Анти-вич-композиция, содержащая имидазольные производные

 

Анти-ВИЧ- композиция содержит 2-карбамоилокси-метил-5-(3,5-дихлорфенилтио)-4-изопропил-1-(пиридин-4-ил)метил-1Н- имидазол или его фармацевтически приемлемую соль и отличные от него одно или несколько соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, в синергетически эффективном количестве. В качестве соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, используют AZT, ddI, ddC, 3TC, саквинавир и/или фоскарнет. Новая, проявляющая синергизм, комбинация соединений обеспечивает снижение побочных действий, таких как токсичность. Также эффективно ингибируется развитие у вирусов устойчивости к лекарству, что обеспечивает действенное и эффективное лечение СПИДа. 3 с. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 18 табл.

Область техники изобретения Изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим два или более соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью.

Предпосылки создания изобретения СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) широко распространен в мире и является не поддающимся лечению заболеванием, которое вызывается вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Исследование и разработку терапевтических агентов для борьбы с этим заболеванием ведут во всем мире, однако к настоящему времени не получено удовлетворительных результатов. В настоящее время примерами анти-ВИЧ-композиций, которые уже применяются или прошли клинические испытания, служат композиции, основными терапевтическими агентами которых являются нуклеозидные производные, такие как азидодезокситимидин (AZT), дидезоксиинозин (ddI), дидезоксицитидин (ddC), дидезоксидидегидротимидин (d4T), 3'-тиацитидин (3ТС) и т.п.

Однако все эти агенты обладают серьезными побочными действиями, такими как панкреатит, анемия, лейкопения, нейтропения, рвота, афагия, желудочные расстройства, анфема (anthema), бессонница, иллюзии, миоспазм, одышка, дизурия, почечная недостаточность, гипакузия и т.п. При применении этих агентов возникает целый ряд проблем, таких как развитие устойчивости вирусов к лекарству при продолжительном применении и, как следствие, снижение эффективности агентов и т.п.

С целью решения этих проблем в настоящее время для лечения, как правило, применяют несколько анти-ВИЧ-композиций.

В этом случае было обнаружено, что при применении нескольких соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, проявляется синергизм. Примерами синергетических комбинаций являются комбинация 3ТС с соединениями, обладающими анти-ВИЧ-активностью, не являющимися нуклеозидными производными, такими как { [(бензоксазол-2-ил)метил]амино}-5-алкил-6-алкил-2-(1Н)-пиридинон и т.п., описанные в JP-A-7508997, и аналогичная комбинация 3ТС с 11-циклопропил-5,11-дигидро-4-метил-6Н-дипиридо[3,3-b;21,31-е][1,4]диазепин-6-оном, описанная в JP-A-7508998.

При применении соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, отмечены серьезные побочные действия, такие как развитие устойчивости вирусов к лекарству и т. п. Существует необходимость в разработке новых, проявляющих синергизм комбинаций соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, т.е. композиций, содержащих эти соединения в качестве действующих веществ.

Подробное описание изобретения Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что при применении 2-карбамоилоксиметил-5-(3,5-дихлорфенилтио)-4-изопропил-1-(пиридин-4-ил)метил-1H-имидазола (обозначенного далее в настоящем описании как КДИМИ) или его фармацевтически приемлемой соли в сочетании с одним или несколькими соединениями, обладающими анти-ВИЧ-активностью, наблюдается синергизм, что приводит к увеличению анти-ВИЧ-активности каждого из них.

Следовательно, одним из объектов настоящего изобретения является анти-ВИЧ-композиция, содержащая КДИМИ или его фармацевтически приемлемую соль и одно или несколько соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью. Настоящее изобретение также относится к способу лечения или предупреждения СПИДа, который включает введение КДИМИ или его фармацевтически приемлемой соли одновременно или последовательно с одним или несколькими соединениями, обладающими анти-ВИЧ-активностью.

Другим объектом настоящего изобретения является применение КДИМИ или его фармацевтически приемлемой соли и соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, при изготовлении лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения СПИДа. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования размножения ВИЧ в результате контакта вируса ВИЧ с КДИМИ или с его фармацевтически приемлемой солью в сочетании с одним или несколькими соединениями, обладающими анти-ВИЧ-активностью. Настоящее изобретение относится к комбинации КДИМИ или его фармацевтически приемлемой соли с одним или несколькими соединениями, обладающими анти-ВИЧ-активностью.

КДИМИ, применяемый в настоящем изобретении, описан в WO 96/10019, и в описании приведены синтез и анти-ВИЧ-активность соединения.

Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана корреляция между концентрацией соединения, обладающего анти-ВИЧ-активностью, и токсичностью (СС₅₀) в отношении клеток линии СЕМ.

На фиг. 2 показана корреляция между концентрацией соединения, обладающего анти-ВИЧ-активностью, и токсичностью (СС₅₀) в отношении клеток линии U937.

На фиг. 3 показана корреляция между концентрацией соединения, обладающего анти-ВИЧ-активностью, и ингибированием роста (IC₅₀) клеток линии СЕМ.

На фиг. 4 показана корреляция между концентрацией соединения, обладающего анти-ВИЧ-активностью, и ингибированием роста (IС₅₀) клеток линии U937.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения В контексте настоящего описания фармацевтически приемлемые соли КДИМИ включают, например, соли с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, фтористоводородная кислота, бромистоводородная кислота и т.п., соли с органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, винная кислота, молочная кислота, лимонная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, толуолсульфоновая кислота, нафталинсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота и т.п., и соли щелочных металлов или щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, кальций и т.п.

В контексте настоящего изобретения понятие "соединение, обладающее анти-ВИЧ-активностью" обозначает любые соединения, обладающие анти-ВИЧ-активностью, без конкретного ограничения, например антивирусные соединения, обладающие анти-ВИЧ-активностью, такие как ингибитор обратной транскриптазы, являющийся нуклеозидным производным, ингибитор обратной транскриптазы, не являющийся нуклеозидным производным, ингибитор протеазы ВИЧ, ингибитор ДНК-полимеразы и т.п.

В контексте настоящего описания ингибитор обратной транскриптазы, являющийся нуклеозидным производным, включает AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC и т.п., а ингибитор обратной транскриптазы, не являющийся нуклеозидным производным, включает соединения, описанные в WO 96/10019, например, 3-[5-(3,5-дихлорфенилтио)-4-изопропил-1-(пиридин-4-ил)метил-1Н-имидазол-2-ил]пропан-1-ол или 2-[5-(3,5-дихлорфенилтио)-1-этил-4-изопропил-1Н-имидазол-2-ил]этанол и т.п., ингибитор протеазы ВИЧ включает саквинавир, индинавир, ритонавир, нелфинавир, VX-478 и т.п. Другие лекарственные средства, обладающие анти-ВИЧ-активностью, включают, например, фоскарнет, терапевтический агент из цитомегаловируса ринита, обладающий ингибирующей активностью в отношении ДНК-полимеразы и ингибирующей активностью в отношении обратной транскриптазы и т.д. В частности, предпочтительными являются AZT, ddI, ddC, 3TC, саквинавир или фоскарнет вследствие их высокой синергетической анти-ВИЧ-активности при комбинации с КДИМИ. В частности, более предпочтительными являются AZT, ddI, ddC, саквинавир или фоскарнет, а наиболее предпочтительными являются AZT, ddC или саквинавир. Самыми предпочтительными являются AZT и ddC, которые в значительной степени ингибируют развитие у вирусов устойчивости к лекарству.

Анти-ВИЧ-композиция по настоящему изобретению может обеспечить эффективное лечение СПИДа вследствие того, что она обладает синергизмом по сравнению с применением каждого соединения, обладающего анти-ВИЧ-активностью, в качестве единственного агента. Так, в частности, вследствие того, что анти-ВИЧ-композиция по настоящему изобретению обладает синергетической анти-ВИЧ-активностью, что показано в приведенных далее экспериментах, применение более низкой дозы, чем в случае использования каждого соединения, обладающего анти-ВИЧ-активностью, в качестве единственного агента позволяет достичь достаточной анти-ВИЧ-активности, обеспечивая снижение побочных действий, таких как токсичность и т.п. Введение композиции по настоящему изобретению, которая содержит каждое соединение, обладающее анти-ВИЧ-активностью, в количестве, равном дозе при его использовании в качестве единственного агента, эффективно ингибирует развитие у вирусов устойчивости к лекарству и, очевидно, обеспечивает действенное и эффективное лечение.

Таким образом, анти-ВИЧ-композиция по настоящему изобретению представляет собой эффективную фармацевтическую композицию в качестве лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения СПИДа.

Настоящее изобретение отличается синергетическим действием КДИМИ в сочетании с одним или несколькими другими соединениями, обладающими анти-ВИЧ-активностью. Таким образом, каждое действующее вещество может вводиться одновременно в виде композиции. Последовательное введение каждого действующего вещества с такими промежутками времени, при которых сохраняется синергизм, приводит к аналогичному действию.

При применении анти-ВИЧ-композиции по настоящему изобретению безопасным путем введения может быть оральный или парентеральный. Для орального введения ее можно применять в виде обычных препаративных форм, таких как таблетки, гранулы, порошок, капсулы, пилюли, жидкие растворы, сироп, препараты для трансбуккального введения, подъязычные таблетки и т.п. Для парентерального введения ее предпочтительно можно применять в виде любых препаративных форм, например препаратов для инъекций, таких как препараты для внутримышечной инъекции и т.п., в виде суппозитория, чрескожно, в виде ингаляций и т.п., в частности, предпочтительным является оральное введение.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена путем смешения эффективного количества действующих веществ при необходимости с медицинскими вспомогательными веществами, пригодными для конечной применяемой препаративной формы, такими как носители, связующие вещества, смачивающие агенты, разрыхлители, смазывающие вещества, растворители и т.п. Например, препараты для инъекций могут быть получены путем стерилизации с пригодными носителями.

В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве носителей можно упомянуть лактозу, сахарозу, глюкозу, крахмал, карбонат кальция, кристаллическую целлюлозу и т.п., группа связующих веществ включает метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, желатин, поливинилпирролидон и т.п., разрыхлителями могут служить карбоксиметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, крахмал, альгинат натрия, порошкообразный агар, натрийлаурилсульфат и т.п., а к смазывающим веществам относятся тальк, стеарат магния, макрогол и т.п. Основами суппозиториев являются масло какао, макрогол, метилцеллюлоза и т.п. При изготовлении жидких препаратов или эмульсий, либо суспензий для инъекций могут быть добавлены общепринятые солюбилизирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы, консерванты, агенты, регулирующие изотоничность, и другие агенты. Для орального введения могут быть добавлены подслащивающие вещества, корригенты и т.п.

В качестве действующего вещества анти-ВИЧ-композиций по настоящему изобретению КДИМИ может быть объединен с одним или с несколькими другими соединениями, обладающими анти-ВИЧ-активностью.

В случае введения КДИМИ или других соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, в качестве единственного агента применяемая доза каждого действующего вещества обычно составляет от 0,05 мг до 3000 мг в день, предпочтительно от 0,1 мг до 1000 мг в день, при парентеральном введении - от 0,01 мг до 1000 мг в день, предпочтительно от 0,05 мг до 500 мг в день.

В случае введения анти-ВИЧ-композиции по настоящему изобретению доза каждого действующего вещества в препаративной форме должна быть определена с учетом возраста пациента и веса тела, состояния болезней, пути введения и т. п. Однако количество каждого действующего вещества в композиции может составлять 0,1-1 по отношению к вышеуказанной применяемой дозе каждого из соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, когда они применяются в виде единственного агента.

Таким образом, в случае введения КДИМИ и других соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, совместно в виде анти-ВИЧ-композиции по настоящему изобретению доза каждого действующего вещества может составлять при оральном введении 0,005-3000 мг/день, предпочтительно 0,01-1000 мг/день, при парентеральном введении - 0,001-1000 мг/день, предпочтительно 0,005-500 мг/день. Композиция может применяться один раз в день или несколько раз в день в виде разделенных доз.

Пример Описание приведенных ниже примеров и экспериментов по настоящему изобретению служит для дополнительной более подробной иллюстрации изобретения и не направлено на ограничение его объема.

Эксперимент 1: Синергетическая анти-ВИЧ-активность Клетки линии Molt-4 человеческих Т-клеток, персистентно зараженные ВИЧ-1 (клон 2 штамма IIIB), культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой, и супернатант отфильтровывали и после определения титра вируса хранили при -80^oС.

Готовили серию двукратных разбавлении КДИМИ с концентрациями от 10 нг/мл до 0,157 нг/мл и 0 нг/мл и серию двукратных разбавлении AZT с концентрациями от 100 нг/мл до 0,4 нг/мл и 0 нг/мл. Комбинацию этих двух лекарств готовили методом "шахматной доски" с использованием 96-луночных микропланшетов. 50 мкл вышеуказанной среды, содержащей 10⁵ клеток МТ-4/мл добавляли в каждую лунку 96-луночных микропланшетов и в каждую лунку добавляли 50 мкл AZT, разбавленного в два раза такой же средой. Через 4 ч в каждую лунку добавляли 50 мкл супернатанта культуры вышеуказанного клона 2 штамма ВИЧ-1 IIIB, в это же время добавляли также 50 мкл разбавленного в 2 раза КДИМИ, а затем инкубировали в 5%-ном СО₂ в термостате при 37^oС в течение 5 дней.

Титры вируса в супернатанте культуры подсчитывали, используя в качестве показателя активность обратной транскриптазы вируса, которую определяли следующим методом: К 100 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ трис-HCl, рН 8,3, 150 мМ КСl, 10 мМ MgCl₂, 0,1% Nonidet Р-40, 10 мМ дитиотреитол, 5 мкг/л поли(А), 5 мкг/мл (dT)_12-18 и 1 мкКи [³Н]-дТТФ, добавляли 10 мкл супернатанта культуры и инкубировали при 37^oС в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждали на льду и переносили с помощью харвестера клеток на фильтр типа DEAE-Filtermat. Фильтр промывали 5%-ным Na₂HPO₄•12 H₂O и водой, и радиоактивность, включенную в ДНК, определяли с помощью сцинтилляционного счетчика типа LKB Beta Plate, определяя активность обратной транскриптазы вируса.

Было проведено три анализа и было подсчитано среднее значение степени ингибирования (%) обратной транскриптазы при сравнении с ферментативной активностью в отсутствие КДИМИ и AZT. Результаты приведены в таблице 1.

Исходя из предположения, что ингибирующее действие двух соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, было аддитивным, рассчитывали степень ингибирования роста вируса при всех комбинациях концентраций по формуле (I) Z=X+Y(1-X), (I)
где Z обозначает степень ингибирования при аддитивном действии, Х обозначает степень ингибирования при использовании КДИМИ и Y обозначает степень ингибирования при использовании другого соединения, обладающего анти-ВИЧ-активностью. Например, для варианта, когда концентрация КДИМИ составляла 5 нг/мл, a AZT - 0,8 нг/мл, из таблицы 1 видно, что значение Х составляет 99,65%, если концентрация КДИМИ составляет 5 нг/мл, а концентрация AZT - 0 нг/мл, значение Х составляет 99,63% и значение Y составляет 43,43%, если концентрация КДИМИ составляет 0 нг/мл, а концентрация AZT - 0,8 нг/мл. Тогда степень ингибирования при аддитивном действии Z согласно формуле (I) составляет 99,79%.

Затем, как указано выше, рассчитывали разницу между измеренными значениями, приведенными в таблице 1, и рассчитанной степенью ингибирования при аддитивном действии. Результаты приведены в таблице 2, а значение доверительных пределов при уровне вероятности 99% приведены в таблице 3.

Когда измеренное значение больше, чем степень ингибирования при аддитивном действии, а именно значение в таблице 3 больше 0, считается, что имеет место синергизм. Коэффициент синергизма определяют как общую сумму значений, превышающих 0, в таблице 3.

Согласно этому же методу проводили анализ данных, полученных с использованием ddI, ddC, саквинавира и фоскарнета вместо AZT.

Добавление к клеткам саквинавира и фоскарнета проводили в то же время, что и КДИМИ, при заражении вирусом. Для комбинации с ddC, ddI и саквинавиром концентрации КДИМИ находились в диапазоне от 5 нг/мл до 0,08 нг/мл при двукратном разбавлении и 0 нг/мл, а концентрации ddC, ddI, саквинавира и фоскарнета находились в диапазоне от 500 нг/мл до 2 нг/мл при двукратном разбавлении и 0 нг/мл.

Анализ результатов приведен ниже. В таблицах 4-6 приведены результаты при использовании ddI, в таблицах 7-9 приведены результаты при использовании ddC, в таблицах 10-12 приведены результаты при использовании саквинавира и в таблицах 13-15 приведены результаты при использовании фоскарнета.

Анализ всех данных проводили с помощью программного обеспечения Маc Synergy II (Prichard M. N. и Shipman С. Jr., Antiviral Res. 14: 181-206, 1990). В соответствии с руководством коэффициент синергизма оценивали следующим образом: если коэффициент синергизма составляет 25-50, то синергизм является невысоким, но выраженным (+), если коэффициент синергизма составляет 50-100, то синергизм является выраженным (++), и если коэффициент синергизма больше 100, то синергизм является очень высоким (+++).

Коэффициенты синергизма с доверительными пределами при уровне вероятности 99% и результаты оценки приведены в таблице 16.

Из таблицы 16 виден очень высокий синергизм КДИМИ в комбинации с другими соединениями, обладающими анти-ВИЧ-активностью.

Эксперимент 2: Цитотоксичность и ингибирование роста клеток
Для оценки цитотоксичности и тестирования ингибирования роста клеток использовали 96-луночные плоскодонные микропланшеты. Готовили серию двукратных разбавлений КДИМИ с концентрациями от 50 мкг/мл до 0,78 мкг/мл и 0 мкг/мл и серию двукратных разбавлений AZT с концентрациями от 200 мкг/мл до 0,18 мкг/мл и 0 нг/мл и два лекарства объединяли методом "шахматной доски".

Оценка цитотоксичности
Клетки линии СЕМ или клетки линии U937 культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой. Клетки добавляли в каждую лунку 96-луночного плоскодонного микропланшета из расчета 1х10⁴ клеток на лунку, и в каждую лунку добавляли КДИМИ и AZT, разбавленные этой же средой, согласно описанному ранее методу. Планшеты инкубировали в термостате с 5%-ным СО₂ при 37^oС в течение 3 дней и во все лунки добавляли 5 мг/мл МТТ (бромид 3-{4,5-диметилтиазол-2-ил}-2,5-дифенилтетразолия) и 30 мкл ЗФР и инкубировали в течение 1 ч. В процессе этой инкубации выжившие клетки восстанавливали МТТ с получением нерастворимого формазана. Из всех лунок отбирали 150 мкл супернатанта культуры и затем добавляли 150 мкл раствора (изопропанол, содержащий 10%-ный тритон Х-100 и 0,4%-ную НС1). Формазан растворяли путем встряхивания и измеряли оптическую плотность при длине волны 560 нм (ОП₅₆₀), используя в качестве стандарта ОП₆₉₀. Определяли концентрацию, вызывающую 50%-ную цитотоксичность (СС₅₀), эти результаты представлены графически на фиг. 1 и 2. На фиг. 1 представлен результат с использованием клеток линии СЕМ, а на фиг. 2 представлен результат с использованием клеток линии U937.

Оценка ингибирования роста клеток
Клетки линии СЕМ или клетки линии U937 культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой. Клетки добавляли в каждую лунку 96-луночного плоскодонного микропланшета из расчета 1х10⁴ клеток на лунку, и в каждую лунку добавляли КДИМИ и AZT, разбавленные этой же средой, согласно описанному ранее методу. Планшеты инкубировали в термостате с 5%-ным СО₂ при 37^oС в течение 5 ч и в каждую лунку добавляли 0,2 мкКи [³Н]-тимидина и инкубировали в течение 24 ч. Клетки собирали с помощью харвестера клеток на фильтр типа DEAE. Радиоактивность, включенную в клетки, измеряли с помощью сцинтилляционного счетчика типа Beta Plate для определения роста клеток. Рассчитывали концентрацию, вызывающую 50%-ное ингибирование поглощения [³Н]-тимидина (IC₅₀), эти результаты представлены графически на фиг. 3 и 4. На фиг. 3 представлен результат с использованием клеток линии СЕМ, а на фиг. 4 представлен результат с использованием клеток линии U937.

Из фиг. 1-4 видно, что комбинация КДИМИ с AZT не обладает синергизмом как в отношении цитотоксичности, так и в отношении ингибирования роста клеток.

Эксперимент 3: Подавление возникновения вариантов, устойчивых к лекарствам
Клетки линии Molt-4 человеческих Т-клеток, персистентно зараженные ВИЧ-1 (клон 3 штамма IIIB), культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой, супернатант отфильтровывали и после определения титра вируса хранили при -80^oС.

1 мл вышеуказанной среды, содержащей 10⁶ клеток линии М 8166, вносили в каждую лунку 12-луночных планшетов, добавляли 100 мкл вышеуказанного клона 3 штамма ВИЧ-1 IIIB и инкубировали в течение 2 ч для заражения вирусом. Клетки промывали вышеуказанной средой и в каждую лунку добавляли 4 мл среды, содержащей CDIMI или других соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, по отдельности или в комбинации, и инкубировали в термостате с 5%-ным СО₂ при 37^oС. CDIMI добавляли в концентрации 1 нг/мл, a ddC добавляли в концентрации 50 нг/мл соответственно, и такие же концентрации этих соединений использовали в их комбинации. Клетки пересевали два раза в неделю и, если наблюдали рост вируса, концентрацию лекарства увеличивали в два раза. В случае, когда не наблюдали роста вируса, концентрацию соединения, обладающего анти-ВИЧ-активностью, поддерживали на таком же уровне, который был в последней культуре.

Титр вируса определяли нижеприведенным методом, используя в качестве маркера активность обратной транскриптазы.

К 100 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ трис-HCl, рН 8,3, 150 мМ КСl, 10 мМ MgCl₂, 0,1% Nonidet P-40, 10 мМ динитротреитол, 5 мкг/л поли(А), 5 мкг/мл (dT)_12-18 и 1 мкКи [³H]-дТТФ, добавляли 10 мкл супернатанта культуры и инкубировали при 37^oС в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждали на льду и переносили с помощью харвестера клеток на фильтр типа DEAE-Filtermat. Фильтр промывали 5%-ным Nа₂НРО₄•12 H₂O и водой, и радиоактивность, включенную в ДНК, измеряли с помощью сцинтилляционного счетчика типа LKB Beta Plate, определяя активность обратной транскриптазы вируса.

Если наблюдали рост вирусов, вирусы выделяли и с помощью обычного метода определяли чувствительность к каждому действующему веществу. Результаты приведены в таблице 17.

Из таблицы 17 видно, что при использовании комбинации ddC и КДИМИ не наблюдали возникновения устойчивого варианта.

Эксперимент 4: Изменение чувствительности вируса к лекарствам путем комбинации мутаций устойчивости к лекарствам
Индуцировали мутации in vitro в молекулах кДНК клона ВИЧ NL432, получали различные мутантные клоны гена обратной транскриптазы, для которых известно, что они обусловливают устойчивость к КДИМИ или к AZT. Мутантными клонами кДНК трансфектировали клетки линии SW480. Полученными мутантными вирусами заражали клетки линии МТ-4 в присутствии лекарства, аналогично тому, как описано в эксперименте 1. Через 4 дня определяли рост вируса, используя в качестве маркера активность обратной транскриптазы. Определяли концентрации, вызывающие 50%-ное ингибирование роста вирусов (ЕС₅₀) и 90%-ное ингибирование роста вирусов (ЕС₉₀). Результаты приведены в таблице 18.

Штаммы Y181C, F227C, L234I и V106A плюс F227L, обладающие устойчивостью к КДИМИ, оказались чувствительными к AZT. И наоборот, чувствительность к КДИМИ устойчивых к AZT клонов штаммов D67N плюс K70R и T215Y оказалась равной чувствительности дикого штамма. Отсюда ясно, что КДИМИ и AZT не вызывают перекрестной устойчивости.

Уровень чувствительности штамма T215Y плюс L234I, имеющего как обусловливающую устойчивость к AZT мутацию T215Y, так и обусловливающую устойчивость к КДИМИ мутацию L234I, и к КДИМИ, и к AZT оказался близким к уровню чувствительности дикого штамма, что свидетельствует о переходе от устойчивости к чувствительности. Это результат, полученный in vitro, показывает, что у зараженных пациентов, которым одновременно вводят КДИМИ и AZT, маловероятно возникновение вариантов, устойчивых и к КДИМИ, и к AZT.

Препаративная форма 1: Гранулы
Гранулы изготавливали путем однородного смешения всех нижеприведенных ингредиентов, грануляции в псевдоожиженном слое, сушки и фильтрации.

КДИМИ - 20 мг
AZT - 25 мг
Крахмал - 15 мг
Дактоза - 16 мг
Кристаллическая целлюлоза - 21 мг
Поливиниловый спирт - 3 мг
Вода - 30 мг
Всего: - 130 мг
Препаративная форма 2: Капсулы
Капсулы изготавливали путем однородного смешения всех нижеприведенных ингредиентов и заполнения смесью желатиновых капсул.

КДИМИ - 35 мг
ddI - 55 мг
Лактоза - 96 мг
Натрийгликолят крахмала - 13 мг
Стеарат магния - 1 мг
Всего: - 200 мг
Препаративная форма 3: Таблетки
Таблетки массой 200 мг изготавливали путем однородного смешения всех нижеприведенных ингредиентов, кроме стеарата магния, и грануляции с последующим добавлением стеарата магния.

КДИМИ - 7 мг
ddC - 10 мг
Лактоза - 100 мг
Кристаллическая целлюлоза - 75 мг
Тальк - 5 мг
Карбоксиметилцеллюлоза - 2 мг
Стеарат магния - 1 мг
Всего: - 200 мг
Промышленная применимость изобретения
Как следует из приведенных выше экспериментов, анти-ВИЧ-композиция по настоящему изобретению по сравнению с введением каждого из соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, по отдельности обладает выраженным синергизмом в отношении активности, но не проявляет синергизма в отношении цитотоксичности. Следовательно, композиция представляет собой эффективную фармацевтическую композицию, предназначенную для лечения и предупреждения СПИДа.

Формула изобретения

1. Анти-ВИЧ-композиция, содержащая 2-карбамоилоксиметил-5-(3,5-дихлорфенилтио)-4-изопропил-1-(пиридин-4-ил)метил-1Н-имидазол или его фармацевтически приемлемую соль и отличные от него одно или несколько соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, в эффективном количестве.

2. Анти-ВИЧ-композиция по п. 1, в которой соединения, обладающие анти-ВИЧ-активностью, проявляют синергизм в комбинации с 2-карбамоилоксиметил-5-(3,5-дихлорфенилтио)-4-изопропил-1-(пиридин-4-ил)метил-1Н-имидазолом или с его фармацевтически приемлемой солью.

3. Анти-ВИЧ-композиция по п. 1, в которой соединения, обладающие анти-ВИЧ-активностью, в комбинации с 2-карбамоилоксиметил-5-(3,5-дихлорфенилтио)-4-изопропил-1-(пиридин-4-ил)метил-1Н-имидазолом или с его фармацевтически приемлемой солью ингибируют возникновение устойчивости к лекарствам у вирусов.

4. Анти-ВИЧ-композиция по п. 1, в которой соединения, обладающие анти-ВИЧ-активностью, представляют собой ангибитор обратной трансферазы, являющийся нуклеозидным производным, ингибитор обратной трансферазы, не являющийся нуклеозидным производным, и/или ингибитор протеазы ВИЧ.

5. Анти-ВИЧ-композиция по п. 1 или 2, в которой соединения, обладающие анти-ВИЧ-активностью, представляют собой AZT, ddI, ddC, 3TC, саквинавир и/или фоскарнет.

6. Способ лечения и предупреждения СПИДа, включающий введение синергетически эффективного количества, одновременно или последовательно, 2-карбамоилоксиметил-5-(3,5-дихлорфенилтио)-4-изопропил-1-(пиридин-4-ил)метил-1Н-имидазола или его фармацевтически приемлемой соли и отличных от него одного или нескольких соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью.

7. Комбинация, содержащая 2-карбамоилоксиметил-5-(3,5-дихлорфенилтио)-4-изопропил-1-(пиридин-4-ил)метил-1Н-имидазол или его фармацевтически приемлемую соль и отличные от него одно или несколько соединений, обладающих анти-ВИЧ-активностью, в синергетически эффективном количестве, предназначенная для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения СПИДа.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22