Способ анализа перемещения веществ маркеров в стекловидном теле в эксперименте

 

Способ может быть использован в медицине, а именно в офтальмологии и микроскопической технике. Окрашенные маркеры с фиксированной молекулярной массой вводят в стекловидное тело in vivo. Анализируют их перемещение через заданные интервалы времени на энуклеированных и свежезамороженных в жидком азоте глазах. Способ позволяет повысить точность анализа. 2 табл., 3 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии.

В последнее время возрос интерес к функциональной организации стекловидного тела (СТ), накоплен фактический материал, изучена анатомия СТ [1]. Установлено наличие в СТ глаза сложных структур, имеющих специфические каналы, люки, по которым может перемещаться жидкость СТ. По вопросу обмена жидкости в СТ имеется много неоднозначных понятий. До настоящего времени нет единого мнения об интенсивности обмена витреальной жидкости и пути оттока ее из глаза.

Известен способ изучения заднего пути оттока жидкости из глаза. Однако в качестве вещества маркера берется крупнодисперсная тушь, диффузные возможности которой в гелевых структурах ограничены, что не дает возможности оценить потоки жидкости в СТ. Существует метод изучения задних путей оттока, включающий в себя введение маркера в СТ, фиксацию глаза в формалине, вскрытие его, приготовление препаратов, срезов, окрашивание их и микроскопирование [3]. Однако этот метод, требующий вскрытия препарата, не позволяет сохранить маркер в несущих его структурах.

Цель изобретения - изучение перемещения веществ маркеров в стекловидном теле глаза.

Поставленную цель достигают за счет того, что окрашенные маркеры с фиксированной молекулярной массой вводят в стекловидное тело in vivo и анализируют их перемещение через заданные интервалы времени на энуклеированных и свежезамороженных в жидком азоте глазах.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве экспериментального животного использовали кроликов породы Советская Шиншилла весом 1,5-3,0 кг, в возрасте от 2 до 4 мес, обоего пола, находящихся в идентичных условиях содержания, без патологии со стороны глаз. После проведенного местного обезболивания через пункцию склеры в заданное место СТ вводят определенное количество вещества маркера. Через фиксированное время производят выведение животного из эксперимента промышленным способом [2] , удаляют исследуемый глаз и для остановки свободной диффузии помещают его в жидкий азот. Замерзший глаз рассекают на микротоме и анализируют характер перемещения вещества маркера в структурах глаза. Регистрацию перемещения веществ маркеров осуществляют путем фотометрического анализа градиентов оптической плотности фотографий срезов глаза, также проводят топографическое изучение зоны распределения вещества маркера в структурах глаза.

В качестве веществ маркеров использовали: 10%-ный раствор флюоресцеина с Mm=360 дальтон; 0,5%-ный раствор метиленового синего с Mm=284 дальтон; раствор родамина желтого с Mm=574 дальтон.

Скорость перемещения вещества маркера в стекловидном теле рассчитывают следующим образом. Срез замороженного глаза фотографировали на черно-белую пленку "ТАСМА 64". Негативы обрабатывались на микрофотометре ИФО-451 в лаборатории "Квантовой физики" кафедры общей физики Красноярского госуниверситета. Концентрацию маркера вычисляли из оптической плотности снимков при помощи специально написанной программы с рабочим названием EYE, разработанной на Delphi 1.03 в ОС Windows 95 на компьютере 486DХ4/100 МГц/16 Mb/SVGA 1 Mb.

Техника интравитреального введения вещества маркера.

Под местной анестезией 0,5% раствором дикаина веки фиксировали блефаростатом, глазное яблоко - фиксационным пинцетом, захватывающим верхнюю прямую мышцу. Пункцию склеры осуществляли по меридиану 12 часов в 5 мм от лимба, используя одноразовые шприцы и иглы. В стекловидное тело инъецировали 0,02 мл вещество маркера, что не оказывало влияния на исходное внутриглазное давление. Техника введения вещества маркера представлена на фиг. 1.

Примененные вещества, маркеры и характеристика экспериментальных групп приведены в табл. 1.

Как видно из представленной таблицы, в различные отделы стекловидного тела вещества маркеры вводили на 40 глазах. Из них флюоресцеин использовали на 16 глазах, на 12 глазах - родамин желтый и метиленовый синий на 12 глазах.

Примеры конкретной реализации предлагаемого способа Пример 1. После местного обезболивания о оба глаза кролика вводят 0,02 мл родамина желтого в центральный отдел стекловидного тела. Через 5 мин животное выводят из эксперимента промышленным способом и через 2 мин глаза энуклеируют и помещают в жидкий азот на 15-20 мин. Затем глаза рассекают на микротоме и проводят топографическое изучение зоны распределения маркера, которое представлено на фиг. 2. Диффузия вещества маркера представляла собой конус, вершина которого соответствовала месту введения маркера, а основание было направлено к заднему отрезку глаза. Скорость перемещения родамина желтого 2,9±0,04 мм/мин.

Пример 2. После местного обезболивания в оба глаза кролика по вышеуказанной методике в центральный отдел стекловидного тела вводят 0,02 мл метиленового синего. Через 5 мин животное выводят из эксперимента промышленным способом и через 2 мин глаза энуклеируют и помещают в жидкий азот на 15 мин. Затем глаз рассекают на микротоме и проводят топографическое излучение зоны распределения маркера, которое представлено на фиг. 3. Диффузия вещества маркера имела вид конуса, вершина которого соответствовала месту введения маркера, а основание было направлено к заднему отрезку глаза. Скорость перемещения метиленового синего 3,4±0,8 мм/мин. Во всех исследуемых случаях наблюдалась идентичная картина распределения вещества маркера независимо от разной молекулярной массы его. Зависимость скорости распределения вещества маркера в стекловидном теле от молекулярной массы представлена в табл. 2.

Из представленной таблицы видно, что чем меньше молекулярная масса вещества маркера, тем быстрее происходит его перемещение через стекловидное тело.

При этом скорость распределения фронта диффузии по шару 0,5 - 0,8 мм/мин, что достоверно меньше, чем скорость перемещения маркера. Это доказывает, что распространение маркера - это однонаправленный отток жидкости, а не просто диффузия маркера в стекловидном теле.

Таким образом, можно говорить о том, что в стекловидном теле существует выраженный ток жидкости, о котором можно судить по перемещению веществ маркеров в нем, которые имеют свою направленность и скорость.

Ииточники информации 1. Махачева З.А. Анатомо-функциональное обследование хирургических вмешательств на стекловидном теле при витреальной диструкции. Автореф. дисс. докт. мед. наук. - М. 1994 - 298 с.

2. Минина И.С., Майоров А.И. Все о кроликах: Альбом. - М.: Агропромиздат, 1988. - 168 с.

3. Авторское свидетельство СССР 1710036, А 61 F 9/00, 1992.

Формула изобретения

Способ анализа перемещения веществ маркеров в стекловидном теле в эксперименте, включающий введение маркеров с последующей регистрацией их в структурах глаза, отличающийся тем, что в качестве веществ маркеров используют 10%-ный раствор флюоресцеина с молекулярной массой Mm= 360 дальтон, или 0,5%-ный раствор метиленового синего с Mm= 284 дальтон, или раствор родамина желтого с Mm= 574 дальтон, в центральный отдел стекловидного тела in vivo вводят 0,02 мл вещества маркера, через 5 мин животное выводят из эксперимента, глаза энуклеируют и помещают в жидкий азот на 15-20 мин, затем глаза рассекают на микротоме и проводят топографическое изучение зоны распределения маркера.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5