^oС в течение 20 минут. После стерилизации измеряют уровень растворимого фосфата и получают в данном случае величину от 200 мг/л до 300 мг/л. Если необходимо, с целью достижения различных начальных концентраций, это значение регулируют добавлением подходящих объемов 1% раствора первичного кислого фосфата калия (Примеры 10, 11, 12, 14, 15 и 16) или кальциевого соединения (Пример 8, в котором добавляют соответствующий объем раствора Ca(OH)₂). Когда отрегулирован растворимый фосфат, осуществляют перенос 45 л инокулирующей культуры и начинается ферментация. Последняя осуществляется при поддержании в течение первых 24 часов постоянных значений: температуры 25^oС, скорости 115 об/мин и аэрации 0,5 объем/объем/мин и затем, начиная с 25 часов и до конца ферментации, при аэрации 1,5 объем/объем/мин и при давлении под куполом 0,5 кг/см².

Различные концентрации растворимого фосфата в течение всей ферментации получают за счет добавления различных объемов стерильного 1% раствора первичного кислого фосфата калия (Примеры 13-18).

Для целей поддержания значения рН в диапазоне от 6,8 до 7,2 осуществляют автоматический контроль рН. При этом добавляют также следующие компоненты.

Соевое масло: 100 мл/час - в период времени от 10 до 120 часов;
33% глицерин: 400 мл/час - в период времени от 32 до 120 часов;
1% первичный кислый фосфат калия: от 400 до 1400 мл/час - в период времени от 0 до 25 часов и от 1500 до 5000 мл/час - в период времени от 25 до 50 часов.

После 120 часов инкубации уровень продуцирования клавулановой кислоты, как видно из данных таблицы IV, варьирует от 990 до 4020 мкг/мл.

Пример 19
Приготовление среды и создание условий для ферментации осуществляют аналогично тому, что было описано в Примерах 8-18 (таблица IV), за исключением того, что в данном случае декстрин в концентрации 34 г/л был включен в исходный цикл. Глицерин не добавляют, а вносят лишь Weichol-92 (синтетический триглицерид, содержащий 60% олеиновой кислоты, производимый компанией Industria Quimica Lassem) и 1% первичный кислый фосфат калия, соблюдая при этом следующую схему их добавления:
Weichol-92: 100 мл/час - в период от 10 до 120 часов;
первичный кислый фосфат калия (1%)
: от 400 до 1400 мл/час - в период от 0 до 25 часов и
: от 1500 до 5000 мл/час - в период от 25 до 50 часов.

Пример 20
Осуществляется процедура, аналогичная для Примера 19, за исключением того, что вместо синтетического триглицерида Weichol-92 добавляют соевое масло.

Пример 21
Осуществляется процедура, аналогичная Примеру 19, за исключением того, что ферментацию продлевают до 172 часов и устанавливают непрерывную систему с экстракциями общей питательной среды от 100 часов ферментации и далее в пропорции 2,5% питательной среды, экстрагируемой каждые 24 часа, относительно исходного объема ферментера после стерилизации.

Глицерин (33%), Priolube (глицерил триолеат, производимый компанией Unichenta) и первичный кислый фосфат калия (1%) вносят по следующей схеме:
Priolube: 100 мл/час - в период от 10 час до конца;
Глицерин (33%): 400 мл/час - в период от 32 час до конца;
Первичный кислый фосфат калия (1%):
: от 400 до 1400 мл/час - в период от 0 до 25 час и
: от 1500 до 5000 мл/час - в период от 25 до 50 час.

Пример 22
Осуществляется процедура, аналогичная для Примера 21, за исключением того, что ферментацию продлевают только до 150 часов, а экстракцию питательной среды осуществляют каждые 24 часа в пропорции 9%. Добавления осуществляют с модификациями, сделанными в соответствии со следующей схемой:
Priolube: 100 мл/час - в период от 10 час до 100 час
: 200 мл/час - в период от 100 час до конца.

Глицерин (33%): 420 мл/час - в период от 32 час до 100 час
: 780 мл/час - в период от 32 час до конца.

Первичный кислый фосфат калия (1%):
: от 400 до 1400 мл/час - в период от 0 до 25 час:
от 1500 до 5000 мл/час - в период от 25 до 50 час;
: 300 мл/час - в период от 50 час до конца.

Стерильная вода: 312 мл/час - в период от 32 час до 100 час
: 625 мл/час - в период от 100 час до конца.

Пример 23
Осуществляется процедура, аналогичная Примеру 22. Ферментацию продлевают до 172 часов с экстракцией питательной среды каждые 24 часа в пропорции 14%. Для целей поддержания низкого значения вязкости также включается программа добавления стерильной воды.

Priolube: 130 мл/час - в период от 10 час до 100 час
: 240 мл/час - в период от 100 час до конца.

Глицерин (33%): 515 мл/час - в период от 32 час до 100 час
: 960 мл/час - в период от 32 час до конца.

Первичный кислый фосфат калия (1%):
: от 400 до 1400 мл/час - в период от 0 до 25 час
: от 1500 до 5000 мл/час - в период от 25 до 50 час
: 300 мл/час - в период от 50 час до конца.

Стерильная вода: 630 мл/час - в период от 32 час до 100 час:
: 1260 мл/час - в период от 100 час до конца.

Пример 24
Осуществляется процедура, аналогичная описанной в Примере 23, но объем начальной ферментационной среды увеличивают на 30% относительно всех ее исходных материалов. Ферментация достигает 155 часов, а осуществленная экстракция представляет собой каждые 24 часа в пропорции 14%. Добавление осуществляют по следующей схеме:
Priolube: 130 мл/час - в период от 10 час до 100 час
: 240 мл/час - в период от 100 час до конца.

Глицерин (33%): 515 мл/час - в период от 32 час до 100 час
: 960 мл/час - в период от 32 час до конца.

Первичный кислый фосфат калия (1%):
: от 400 до 1400 мл/час - в период от 0 до 25 час
: от 1500 до 5000 мл/час - в период от 25 до 50 час
: 300 мл/час - в период от 50 час до конца.

Стерильная вода: 630 мл/час - в период от 32 час до 100 час
: 1260 мл/час - в период от 100 час до конца.

Пример 25
Процедура аналогична описанной в Примере 21. Ферментацию продлевают до 150 часов, а экстракцию осуществляют каждые 24 часа в пропорции 9%. Глицерин совсем не добавляют, а количество добавляемого триглицерида Priolube увеличивают. Количество добавляемых фосфата и стерильной воды идентично количествам, приведенным в Примере 22. Добавление Priolube осуществляют а соответствии со следующей программой:
Priolube: 320 мл/час - в период от 10 час до 100 час
: 590 мл/час - в период от 100 час до конца.

Формула изобретения

1. Способ получения клавулановой кислоты и/или ее солей посредством культивирования Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 при глубинной ферментации с аэрацией и перемешиванием в периодической, полунепрерывной или непрерывной культуре, включающий стадии культивирования штамма и выделения кислоты, отличающийся тем, что на начальной стадии концентрацию растворимого фосфата фиксируют в интервале 500-4000 мг/л для периодической культуры и в интервале 150-600 мг/л для полунепрерывной или непрерывной культур и после начальной стадии концентрацию растворимого фосфата поддерживают в интервале 20-150 мг/л для полунепрерывной или непрерывной культуры.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию растворимого фосфата фиксируют в начале ферментации и/или поддерживают в течение всей ферментации посредством добавления к упомянутой культуральной среде иона растворимого фосфата в любой из его форм.

3. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что концентрацию растворимого фосфата фиксируют в начале ферментации и/или поддерживают в течение всей ферментации посредством осаждения растворимого фосфата, если его количество превышает требуемые пределы.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что упомянутый растворимый фосфат осаждают добавлением к культуральной среде соединения кальция.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что при культивировании используют источник углерода, который состоит из одного или более натуральных или синтетических триглицеридов, которые добавляют в начале или в ходе ферментации.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что один или более натуральных или синтетических триглицеридов, которые добавляют в начале или в ходе ферментации, используют исключительно в качестве источника углерода.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что ферментацию осуществляют при температуре 20-40^oС.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что ферментацию осуществляют при температуре 22-30^oС.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5