N-замещенные производные 5-оксииминобарбитуровой кислоты

 

Изобретение относится к медицине, точнее к фармакологии, конкретно к синтетическим биологически активным соединениям гетероциклического ряда. Задача изобретения - получение новых химических соединений, обладающих противовирусной, иммуностимулирующей, антихламидийной и противотуберкулезной активностью, а также противомикробной, антиагрегационной, антиатеросклеротической, психостимулирующей, психодепрессивной, анальгезирующей, гипогликемической, противоязвенной, гепатопротекторной и антиоксидантной активностями. Другими словами, задача изобретения - синтез биологически активного вещества, превосходящего прототип по биологической активности и по широте биологического действия. Поставленная задача решается путем синтеза группы новых химических соединений - N-замещенных производных 5-оксииминобарбитуровой (виолуровой) кислоты общей формулы (1), где значения радикалов X, R1 и R2 указаны в тексте описания. Приведены примеры синтеза веществ, данные выходов продуктов, данные элементного анализа и результаты экспериментов по определению их биологических свойств. 45 з.п.ф-лы, 19 табл.

Область техники.

Изобретение относится к медицине, точнее к фармакологии, конкретно к синтетическим биологически активным соединениям гетероциклического ряда, обладающим противовирусной, иммуностимулирующсй (интерферониндуцирующей), антихламидийной, противотуберкулезной, антиагрегационной, антиатеросклеротической, психостимулирующей, психодепрессивной, анальгезирующей, гипогликемической, противоязвенной, гепатопротекторной и антиоксидантной активностями: производным 5-оксииминобарбитуровой (виолуровой) кислоты.

Указанные производные имеют высокую противовирусную активность по отношению к вирусам простого герпеса, высокую активность как индукторы интерферона, высокую антихламидийную активность, а также антимикробную активность по отношению к микобактериям туберкулеза, антиаггрегационную, аитисклеротическую, психостимулирующую, психодепрессивную, анальгезирующую, гипогликемическую, противоязвенную, гепатопротекторную и антиоксидантную активности. Соединения предназначены, в основном, для использования в медицинской практике для лечения вирусных инфекций; инфекций, вызванных хламидиями; заболеваний, сопровождающихся иммунодефицитом: злокачественных новообразований; туберкулеза; микобактериозов; инфаркта миокарда; заболеваний почек, печени, нервной системы и ряда других; для использования в качестве противоболевых средств.

Кроме того, указанные соединения могут быть использованы для тех же целей в ветеринарии и косметологии.

Уровень техники.

Как известно, одну из наиболее серьезных проблем современной медицины представляют вирусные заболевания. Как правило, вирусные инфекции, например, вызываемые вирусами группы герпеса, крайне плохо поддаются лечению. Это связано как с недостаточной эффективностью существующих препаратов, так и с быстрой изменчивостью вирусов, мутации которых приводят к появлению более устойчивых форм (Pharmaceutical microbiology. Ed. by W.B.Hugo and A.D.Russel, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1987; Saltzmann R., Jurewicz R., Boon B, Safety of famciclovir in patients with herpes zoster and genital gerpes, Antimicrobial agents and Chemotheraphy, 1994, V.38, No. 10). Часто вирусные заболевания протекают на фоне снижения активности иммунной системы организма) и сопровождаются вторичными инфекциями, это же относится и к онкологическим заболеваниям. Поэтому проблема разработки эффективных противовирусных и противоопухолевых препаратов тесно связана с поиском средств для лечения иммунодефицитных состояний различного происхождения. Как известно, стимуляторы иммунной системы используются при лечении ряда онкологических заболеваний.

Известные противовирусные препараты можно условно разделить на 2 группы по типам механизмов их действия. Действие препаратов первой группы связано с подавлением репродукции вирусов в организме (Pharmaceutical microbiology. Ed. by W.B.Hugo and A.D.Russel, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1987). К таким препаратам относятся производные адамантана -ремантадин (Машковский М. Д. Лекарственные средства. Часть II. - М.: Медицина, 1993); тиосемикарбазоны (метисазон, там же), наиболее активными являются производные и аналоги нуклеозидов - ацикловир, ганцикловир, ретровир ( Pharmaceutical microbiology. Ed. by W.B.Hugo and A.D.Russel, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1987) и другие. Противовирусные препараты второй группы оказывают эффект не столько за счет воздействия на сами вирусы, сколько за счет стимуляции иммунной защиты организма и усиления выработки эндогенных интерферонов (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Часть II. - М.: Медицина, 1993). Препаратами такого типа являются арбидол (там же), неовир (заявка РФ PCT/RU 95/00079 - WO 96/07423, опубл. 14.03.96, Иммуномодулирующее лекарственное средство) и другие.

Несмотря на интенсивность поисков противовирусных и иммуностимулирующих средств среди самых различных классов химических соединений, потребность в новых препаратов такого типа только возрастает, что связано как с недостаточной эффективностью имеющихся лекарств (особенно в случае иммунодефицитных состояний), так и с появлением новых форм вирусов, устойчивых к воздействию известных химиотерапевтических агентов.

Анализ литературы показывает, что наибольшее количество эффективных противовирусных препаратов обнаружено среди производных пиримидина (Negwer М., Organic-chemical drugs and their synonims. Academic-Verlag, Berlin, 1987). В ряду пиримидина важное место занимают производные барбитуровой кислоты, обладающие разнообразной биологической активностью (Bojarski J.T., Mockrosz J. L. , Barton H.J., Paluchowska M.H. Advances in Het. Chem., Ed. by A.R.Katritzky, 1985, V. 38). Так, среди барбитуровых кислот было обнаружено немало активных противовирусных (Спасов А.В., Райков З.Д., авт. свид. Болгарии No. 17122, Мкл. С 07 D 51/22, заявл. 05.06.71; Ueda Т., Kato S., патент Японии 11832 ('62), Aug. 23, заявлен 10.05.1958; Misra V.S., Khan M.A., Srivastava N. , Verma H.N., Current Science, V.55, No. 23) и противоопухолевых агентов (Krepelka J. , Kotva R. , Pijman V. , Semonsky M., патенты Чехословакии NN215554; 215593; 215580, Мкл. C 07 D 239/54 от 15.04.1984; Ukita C., патент Японии 1445 ('64), Feb. 14). Соединения этого класса обладают бактериостатическим (Biswas С. Dissert. Abstracts 1964, V.24, No. 9, P.3501; Langley B. W. , патент Великобритании No. 845378 от 24.08.60), противовоспалительным (Eiden F., Kucklaender U. Ger. Offen 1944419(CI C07 D, A61k),11 mar 1991), и иммуномодулирующим (Blythin D.J., Coldwell N.J., US patent No 4272535, publ. 09.07.1981) действиями.

Среди производных пиримидина существует довольно обширная группа 5-оксииминобарбитуровых (виолуровых) кислот. В отличие от других групп пиримидинов и барбитуровых кислот виолуровая кислота и ее производные крайне мало исследованы с позиции биологической активности. Виолуровая кислота и некоторые ее производные были известны давно (Hantzsch A., Isherwood P.C., Chem. Berichte, 1909, В.42),однако использовались только как аналитические реагенты и полупродукты в органическом синтезе (Ziegler M., Glemser О., Microchim. Acta, 1956, No 10; Ligten J.W., Velthuyzen H., Microchim. Acta, 1964, No 5; R.GHOSH & B.R.SINGH, "Protor Donor-Acceptor Equilibria in Solution...", Indian Jomal of Chemisrty, V.21A, January 1982; GARCIA-ESPANA, MARIA-JESUS BALESTER et al., J.CHEM.SOC.,DALTON TRANS.,1988; SANDRO GHISLA and STEPHEN G. MAYHEW, Eur.J.Biochem.63, 1976). Лишь в 1988 г. виолуровая кислота была предложена в качестве антидотного средства при отравлениях нитросоединениями (Бурбелло А. Т. Автореф. дисс. на соиск. уч. степени д.м.н., 1992). Другое производное - натриевая соль 2-метилтиовиолуровой кислоты - было использовано как противоотечный препарат при токсическом отеке легкого (Бурбелло Ф.Т, Денисенко П. П., Слесарев В.И., Сафонова А.Ф., Краснов К.А., Баскович Г.А., Авт. свидетельство СССР N 4774701, приоритет 15.01.1989). В работе (Шугалей И. В. , Целинский И.В., Краснов К.А., Седельникова Н.А., Журн. Общей Химии, 1993, Т. 63, Вып. 7) показано, что виолуровая кислота обладает свойством стабилизировать гемоглобин, препятствуя его окислению в метгемоглобин на моделях in vitro.

Виолуровую кислоту получают из барбитуровой кислоты с помощью реакции нитрозирования (Hantzsch A. , Isherwood P.C., Chem. Berichte, 1909, В.42). Реакция имеет общий характер, то есть другие (N-замещенные) производные виолуровой кислоты могут быть получены таким же путем из соответствующих производных барбитуровой кислоты. Необходимые для синтеза производные барбитуровой кислоты получают из соответствующих замещенных мочевин. При этом для получения барбитуровых кислот, имеющих заместитель при только одном атоме азота используют, как правило, метод Фишера (Fischer E., Diltey A., Lieb. Annalen, 1904, В.335), то есть конденсацию монозамещенной мочевины с малоновым эфиром в присутствии этилата натрия. Для получения барбитуровых кислот, имеющих два заместителя, при атомах азота N¹ и N³, используют конденсацию соответствующей N, N'-дизамещенной мочевины с малоновой кислотой в присутствии PCl₅ или РОС1₃ (Senda S., Fujimura H., Izumi M., патент Японии 29856('64), Dec. 22). Наконец, необходимые для синтеза производные мочевины и тиомочевины получают общедоступными методами, рассмотренными в работе (Вишнякова Т.И., Голубева И.А., Глебова Е.В., Усп. Химии, 1985, T.LIV).

В качестве прототипа выбрана 5-оксииминобарбтуровая (виолуровая) кислота (Hantzsch A., Isherwood Р.С., Chem. Berichte, 1909, В.42). Выбор обусловлен тем обстоятельством, что виолуровая кислота, обладающая биологической активностью, является среди известных соединений наиболее близким по химической структуре к заявляемому веществу.

Задача изобретения Задачей изобретения является получение новых химических соединений, обладающих противовирусной активностью (по отношению к вирусам простого герпеса), иммуностимулирующей активностью (за счет индукции выработки эндогенных интерферонов в организме), антихламидийной и противотуберкулезной активностью, а также антиагрегационной, антиатеросклеротической, психостимулирующей, психодепрессивной, анальгезирующей, гипогликемической, противоязвенной, гепатопротекторной и антиоксндантной активностями. Другими словами, задача изобретения сводится к химическому синтезу биологически активного вещества, превосходящего прототип по биологической активности и по широте биологического действия.

Сущность изобретения Поставленная задача решается путем синтеза группы новых химических соединений - N-замещенных производных 5-оксииминобарбитуровой (виолуровой) кислоты общей формулы (1) где X - атом кислорода или серы; R1 выбран из группы: насыщенный алкан с числом атомов углерода 2-10 (за исключением н-гексила); ненасыщенный алкан с числом атомов водорода 2-10; циклоалкан: арилалкан (за исключением бензила) и арил, которые могут иметь 1-3 заместителя; R2 - атом водорода или выбран из группы: насыщенный алкан с числом атомов углерода 1-10 или ненасыщенный алкан с числом атомов углерода 2-10; циклоалкан; арилалкан; арил (за исключением фенила).

На момент подачи заявки наилучшее решение поставленной задачи получено заявителем при сочетаниях, приведенных в конце текста после таблиц.

Заявляемые вещества является новыми, поскольку они неизвестны из доступных источников информации.

Следует отметить, что использование остальных представителей групп, указанных в формуле (1) (из которых производится выбор), не имеет принципиального значения для решения задачи настоящего изобретения, поскольку факт наличия заявляемой биологической активности обнаруживается в той или иной степени у всех представителей данной группы при Х, R1, R2, перечисленных в общей формуле. Способ синтеза заявляемых веществ является также общим для всех членов группы. Таким образом, принципиальное значение имеет не конкретная структура радикалов R1 и R2, которая влияет лишь на количественный уровень биологической активности, а принадлежность этих радикалов к химическим группам, перечисленным в общей формуле (1).

Заявляемое решение является неочевидным. Никаких данных о противовирусной, иммунотропной, антихламидийной, антибактериальной, антиагрегационной, антиатеросклеротической, психостимулирующей, психодепрессивной, анальгезирующей, гипогликемической, противоязвенной, гепатопротекторной и антиоксидантной активности 5-оксииминобарбитуровой кислоты и ее производных ранее не было известно. Таким образом, получение группы новых производных 5-оксииминобарбитуровой (виолуровой) кислоты и обнаружение у них противовирусной, иммуностимулирующей (интерферониндуцирующей), антихламидийной, противотуберкулезной, антиагрегационной, антиатеросклеротической, психостимулирующей, психодепрессивной, анальгезирующей, гипогликемической, противоязвенной, гепатопротекторной и антиоксидантной активностей никак не вытекает очевидным образом из современного уровня техники.

Раскрытие изобретения.

Сущность изобретения поясняется приведенными ниже примерами синтеза промежуточных веществ и общим примером синтеза заявляемых веществ, данными выходов промежуточных и целевых продуктов, данными элементного анализа целевых продуктов и результатами 14 серий экспериментов по определению их биологических свойств.

Примеры 1 и 2 - варианты синтеза промежуточных веществ (LI-IC) (получение производных барбитуровой кислоты, перечисленных в Таблицах 1 и 2). Это первый этап синтеза заявляемых веществ.

Пример 3 - вариант синтеза заявляемых веществ (получение целевых продуктов (II-L), т.е. производных 5-оксииминобарбитуровой кислоты, перечисленных в Таблице 3 ). Это второй этап синтеза заявляемых веществ.

Таблица 1 - исходные продукты для синтеза промежуточных веществ, температуры плавления и выход промежуточных веществ (LI-XCII), т.е. N-монозамещенных производных барбитуровой кислоты.

Таблица 2 - исходные продукты для синтеза промежуточных веществ, температуры плавления и выход промежуточных веществ (XCIII-IC), т.е. N,N'-дизамещенных производных барбитуровой кислоты.

Таблица 3 - выход и температуры плавления целевых продуктов (II-L), т.е. N-замещенных производных 5-оксииминобарбитуровой кислоты.

Таблица 4 - данные элементного анализа целевых продуктов (II-XXXV).

Таблица 5 - данные элементного анализа целевых продуктов (XXXVI-L).

Данные четырнадцати серий экспериментов по определению биологической активности заявляемых соединений содержат: Эксперимент 1 - Определение антимикробного (М. smegmatis, M. tuberculosis) действия заявленных веществ (с Таблицей 6) Эксперимент 2 - Определение максимально переносимой дозы заявленных веществ ( с Таблицей 7).

Эксперимент 3 - Определение действия заявленных веществ на вирус герпеса (с Таблицей 8).

Эксперимент 4 - Определение интерферониндуцирующей активности заявленных веществ (с Таблицей 9).

Эксперимент 5 - Определение действия заявленных веществ на Chlamydia trachomatis (с Таблицей 10).

Эксперимент 6 - Определение антиаггрегационных свойств заявленных веществ (с Таблицей 11).

Эксперимент 7 - Определение антиатеросклеротических свойств заявленных веществ (с Таблицей 12).

Эксперимент 8 - Определение психостимулирующей активности заявленных веществ (с Таблицей 13).

Эксперимент 9 - Определение психодепрессивной активности заявленных веществ (с Таблицей 14).

Эксперимент 10 - Оценка анальгезирующей активности заявленных веществ (с Таблицей 15).

Эксперимент 11 - Оценка гипогликемического действия заявленных веществ (с Таблицей 16).

Эксперимент 12 - Определение противоязвенного действия заявленных веществ (с Таблицей 17).

Эксперимент 13 - Определение гепатопротекторной активности заявленных веществ (с Таблицей 18).

Эксперимент 14 - Определение антиоксидантного действия заявленных веществ (с Таблицей 19).

Примеры синтеза заявленных веществ.

Лучший известный авторам способ синтеза заявленных веществ состоит из двух основных этапов:
1) синтезируют соответствующее производное барбитуровой кислоты (LI-IC) из соответствующих производных мочевины (C-CXLVIII, смотри Таблицы 1 и 2) и малоновой кислоты (CIL, CL);
2) получают целевые соединения (II-L) из синтезированных на первом этапе промежуточных веществ (LI-IC) путем их обработки NaNO₂ и кислотой.

Способ является общим для всех заявляемых соединений
Пример 1. Вариант синтеза промежуточных веществ (LI-XCII), т.е. N-монозамещенных производных барбитуровой кислоты, - вариант первого этапа синтеза заявленных веществ.

4,6 г (0,2 моль) металлического натрия растворяют в 100 мл абсолютного этанола. К полученному раствору прибавляют 16 г (0,1 моль) малонового эфира и перемешивают 5 минут. Затем прибавляют 0,1 моль производного мочевины (C-CXLIII) и перемешивают 6 часов при кипячении смеси с обратным холодильником Затем охлаждают смесь до 25^oС и прибавляют 30 мл воды. Раствор фильтруют от осадка, после чего подкисляют НС1 до рН 1, охлаждают до 5^oС и выдерживают при этой температуре 3 часа. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой и сушат. Продукт перекристаллизовывают из спирта. Выходы и температуры плавления приведены в Таблице 1.

Пример 2. Вариант синтеза промежуточных веществ (XCIII-IC), т.е. N,N'-дизамещенных производных барбитуровой кислоты - вариант выполнения первого этапа синтеза заявленных веществ.

Прибавляют к 10,4 г (0,1 моль) малоновой кислоты (CL) 25 мл хлороформа и перемешивают. К полученной смеси прибавляют 31,4 г (0,15 моль) пятихлористого фосфора и перемешивают при 40^oС до полного растворения продуктов. Затем прибавляют 0,1 моль производного мочевины (CXLII CXLVIII) и перемешивают 12 часов при кипячении смеси с обратным холодильником. Затем охлаждают смесь до 25^oС, прибавляют 50 мл воды, перемешивают и отделяют водный слой. Повторно экстрагируют органический слой 50 мл воды. Затем прибавляют к органическому слою 30 мл 25%-ного раствора аммиака и 50 мл воды, смесь тщательно взбалтывают и отделяют водно-аммиачный слой. Водно-аммиачный раствор выдерживают 3 часа при 25^oС, после чего фильтруют от осадка и фильтрат подкисляют НС1 до рН 1. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой и сушат. Продукт перекристаллизовывают из спирта. Выходы и температуры плавления приведены в Таблице 2.

Пример 3. Вариант синтеза заявляемых веществ (получение целевых продуктов (II-L), т.е. производных 5-оксииминобарбитуровой кислоты) - вариант выполнения второго этапа синтеза заявленных веществ.

Растворяют 0,1 моль производного барбитуровой кислоты (LI-IC) в 60 мл воды, содержащей 6,0 г (0,15 моль) NaOH. К полученному прозрачному раствору прибавляют 10 мл спирта, затем приливают раствор 7,6 г (0,11 моль) нитрита натрия в 30 мл воды и затем перемешивают. Охлаждают смесь до 10^oС, затем при перемешивании прибавляют 18 г (0,3 моль) уксусной кислоты и выдерживают смесь при 25^oС 1 час. К полученной смеси прибавляют 25 мл 30%-ной соляной кислоты и перемешивают 10 минут. Выпавший осадок фильтруют, промывают 50%-ным спиртом, затем водой. Продукт перекристаллизовывают из водного спирта и сушат в вакууме в присутствии P₂O₅. Выходы и температуры плавления приведены в Таблице 3, данные элементного анализа - в Таблицах 4 и 5.

Экспериментальная проверка биологической активности заявляемых соединений.

Эксперимент 1. Определение антимикробного (М. smegmatis, M. tuberculosis) действия заявляемых веществ.

Для определения антимикробной активности были использованы стандартные штаммы Mycobacteium smegmatis ATCC607 и Mycobacterium tuberculosis H37Rv, чувствительные ко всем антимикробным веществам. Оценку антимикобактериального действия проводили методом серийных разведений [1] . М. smegmatis ATCC607 для засева выращивали на жидкой синтетической среде N-1. Вещества растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и титровали в среде N-1 так, что данный препарат содержался в отдельных пробирках со средой в концентрациях от 200 до 0,025 мг/л. Концентрация вещества в среде соседних пробирок отличалась в два раза. В контроле использовали ДМСО, который титровали так же, как и препарат. Тест-штамм бактерий добавляли в количестве 1-2•10⁶ мл. Результат учитывали после 72-часового культивирования пробирок при 37^oС.

Для М. tuberculosis H37Rv условия постановки опыта были идентичными за исключением того, что бактерии выращивали на среде Сотона, содержащей 10% лошадиной сыворотки, и плотность микробной суспензии при засеве составляла 50•10⁶. В качестве контроля в обоих случаях были использованы известные туберкулостатические вещества. Результаты, полученные для использованного штамма, приведены в таблице 6.

Приведенные в таблице 6 данные показывают, что вещество XL обладает антимикробной активностью по отношению к использованным штаммам микобактерий в концентрациях от 3,0 до 12,5 мг/л.

Другие заявленные вещества обладают меньшей антимикробной активностью.

Эксперимент 2. Определение максимально переносимой дозы.

Испытуемое вещество вводили перорально с помощью желудочного зонда (300 мг/кг) или внутрибрюшинно (100 мг/кг) белым нелинейным мышам массой 18-20 г (по 3 самца и 3 самки в каждой из испытуемых групп), после чего наблюдали за их состоянием на протяжении 72 часов. Отсутствие симптоматики, свойственной токсическим эффектам, и отсутствие гибели животных в течение указанного времени позволяет сделать вывод о низкой токсичности изучаемого соединения. При наличии острых токсических эффектов доза уменьшается до выявления максимальной переносимой дозы [25].

Полученные результаты свидетельствуют, что при приеме через рот заявляемые вещества в концентрации 300 мг/кг не обладают острой токсичностью для мышей.

Эксперимент 3. Определение действия заявляемых веществ на вирус герпеса.

Антивирусная активность изучалась по отношению к вирусу герпеса I типа (ВПГ-I /Ленинград/248/88) по общепринятому методу [26].

Вирусы выращивали на перевиваемой культуре клеток Vero, полученной из банка клеточных культур Института цитологии РАН.

Схема постановки опыта.

К клеткам, выращенным на среде RPMI-1640 с 10% телячьей сыворотки и помещенным в лунки 96-луночного плато, добавляли вирус в конечной концентрации 10 частиц/мл и заявленные вещества, растворенные в ДМСО, в конечной концентрации 100, 10 и 1 мг/л. Для каждой испытанной концентрации вещества использовали 5 независимых лунок. Плато инкубировали в течение 60 мин при 38^oС в СО₂-инкубаторе. После инкубации вирус удаляли и снова вносили свежую среду, содержащую заявленные вещества в использованных концентрациях.

Результаты оценивали по наличию цитопатогенного действия вируса на клетки через 36 часов инкубации при 38^oС в СО₂-инкубаторе.

В опыте были использованы следующие контроли.

1. Контроль культуры клеток (способность к нормальному росту).

2. Контроль вируса (оценка способности к репродукции).

3. Контроль антивирусной активности противовирусного препарата ацикловира.

4. Контроль соединений (токсичность соединений).

5. Контроль растворителя (ДМСО) на токсичность.

Для оценки цитопатического действия вируса подсчитывали число неизмененных клеток в 100 полях, образованных специальной сеткой окуляра инвертированного микроскопа. Полученные результаты представлены в Таблице 8.

Полученные результаты указывают, что приведенные в Таблице 9 заявленные вещества обладают антегерпетической активностью, сравнимой с таковой у стандартного препарата ацикловира. Остальные заявленные вещества имели менее выраженную активность в процессе подавления репродукции вируса герпеса в выбранных условиях эксперимента.

Эксперимент 4. Определение интерферониндуцирующей активности заявленных веществ.

Индукцию синтеза интерферонов заявленными веществами проводили на первичной культуре человеческих лимфоцитов (именно данные клетки в организме человека являются основными продуцентами интерферонов). Для получения культуры лимфоцитов использовали свежую (12 часов после забора) кровь здоровых доноров (не второй группы) Для выделения лимфоцитов гепаринизированная кровь, полученная от здорового донора, подвергалась центрифугированию в градиенте плотности фиколл-верографин 1,71 г/см³ для выделения фракции иммунокомпетентных клеток. Указанная фракция отбиралась и разводилась питательной средой RPMI-1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина. Концентрацию лимфоцитов учитывали после окрашивания метиленовым синим и подсчета количества клеток в камере Горяева. Исходные растворы заявляемых веществ разводили питательной средой RPMI-1640 так, чтобы конечные концентрации веществ составляли ряд: 100, 10 и 1 мг/л после внесения суспензии лимфоцитов. Конечная концентрация лимфоцитов в индукционной смеси составила 3•10⁶ клеток/мл.

Параллельно с опытными пробами проставлялись следующие контроли:
1) контроль спонтанной продукции интерферонов (ИФН) лимфоцитами,
2) контроль протекания процесса при воздействии стандартизированного индуктора ИФН - N-метил-N-(а,D-глюкопиранозил)аммоний-10-метиленкарбоксилат акридона (циклоферон),
3) контроль протекания процесса при воздействии стандартизированного индуктора ИФН - Неовира (натрия 10-метиленкарбоксилат-9-акридон) с соответствующим содержанием DMCO в опытных пробах,
4) контроль спонтанной продукции интерферонов в присутствии DMCO в количестве, соответствующем испытуемым образцам.

Контрольные и опытные образцы инкубировали 24 часа при 37^oС. После инкубации пробы центрифугировались при 2000 g для осаждения клеточных элементов и из проб отбирался ИФН-содержащий супернатант, который анализировали на количественное содержание ИФН. Осадок клеток ресуспендировали в прежнем объеме питательной среды, окрашивали витальным красителем - трипановым синим - и подсчитывали число клеток в камере Горяева (как описано выше) для определения цитотоксического действия препаратов. Количественное определение содержания ИФН в контрольных и опытных образцах производили с использованием иммуноферментной тест-системы ProCon IF2 plus на ИФН-а производства ТОО "Протеиновый контур". Для определения количества интерферона в пробе использовали твердофазный иммуноферметный метод с использованием пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Активность связанной пероксидазы измеряли с использованием автоматического фотометра для микропланшетов с микропроцессором при длине волны 450 нм.

Для подсчета результатов параллельно определяли активность ИФН у станартных растворов ИФН, содержащих известное количество препарата. На основании полученных результатов строилась калибровочная кривая, позволяющая при использовании микропроцессора автоматического фотометра получать данные, выраженные в Международных Единицах активности (ME). Результаты анализа выражаются в ME активности ИФН на 1 мл в данной индукционной системе, содержащей 3•10⁴ лимфоцитов/мл. Каждая опытная и контрольная точка исследовалась в 4 параллелях.

Контроли иммуноферментной реакции.

1. Контроль DMCO с питательной средой.

2. Контроль компонентов системы (согласно инструкции). Все результаты учитывались только при соответствии контролей паспортным данным системы. Полученные результаты подвергались статистическому анализу по t-критерию с расчетом доверительного интервала при р=0,05. Произведен анализ сходимости результатов в параллельных опытах.

В результате проведенных исследований установлено, что среди заявленных веществ имеются пробы, обладающие способностью индуцировать синтез ИФН (Таблица 9).

Эксперимент 5. Определение действия заявленных веществ на Chlamydia trachomatis.

Антимикробную активность заявленных веществ изучали по отношению к С. trachomatis D323 - стандартному штамму из коллекции кафедры микробиологии С. Петербургского государственного университета им. акад. И.П.Павлова. Данный штамм был выделен от больного с хламидийным уретритом, имеет морфологию и физиологическую активность, характерную для представителей данного вида, чувствителен к действию веществ, используемых для лечения хламидийной инфекции. В работе использованы клеточные культуры МсСоу и L929, полученные из института Цитологии РАН.

Схема постановки опыта.

Клетки выращивали во флаконах из нейтрального стекла в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Опыт ставили в стеклянных (лишенных токсичности) плоскодонных флаконах с покровными стеклами. Клетки вносили в среду в конечной концентрации 1•10 кл/мл. После получения монослоя в пробирки вносили стандартные заражающие дозы хламидий, хранящиеся в замороженном состоянии при -70^oС. Одновременно к клеткам добавляли испытуемое вещество в конечной концентрации 100 мг/л. Пробу центрифугировали при 2400 g в течение 60 минут при комнатной температуре и инкубировали при 37^oС в течение 2 часов. После этого меняли питательную среду на новую, содержащую 5% эмбриональной телячей сыворотки и циклогексимид (2 мкг/мл) с повторным внесением заявляенных веществ в той же концентрации. Параллельно дублировали пробы, используя среду без циклогексемида, чтобы исключить его влияние на изучаемые субстанции. Пробы инкубировали в течение 48 часов в СO₂ - инкубаторе.

Контроли включали: контроль культур клеток, контроль действия растворителей, контроль действия хламидий в отсутствие каких бы то ни было препаратов, контроль чувствительности хламидий к стандартному антимикробному препарату - ципрофлоксацину [15], контроль испытуемых веществ на токсичность по отношению к культурам клеток. Оценку результатов проводили путем выявления хламидийных цитоплазматических включение с помощью метода иммунофлюоресценции (MicroTrac Chlamydia trachomatis Direct Specimen Test) и хламидийных антигенов с помощью CylaMonoScreen (Russian-British Joint Venture 66 Regent's Pare Road London NW1 7SX) [27, 28]. Эффект действия вещества определяли, анализируя состояние монослоя и число клеток с ЦПВ по сравнению с контролем (культура клеток, зараженная С. trachomatis D323), при этом учитывали число неизмененных клеток в 100 полях зрения, полученных при использовании специальной сетки окуляра микроскопа.

Результаты контрольных проб, удовлетворяющие требованиям эксперимента: контроль культуры клеток - морфология клеток и состояние монослоя - соответствуют данному типу клеток, контроль роста хламидий в культуре клеток - наличие ЦПВ в монослое, контроль действия стандартного антимикробного вещества - уменьшение числа ЦПВ в монослое по сравнению с предыдущим контролем, контроль токсичности заявленных веществ - токсичность отсутствует, контроль действия растворителей - токсическое действие на клетки отсутствует. Результаты проведенных испытаний представлены в Таблице 10.

Полученные данные свидетельствуют, что заявленные вещества, приведенные в Таблице 10, обладают выраженной активностью против хламидий, превосходящей таковую у стандартного препарата - ципрофлоксацина. Остальные заявленные вещества обладают менее выраженной активностью по защите клеток от хламидий в выбранных условиях эксперимента.

Кроме вышеперечисленых, у заявляемых веществ были выявлены и другие биологические активности, в частности антиагрегационная, антиатеросклеротическая, психостимулиующая, психодепрессивная, противосудорожная, анальгизирующая, гипогликемическая, противоязвенная, гепопротекторная и антиоксидантная. Приведенные ниже результаты экспериментов подтверждают это утверждение.

Эксперимент 6. Определение антиагрегационных свойств заявленных веществ.

Агрегацию тромбоцитов человека исследовали в обогащенной тромбоцитами плазме здоровых доноров 50±3 лет с помощью агрегометра ФРМ-1. Исследуемую субстанцию добавляли к образцам плазмы крови (100 мкг/мл) перед индуцированном агрегации с помощью аденозиндифосфата (2,5 мкмоль/л). Амплитуду максимальной необратимой агрегации тромбоцитов в контрольных пробах (растворитель) принимали за 100%, а в опытных - рассчитывали в процентах от контроля. Ингибирование агрегации более, чем на 50% при данной концентрации оценивали как значимую. В качестве препаратов сравнения использовали аденозин (5 мкг/мл) и аспирин (9 мкг/мл), ингибирующих агрегацию при этих концентрациях на 100%.

Эксперимент 7. Определение антиатеросклеротических свойств заявленных веществ.

Исследовали влияние субстанции (400 нг/мл) на синтез холестерина фибробластами человека. К культуре фибробластов добавляли испытуемое соединение, после часовой инкубации в среду вносили 2-14-С-ацетат и инкубировали 4 часа. После промывки монослоя из клеток экстрагировали липиды смесью гексан - изопропанол (3:2). Экстракты высушивали в токе азота и разделяли с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе петролейный эфир - диэтиловый эфир - ледяная уксусная кислота (90:10:1). Пятно, соответствующее холестерину, удаляли с пластины в пиалу, заливали сцинтилляционной жидкостью и определяли радиоактивность в имп/мин•мг белка. В качестве препарата сравнения использовали ловастатин в той же концентрации, что и испытуемый препарат.

Эксперимент 8. Определение психостимулирующей активности заявленных веществ.

В опытах на мышах оценивали 10 симптомов, указывающих на возможность психостимуляции. Отсутствие симптома обозначали как "0". Максимальный эффект оценивали в 30 баллов (1 x 10 x 3 мыши). Значимым признавали результат более 12 баллов. Испытуемые соединения вводили перорально в дозе 300 мг/кг. Активность животных оценивали до и через 1 час после введения соединения. В качестве препарата сравнения выбран апомоофин.

Эксперимент 9. Определение психодепрессивной активности заявленных веществ.

В опытах на мышах оценивали 10 параметров, указывающих на возможное развитие депрессии поведения. Каждый параметр оценивали в 2 балла для каждой мыши с неизмененным поведением. Общая сумма баллов составляла 60 (2 x 10 x 3 мыши). Уменьшение количества баллов ниже 40 через 1 час после перорального введения препарата (300 мг/кг) указывало на значимую депрессию поведения. В качестве препарата сравнения использовали галоперидол.

Эксперимент 10. Оценка анальгезирующей активности заявленных веществ.

В группе из 3 мышей оценивали время, необходимое для отдергивания хвоста, помещенного под направленный источник теплового излучения. Удлинение времени реакции более чем на 50% после внутрибрюшинного введения препарата (30 мг/кг) указывало на наличие анальгезирующей активности. В качестве препарата сравнения использовали морфина сульфат (2 мг/кг).

Эксперимент 11. Оценка гипогликемического действия заявленных веществ.

Мышам, взятым натощак, перорально вводили испытуемое соединение (100 мг/кг) и сразу после этого подкожно вводили раствор глюкозы (1000 мг/кг). Через 1 час определяли уровень глюкозы в крови орто-толуидиновым методом. Уменьшение уровня глюкозы более чем на 20% по сравнению с группой контроля свидетельствовало о наличии гипогликемических свойств. В качестве препарата сравнения использовали глибенкламид (1 мг/кг). Результаты эксперимента - в Таблице 16.

Эксперимент 12. Определение противоязвенного действия заявленных веществ.

Противоязвенную активность препаратов испытывали на модели водно-иммерсионного иммобилизационного стресса. Исследуемые вещества вводили перорально 3 крысам, взятым натощак, в дозе 20 мг/кг за 30 минут до иммобилизации и погружения их в резервуар с водой (24^oС) до уровня мечевидного отростка на 4 часа. После этого исследовали слизистую оболочку желудка, подсчитывали количество, размер язв, определяли индекс изъязвления (среднюю сумму длины язв, приходящуюся на одно животное в группе). В качестве препарата сравнения использовали хлорпромазин в дозе 20 мг/кг. Значимым признавалось уменьшение индекса изъязвления более 50% при отсутствии гиперемии слизистой оболочки желудка. Результаты эксперимента - в Таблице 17.

Эксперимент 13. Определение гепатопротекторной активности заявленных веществ.

Крысам подкожно вводили 50%-ный раствор СС1₄ на оливковом масле (1 мл/кг). Исследуемые вещества применяли перорально в дозе 20 мг/кг за 30 минут до и через 7 часов после введения CCl₄. Через сутки в крови животных определяли активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) - маркерного фермента повреждения печеночной паренхимы. Уменьшение ферментемии более 30% по сравнению с группой контроля расценивали как наличие гепатопротекторных свойств препарата. В качестве препарата сравнения использовали силумарин в дозе 100 мг/кг. Результаты эксперимента - в Таблице 18.

Эксперимент 14. Определение антиоксидантного действия заявленных веществ.

Для оценки общей антиоксидантной активности использовали метод хемилюминисценции рибофлавина. Испытуемое соединение вносили в систему, состоящую из фосфатного буфера (рН 9,1), раствора рибофлавина и раствора двухвалентного сернокислого железа. Хемилюминисценцию инициировали 0,1%-ным раствором перекиси водорода и регистрировали ее с помощью люминометра. Определяли концентрацию препаратов, подавляющую хемилюминисценцию на 50%. В качестве препарата сравнения использовали аскорбиновую кислоту. Результаты опытов - в Таблице 19.

Промышленная применимость.

Примеры 1-3 и результаты практического синтеза и анализа заявленных веществ, приведенные в таблицах 1-5, подтверждают возможность лабораторного и промышленного синтеза всех сорока девяти заявленных веществ средствами, освоенными современной фармацевтической промышленностью, а также их четкую идентификацию общепринятыми методами контроля. Серия экспериментов по определению биологической активности, приведенная в отчетах о четырнадцати комплексных экспериментах (Таблицы 6-19), показывает что заявленные вещества обладают биологической активностью по отношению к различным микроорганизмам, включая микобактерии, хламидии, вирус простого герпеса, а также интерферониндуцирующей, антиагрегационной, антиатеросклеротической, психостимулирующей, психодепрессивной, анальгезирующей, гипогликемической, противоязвенной, гепатопротекторной и антиоксидантной активностями. Последнее указывает на возможность их использования в лечении различных вирусных инфекций и некоторых раковых заболеваний. Кроме того, ряд экспериментов показал, что заявленные вещества обладают и другими видами биологической активности, указывающими на их возможное использование при диабете, болевом синдроме, инфаркте миокарда и других заболеваниях.

Приведенные факты доказывают достижение задач, поставленных изобретением: синтезирована группа новых химических веществ - производных 5-оксииминобарбитуровой кислоты, обладающих высокой и широкой биологической активностью, в частности антибактериальной (возбудители туберкулеза и микобактериозов), иммуностимулирующей, противохламидийной, противовирусной, противотуберкулезной, антиагрегационной, психостимулирующей, психодепрессивной, антиоксидантной, анальгезирующей, гипогликемической, антиатеросклеротической, противоязвенной и гепатопротекторной.

Таким образом, по нашему мнению, заявленные вещества удовлетворяют всем требованиям, предъявляемым к изобретению: они новы, неочевидны и промышленно применимы.

Источники информации
1. Pharmaceutical microbiology. Ed. by W.B.Hugo and A.D.Russel Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1987, 511 p.

2. Saltzmann R., Jurewicz R., Boon B, Safety of famciclovir in patients with herpes zoster and genital gerpes, Antimicrobial agents and Chemotheraphy, 1994, vol.38, N. 10, p.2454-2457.

3. Машковский М. Д. Лекарственные средства. Часть II - М.: Медицина, 1993. - 688 с.

4. Заявка РФ РСТ/RU 95/00079 (WO 96/07423, опубл.14.03.96).

Иммуномодулирующее лекарственное средство, авторы-заявители О.Травкин и Д.Генкин.

5. Negwer M. Organic-chemical drugs and their synonims, Academic-Verlag, Berlin, 1987.

6. Bojarski J.T., Mockrosz J.L., Barton H.J., Paluchowska M.H. Advances in Het. Chem., Ed. by A.R.Katritzky, 1985, v.38, p. 229-297.

7. Спасов А. В., Райков З.Д. Авт.свид.Болгарии N. 17122, м. кл. C 07 D 51/22, заял.05.06.71.

8. Ueda T. , Kato S. , патент Японии 11832 (1962), Aug. 23, заяв. 10.05.1958.

9. Misra V.S., Khan M.A., Srivastava N., Verma H.N. Current Science. v. 55, N, 23, p.1167-1171.

10. Krepelka j., Kotva R., Pijman V., Semonsky M. Патенты Чехословакии N 215554; 215593; 215580, м.кл. C 07 D 239/54 от 15.04.1984.

11. Ukita C. Патент Японии 1445 (1964) Feb. 14, заяв.11.02.1960.

12. Biswas C. Dissert. Abstracts 1964, vol.24, N.9, p.3501.

13. Langley B.W. Патент Великобритании N. 845378 от 24.08.60.

14. Eiden F., Kucklaender U. Ger. Offen 1.944.419 (C1 C07 D, A61k), 11 mar 1991, Appl. 02 Sep. 1969.

15. Blythin D.J., Coldwell N.J. Patent US No 4272535, publ. 09.07.1981 (appl. 27.07.79).

16. Hantzsch A. , Isherwood P.C., Chem. Berichte, 1909, B.42, S. 986-1000.

17. Ziegler M., Glemser O. Microchim. Acta, 1956, 10, s.1515-1517.

18. Ligten J.W., Velthuyzen H., Microchim. Acta, 1964, 5, s.759-763.

19. Бурбелло А.Т. Автореф.дисс. на соиск. уч. степени д.м.н. 1992, 40 с.

20. Бурбелло Ф.Т., Денисенко П.П., Слесарев В.И., Сафонова А.Ф., Краснов К.А., Баскович Г.А., Авт. свид.СССР N 4774701, приоритет 15.01.1989.

21. Шугалей И.В., Целинский И.В., Краснов К.А., Седельникова Н.А., журн. Общая химия, 1993, Т.63, Вып.7, С.1649-1650.

22. Fischer E., Diltey A., Lieb. Annalen, 1904, B.335, S.334-368.

23. Senda S., Fujimura H., Izumi M. Патент Японии 29.856('64), Dec. 22, заявл. Oct.05.1961 (4 pp).

24. Вишнякова Т.И., Голубева И.А., Глебова Е.В. Усп. Химии, 1986, T.LIV, C.429-449.

25. Irwin S., Psychopharmacology, 1968, 13, 222-257.

26. Gentry G.A., Lawrency N., Lushbaugh N. Isolation and differentiation of Herpes simplex virus and Trichomoonas vaginalis in cell culturre, J. of Clinical Microbiology 1985, vol.22, 2, p.199-204.

27. Wang S-P. , Grayston J.T. Serotypiong of Clamydia trachomatis by inderect fluoresceent-antibody staining of inclusions in cell culture with monoclonal antibodies. J. of Clinical Microbiology, 1991, vol.29, 7, p. 1295-1298.

28. Judson B. A., Lambert P.P. Improved Syva Micro Trac Clamydia trachomatis direct test method, Journal of Clinical Microbiology, 1988, vol.26, 12, p.2657-2658.

29. R.Chosh & B.r.Singh Protor Donor-Acceptor Equilibria in Solution..., Indian Jornal of Chemisrty, vol.21A, January 1982, p.20-22
30. GARCIA-ESPANA, MARIA-JESUS BALESTER et al., J.CHEM.SOC., DALTON TRANS., 1988, p.101-103.

31. SANDRO GHISLA and STEPHEN G.MAYHEW, Eur.J.Biochem.63, 1976, p.373-390.

32. Авторское свидетельство СССр N 1380611 от 07.03.1988 (автор - Сапос С.А.)1

Формула изобретения

1. N-Замещенные производные 5-оксииминобарбитуровой (виолуровой) кислоты общей формулы (1)

где Х - атом кислорода или серы;
R1- выбран из группы: насыщенный алкан с числом атомов углерода 2-10 (за исключением н-гексила); ненасыщенный алкан с числом атомов водорода 2-10; циклоалкан; арилалкан (за исключением бензила) и арил, которые могут иметь 1-3 заместителя;
R2 - атом водорода или выбран из группы: насыщенный алкан с числом атомов углерода 1-10 или ненасыщенный алкан с числом атомов углерода 2-10; циклоалкан; арилалкан; арил (за исключением фенила),
обладающие антимикобактериальной (возбудители туберкулеза и микобактериозов), иммуностимулирующей, противохламидийной, противовирусной, противотуберкулезной, антиагрегационной, психостимулирующей, психодепрессивной, антиоксидантной, анальгезирующей, гипогликемической, антиатеросклеротической, противоязвенной и гепатопротекторной активностями.

2. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=O, Rl=n-Bu, R2=H (II).

3. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=O, R1=t-Bu, R2=H (III).

4. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=i-C₆H₁₃, R2=Н (V).

5. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=n-С₇Н₁₅, R2=Н (VI).

6. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=n-С₁₀-Н₂₁, R2=H (VII).

7. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=cyclohexyl, R2=Н (VIII).

8. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=O, R1=allyl, R2=H (IX).

9. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=2-(1-cyclohexenylethyl), R2=Н (X).

10. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=p-FC₆H₄CH₂, R2=Н (XII).

11. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=р-(СН₃О)С₆Н₄СН₂, R2=Н (XIII).

12. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=PhCH₂CH₂, R2=Н (XIV).

13. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=р-FС₆Н₄СН₂СН₂, R2=Н (XV).

14. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=Ph(СН₃)СН, R2=Н (XVI).

15. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=РhСН₂(СН₃)СН, R2=Н (XVII).

16. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=R2=cyclohexyl (XVIII).

17. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=O, R1=Ph, R2=H (XIX).

18. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=о-СН₃С₆Н₄, R2=Н (XX).

19. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=m-СН₃С₆Н₄, R2=Н (XXI).

20. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=р-СН₃С₆H₄, R2=Н (XXII).

21. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=р-ЕtС₆Н₄, R2=H (XXIII).

22. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=2,4,6-(СН₃)₃C₆Н₂, R2=H (XXIV).

23. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=o-FC₆H₄, R2=H (XXV).

24. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=m-FC₆H₄, R2=Н (XXVI).

25. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=O, R1=р-FС₆Н₄, R2=H (XXVII).

26. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=O, R1=р-СlС₆Н₄, R2=H (XXVIII).

27. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=р-ВrС₆Н₄, R2=Н (XXIX).

28. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=O, R1=p-(EtO)C₆H₄, R2=H (XXX).

29. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=O, R1=2,5-(СН₃О)₂С₆Н₃, R2=Н (XXXI).

30. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=m-(СF₃)С₆Н₄, R2=H (XXXII).

31. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=O, R1=р-(ЕtOОС)С₆Н₄, R2=H (XXXIII).

32. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1 = α-naphthyl, R2=Н (XXXIV).

33. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=О, R1=p-EtC₆H₄, R2=СН₃ (XXXV).

34. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R1=Et, R2=H (XXXVI).

35. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=S, R1=i-С₆Н₁₃, R2=Н (XXXVII).

36. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R1=cyclohexylR, R2=Н (XXXVIII).

37. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R1=allyl, R2=H (XXXIX).

38. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=S, R1=R2=Et (XLI).

39. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R1=о-СН₃С₆Н₄, R2=H (XLII).

40. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R1=р-СН₃C₆H₄, R2=H (XLIII).

41. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
Х=S, R1=o-FC₆H₄, R2=Н (XLIV).

42. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R=p-FC₆H₄, R2=H (XLV).

43. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R1=p-ClC₆H₄, R2=H (XLVI).

44. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R1=р-(СН₃О)С₆Н₄, R2=H (XLVII).

45. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R1=Ph, R2=р-(СН₃О)С₆Н₄ (XL VIII).

46. Вещество по п.1, отличающееся тем, что
X=S, R1=R2=р-(СН₃О)С₆Н₄ (L).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21

QZ4A Государственная регистрация изменений в зарегистрированный договор

Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения:
25.05.2010 № РД0064816

Вид договора: лицензионный

Лицо(а), передающее(ие) исключительное право:
Ашкинази Римма Ильинична

Лицо, которому предоставлено право использования:
Общество с ограниченной ответственностью "Вирфарм"

Дата и номер государственной регистрации изменений, внесенных в зарегистрированный договор:
11.03.2011 РД0077753

Изменения:
Срок действия договора определен на срок действия патента.

Дата публикации: 27.04.2011

---