Способ определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента c1q

 

Способ может быть использован в области медицины, в частности в иммунологии. Сорбируют в лунках микропанели неспецифический иммуноглобулин G, затем в лунки вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в контрольной серии тестируемое вещество не вносят, после инкубации и удаления жидкого содержимого лунок вносят конъюгат фермента с антителами против субкомпонента С1q человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение количества связавшегося компонента С1q по продукту ферментативной реакции и, сравнивая данные о количестве связавшегося компонента С1q в присутствии определенных концентраций тестируемого вещества и в отсутствии тестируемого вещества, определяют константу ингибирования этим веществом связывания субкомпонента С1q. Способ позволяет повысить точность действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента С1q.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов, в частности к способам определения ингибирующего действия веществ на связывание субкомпонента С1q комплемента активаторами классического пути активации комплемента.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения механизма действия лекарственных веществ, для поиска потенциальных лекарственных веществ, изучения побочного действия лекарственных препаратов и воздействия экологически вредных веществ на организм.

Для определения способности веществ взаимодействовать с субкомпонентом С1q комплемента известен способ, основанный на ингибировании связывания C1q с сенсибилизированными эритроцитами барана, т.е. ингибировании инициации каскада активации комплемента, завершающегося лизисом эритроцитов [1]. Гемолитический метод [2] , используемый в этом способе, не отличается высокой степенью воспроизводимости и связан с необходимостью приготовления гемолитической системы на основе эритроцитов барана. Кроме того, метод требует удаления из системы исследуемого ингибитора после стадии связывания C1q с антителами, поскольку нельзя исключить возможности действия ингибитора на поздних этапах каскада активации, что усложняет процесс определения ингибирующего действия.

Задачей заявленного изобретения является разработка более современного и точного способа, позволяющего определять действие веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента С1q на основе иммуноферментного метода.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем внесение в лунки микропанели сыворотки крови человека в качестве источника субкомпонента С1q, содержащей ряд концентраций тестируемого ингибитора в серии экспериментов, и инкубацию. Для контроля исходной активности субкомпонента C1q проводят эксперимент без ингибитора. Количество сорбированного в лунках субкомпонента C1q определяют по продукту ферментативной реакции с помощью специфических антител против C1q, ковалентно связанных с ферментом. Способ основан на ингибировании исследуемыми веществами способности функционально активного субкомпонента C1q специфически связываться с иммуноглобулином G. Тем самым достигается определение ингибирования субкомпонента C1q комплемента изучаемыми эффекторами иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента C1q на основе иммуноферментного метода, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования таких плохо сохраняемых и трудно стандартизуемых компонентов, какими являются эритроциты.

Пример. Определение действия лизоцима на комплемент (ингибирование связывания субкомпонента С1q комплемента человека). Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрации белка 30 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4oС. Три раза отмывают микропанель фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В другой микропанели с круглодонными лунками готовят серии двукратных разведений свежей сыворотки крови человека (в качестве источника C1q) в фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, общий объем в лунке 50 мкл. Затем во все лунки каждой серии вносят по 50 мкл раствора лизоцима в своей для каждой серии концентрации, а в контроле 50 мкл буфера без ингибитора, содержимое лунок этой микропанели переносят в первую микропанель. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37oС, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против субкомпонента C1q человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37oС и двукратной отмывки с детергентом и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность C1q без ингибитора (лизоцима) и для каждой концентрации ингибитора рассчитывают по стандартной кривой. Константу ингибирования Кi определяют по линейному уравнению 1/z=[I]/(z0Кi)+1/z0, где [I] - конечная концентрация ингибитора в лунках данной серии, z - активность C1q в присутствии ингибитора в данной концентрации, a z0 - активность C1q в отсутствие ингибитора [1], строя график зависимости 1/z от [I]. При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению Кi. Для лизоцима получено значение Кi= 0,460,12 мМ, что близко значению 0,290,09 мМ, полученному ранее гемолитическим методом [I].

Из полученных данных следует, что константы, полученные двумя методами, согласуются между собой, т.е. заявленным способом действительно определяется ингибирование функциональной активности C1q субкомпонента комплемента. Небольшие расхождения в полученных константах могут объяснятся тем, что при определении гемолитическим методом в процесс задействованы все стадии активации комплемента, и о функциональной активности C1q судят по конечной стадии - лизису эритроцитов, при этом на все стадии процесса и на эритроциты могут оказывать влияние исследуемый ингибитор. Определение ингибирования C1q иммуноферментным методом включает только первую стадию каскада активации комплемента.

Источники информации 1. Козлов Л.В., Сизой М.Н., Зинченко А.А., Левковский А.В. Ингибирование связывания и активация первого компонента комплемента человека. Действие синтетических пептидов, фрагментов иммуноглобулинов и некоторых белков. Биохимия. 1986. Т. 51. 5. С. 707-718.

2. Kolb W.R., Kolb L.M., Podack E.R. C1q: isolation from human serum in high yield by affinity chromatography and development of a highly sensitive hemolytic assay. J. Immunol. 1979. V. 122. 5. Р. 2103-2111.

Формула изобретения

Способ определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента С1q, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели неспецифический иммуноглобулин G, затем в лунки вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в контрольной серии тестируемое вещество не вносят, после инкубации и удаления жидкого содержимого лунок вносят конъюгат фермента с антителами против субкомпонента С1q человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение количества связавшегося компонента С1q по продукту ферментативной реакции и, сравнивая данные о количестве связавшегося компонента С1q в присутствии определенных концентраций тестируемого вещества и в отсутствии тестируемого вещества, определяют константу ингибирования этим веществом связывания субкомпонента С1q.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения изотипического состава компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах

Изобретение относится к медицине, в частности к биотехнологии, и может применяться в ревматологии, клинической иммунологии

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики активности инфекционного эндокардита
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах
Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиопульмонологии, и может быть использовано в диагностике ограниченных форм туберкулеза легких

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу определения антифосфолипидных антител, и может быть использовано в биологии и медицине для определения антифосфолипидных антител в сыворотке крови человека при акушерских осложнениях (невынашивании беременности, токсикозах, внутриутробной задержке развития плода), ревматических заболеваниях (системной красной волчанке, системной склеродермии, ревматоидном артрите и др.), ряде заболеваний центральной нервной системы, злокачественных новообразованиях, лимфопролиферативных синдромах, при острых и хронических вирусных, бактериальных и паразитарных инфекциях (инфекционном мононуклеозе, туберкулезе, сифилисе, болезни Лима, СПИДе и др.)

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для определения иммунного статуса организма

Изобретение относится к области медицины, биологии, сельского хозяйства, к способу проведения сорбционного иммуноферментного анализа для выявления малых количеств биомолекул, таких как антиген, антитело и т.д
Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской иммунологии
Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологическим методам диагностики, и может быть использовано для обнаружения различных антигенов и антител

Изобретение относится к области медицины, в частности к области гематологии, онкологии и клинической лабораторной диагностики, кроме того, оно может быть использовано в ветеринарии и биологии
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и описывает способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп, включающий получение иммунных кроличьих сывороток с последующей их сенсибилизацией на полимерный носитель в виде микросфер для обнаружения клеток штаммов L. pneumophila в реакции слайд-агглютинации, причем в качестве полимерного носителя антител используют полиакролеин, который на стадии полимеризации обрабатывают сафранином Т, а микросферы выполняют диаметром 1 мкм с содержанием альдегидных групп 0,4 мкмоль/г, затем носитель дополнительно обрабатывают 5% водным раствором танина при 37-40°C в течение трех часов и выдерживают 15 часов при комнатной температуре, отмывают водой посредством центрифугирования до отрицательной реакции в супернатанте на фенолы с FeCl3, после этого проводят сенсибилизацию микросфер легионеллезной кроличьей сывороткой, для этого 25 мг носителя суспендировали в 0,9 мл физиологического раствора и добавляли 0,1 мл разведенной (1:40) сыворотки, полученную суспензию перемешивают в течение 2-х часов при комнатной температуре, затем 15 часов при 4°C отмывают раствором хлористого натрия и суспендируют их в 1 мл того же раствора с 1% желатозой, проводят консервацию полученного диагностикума и разливают его в 5 мл емкости для использования и хранения. Способ обеспечивает обнаружение возбудителя Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп с высокой специфичностью, демонстративностью и низкой себестоимостью. 4 з.п. ф-лы, 3 пр., 3 табл.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов, в частности к способам определения ингибирующего действия веществ на связывание субкомпонента С1q комплемента активаторами классического пути активации комплемента

Наверх