Модификация липидов растений и масел семян путем использования дрожжевых генов slc

 

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в селекции растений с маслосодержащими семенами. Введение посредством векторов дрожжевого гена SLC1-1 или гена SLС1 в геном растения приводит к изменению обмена липидов в нем и состава масел в его семенах. 4 с. и 2 з.п. ф-лы, 20 табл., 7 ил.

Изобретение относится к модификации липидов растений и масел семян технологиями генной инженерии. Более точно, изобретение относится к способу генетического модифицирования растений с маслосодержащими семенами для получения маслосодержащих семян или целых растений с улучшенным коммерческим значением. Изобретение также относится к модифицированным растениям и семенам и к генетическим материалам и векторам, использованным для получения таких растений, и для дальнейших модификаций растений.

НАУЧНЫЕ ПРЕДПОСЫЛКИ В настоящее время существует значительный интерес в модифицировании композиции жирных кислот масел семян и содержимого маслосодержащих семян молекулярно-генетическими способами для обеспечения надежного источника масла рапса с наивысшей эрутиковой кислотой (SHEAR) для использования в качестве промышленного пищевого запаса. Сходный интерес существует для производства других стратегических несъедобных масел (например, масла семян, высокие в гидрокси-, эпокси-, коротких и средних цепях жирных кислот и т.д.) из традиционных культур маслосодержащих семян (как рапс, лен, подсолнечник, соя).

Для съедобных масел существует значительный интерес как к изменению композиции жирных кислот (например, высшие олеиновые/низшие полиненасыщенные, низшие насыщенные, высшие насыщенные), так и повышению содержания масла в культурах маслосодержащих семенах, таких как канола и съедобное масло льна (линола), сои и подсолнечника.

В настоящее время нет документированных примеров увеличения содержимого (количества) в маслах при помощи трансгенных средств, хотя производимость увеличивают традиционным скрещиванием и селекцией, что продолжает приносить приблизительные возрастающие улучшения.

В противоположность этому увеличение в пропорциях некоторых стратегических жирных кислот было достигнуто внедрением биосинтезов различных растительных жирных кислот и генов ацилтрансфераз в маслосодержащие семена. Некоторыми примерами таких процессов являются следующие.

1. Экспрессия средней цепи жирной ацил-АСР тиоэстеразы из California Bay в Brassicaceae для увеличения содержания лауриловой кислоты (12:0) (Calgene; Voelker et al. , 1995; 1996 - см. cсылки 35 и 36 в сопровождении "Ссылки, имеющие отношение к данному изобретению").

2. Экспрессия Jojoba β-кетоацил-СоА синтазы в культиварах Brassica napus (Канола) с низшими эрутиковыми кислотами для увеличения уровня эрутиковой кислоты; эффект, последовавший после экспрессии в культиварах высшей эрутиковой кислоты, был слабый (Calgene;Lassner et al., 1996 - см. ссылку 20).

3. Экспрессия антисмысловой конструкции к стеароил-АСР Δ9 дезатуразе в Brassicaceae для увеличения содержания стеариновой кислоты (Calgene; Knutzon et al., 1992 - см. ссылку 16).

4. Увеличенные пропорции олеиновой кислоты в B.napus путем косуппрессии с использованием смысловой конструкции, кодирующей растительную микросомальную FAD (Δ12) дезатуразу (duPont/InterMountain Canola; Hitz et al., 1995 - см. ссылку 12).

5. Увеличение пропорций к 12:0 или 22:1 в позиции sn-2 триацилглицеролов (TAG) в семенах рапса путем экспрессии ацилтрансферазы лизофосфатидиловой кислоты (LPAT; Е. С. 2.3.1.51) кокоса или meadowfoam, соответственно (Calgene; Knutzon et al., 1995 a&b. - см. ссылки 17 и 18; Lassner et al., 1995 - см. ссылку 21).

Несмотря на то, что использование растений-трансгеников привело к изменению пропорций sn-2 лауриловой и эрутиковой кислот, в лауратах канолы и высших эрутиковых кислотах семян рапса соответственно общие пропорции лауриловой и эрутиковой кислот в маслах семян не повысились, и не было доказательства увеличения общего содержания жирных кислот или увеличенной продуктивности масла в этих трансгениках.

Таким образом, необходимы новые пути увеличения продуктивности масла и улучшения композиции масла в маслосодержащих растениях путем использования технологий генетической инженерии.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Целью настоящего изобретения является генетическое преобразование маслосодержащих растений для улучшения коммерческого значения таких растений, семян таких растений и масел, полученных их таких растений.

Другой целью изобретения является обеспечение способа модифицирования продуктивности и композиции масел, полученных из растений с маслосодержащими семенами.

Настоящее изобретение основано на открытии, что гены sn-2 (SLC1-1 и его аллель SLC1) ацилтрансферазы ацилглицериновых жирных кислот из дрожжей (Saccharomyces cerevislae) могут быть использованы для изменения содержания масел и композиции масел растения, в геном которого внесен экспрессибельный дрожжевой ген SLC1-1 или ген SLC1.

В соответствии с другим объектом изобретения обеспечиваются семена трансгенных растений с маслосодержащими семенами, в геном которых внесен экспрессибельный дрожжевой ген SLC1-1 или ген SLC1.

В соответствии с еще одним аспектом изобретения обеспечивается способ получения трансгенных растений с маслосодержащими семенами, который состоит из введения в геном вышеупомянутого растения экспрессибельного дрожжевого гена SLC1-1 или ген SLC1.

Изобретение также относится к различным плазмидам и векторам, использованным в способе изобретения, и к введению других генов в растения, модифицированные введением генов SLC1-1 или SLC1.

Преимущества настоящего изобретения включают факт, что дрожжевые гены SLC1-1 или SLC1 могут быть использованы для увеличения содержания масла и для изменения общей композиции жирных кислот, как и для изменения ацильной композиции TAG, включая позицию sn-2, и для изменения относительных пропорций типов TAG в различных растениях с маслосодержащими семенами, например, Arabidopsis thaliana, высших эрутиковых кислот и культиваров канола у Brassica napus и у Brassica carinata.

Более того, дрожжевая sn-2 (гены SLC1-1 и SLC1) ацилтрансфераза может быть использована в высшей эрутиковой кислоте Brassicaceae для повышения содержания масла и для продукции масел из семян с повышенным содержанием жирных кислот с очень длинными цепями (VLCFA) и TAG с измененной стереоспецифической композицией относительно жирных кислот с очень длинными цепями. Таким образом, в контрасте с предыдущими результатами использования трансгеников растений (как было показано выше) настоящее изобретение использует дрожжевой трансген, способный достичь объединенных повышений в содержании масел семян, содержании эрутиковой кислоты семян и в общих пропорциях эрутиковой кислоты в масле семян.

Дрожжевая sn-2 ацилтрансфераза (гены SLC1-1 и SLC1) также может быть утилизирована в культиварах съедобных масел (культивары качества Канола) Brassicaceae для увеличения содержания масла и для продукции масел семян с измененными пропорциями олеиновой кислоты, полиненасыщенных жирных кислот и насыщенных жирных кислот с очень длинными цепями.

Соответствующие SLC1-1 и SLC1 дрожжевые аллели могут быть использованы тем же образом. Обе аллели кодируют sn-2 ацилтрансферазу; SLC1 отличается от SLC1-1 только в аминокислотной позиции 44 (Глутамин, Q) по сравнению с SLC1-1, где в аминокислотной позиции 44 находится Лейцин (L).

SLC1-1 и SLC1 трансгенные растения могут быть использованы как гермплазм-хозяин для дальнейшей регуляции репрессии эндогенных ацилтрансфераз растений.

Для достижения направленной сборки TAG биосинтеза для продуцирования стереоспецифически запланированных TAG необходима координированная экспрессия числа биохимических реакций, включая те, которые опосредованы LPAT. Одной из отличных возможностей, касающихся оптимизации трансгенной экспрессии чужеродных LPAT синтезировать TAG с новыми ацильными композициями (например, увеличение очень длинных цепей жирных кислот в позиции sn-2), является возможная необходимость одновременно репрессировать эндогенные LPAT, уже присутствующие в трансгенном хозяине (например, LPAT, которые в норме предпочтительно вносят полиненасыщенные C₁₈ жирные ацильные группы в sn-2 позицию). Общие гомологии между дрожжевой sn-2 ацилтрансферазой и опубликованными растительными sn-2 ацилтрансферазами (LPAT) низки и, в основном, ограничены С-концом белков (Brown et al., 1994; Brown et al., 1995; Knutzon et al., 1995 a; Lassner et al., 1995). В противоположность, ацилтрансферазы растений имеют более высокую общую гомологию между собой, и регионы гомологии тянутся через всю последовательность. Поэтому использование дрожжевых SLC генов для достижения описанных здесь эффектов предоставляет уникальную возможность далее улучшить эти характерные черты способом, который невозможен, если была проведена первоначальная трансформация с растительной ацилтрансферазой. При этом эффекте ограниченная гомология между растительной и дрожжевой sn-2 ацилтрансферазой является достаточно низкой, чтобы позволить процессам репрессии влиять на LPAT растения-хозяина подходящими способами (например, технология антисмысловой РНК или феномен косупрессии; Мо1 et al., 1990; Van Blokland et al., 1993; De Lange et al., 1995) без сопутствующих негативных влияний на экспрессию дрожжевого трансгена или на развитие семени растения. Таким образом, стратегия дрожжевого трансгена имеет значительное преимущество над таковой, при которой другой растительный трансген вносят в растение-хозяин, в котором имеется высокогомологичная эндогенная LPAT.

Дрожжевая sn-2 ацилтрансфераза (гены SLC1-1 и SLC1) может быть использована для увеличения содержания масла и изменения ацильной композиции TAG во всех других маслосодержащих семенах, включая бурачник (Вогадо spp.), кастор (Ricinus communis), какао (Theobroma cacao), кукурузу (Zea mays), хлопок (Gossypium spp), Crambe spp., Cuphea spp., лен (Linum spp.), Lesquerella и Limnanthes spp., настурцию (Tropaeolum spp.), Oenothera spp., оливы (Olea spp. ), масличную пальму (Elaels spp.), арахис (Arachis spp.), сафлор (Carthamus spp.), сою (Glycine и Soja spp.), подсолнечник (Helianthus spp.), табак (Nicotiana spp.) и Vernonia spp.

Для продуцирования масел семян с повышенными количествами жирных кислот с улучшенным качеством (т.е. повышенное содержание гидрокси жирных кислот и композиций TAG, измененных относительно содержания гидрокси жирных кислот) могут быть использованы трансформанты маслосодержащих семян с дрожжевой sn-2 ацилтрансферазой (гены SLC1-1 и SLC1), протрансформированные вторично с генами биосинтеза любых других жирных кислот с улучшенным качеством, или скрещенные с соответствующими трансформантами маслосодержащих семян, уже содержащих такие гены, которые улучшают качество.

Ген SLC1-1 и соответствующая аллель SLC1 могут быть использованы для модификации жирных кислот и липидных профилей в вегетативных тканях для улучшения толерантности к биотическим и абиотическим стрессам растений (например, повышенная текучесть мембран в корнях и тканях листьев для улучшения устойчивости к холоду).

Использование дрожжевого гена SLC1-1 и аллели SLC1 у растений для привнесения приблизительных изменений в общее липидное содержание и композицию ранее не было раскрыто или продемонстрировано (доведено до практики) как средства для манипулирования относительными пропорциями или количествами жирных кислот (например, очень длинными цепями жирных кислот), а также для повышения содержания масла в культурах, продуцирующих съедобные или несъедобные масла.

Ранее не было продемонстрировано увеличение продуктивности масла, обеспеченной трансгенными средствами. Более специфично, не существует предварительного доказательства, что дрожжевые ацилтрансферазы - ферменты, ответственные за синтезирование триацилглицеролов, - были экспрессированы в растениях для изменения композиции или содержания масла.

В контрасте, однако, понижение активности диацилглицерол ацилтрансферазы у мутанта Arabidopsis thaliana приводило к уменьшению в продуктивности масла и к изменению в ацильной композиции (Katavic et al., (1995) Plant Physiology, 108:399-409 - см. ссылку 15).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Фиг.1 показывает нуклеотидную [SEQ ID N0:l] и производную аминокислотную [SEQ ID NO:2] последовательности кодирующей области дрожжевого гена SLC1-1, использованного в настоящем изобретении, стоп-кодон обозначен "@", и высоко консервативная смысловая последовательность между бактериальной и дрожжевой sn-2 ацилтрансферазами подчеркнута.

Фиг.2 показывает нуклеотидную [SEQ ID N0:3] и производную аминокислотную [SEQ ID NO: 4] последовательности кодирующей области дрожжевого гена SLC1, использованного в настоящем изобретении, стоп-кодон обозначен "@", и высококонсервативная смысловая последовательность между бактериальной и дрожжевой sn-2 ацилтрансферазами подчеркнута.

Фиг. 3 показывает стратегию конструирования SLC1-1 вектора трансформации растений, поясненную в разделе Экспериментальные детали, рельефные части показаны не в масштабе.

Фиг. 4 - 7, как и табл. 1-20 показывают результаты тестов, поясненные в разделе Экспериментальные детали.

ЛУЧШИЕ СПОСОБЫ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ Последовательности гена SLC1-1 [SEQ ID N0:l] и аллели SLC1 [SEQ ID N0:3] и произведенные из них пептидные структуры [SEQ ID NOS:2 и 4] таковы, как показано на фиг.1 и 2 соответственно.

Дрожжевой ген SLC1 (и соответствующий супрессорный аллельный ген SLC1-1) были охарактеризованы в двух следующих публикациях (раскрытия которых внесены здесь в качестве ссылок): 1. Lester R. L. , Wells G.B., Oxford G. и Dickson R.C. (1993) Mutant strains of Saccharomyces cerevisiae lacking sphingolipids synthesize novel inositol glycerolipids that mimic sphingolipid structures. J. Biol. Chem. 268:845-856 - ссылка 22; и 2. Nagiec M.M., Wells G.B., Lester R.L., и Dickson R.C., (1993) A suppressor gene that enables Saccharomyces cerevisiae to grow without making sphingolipids encodes a protein that resembles an Escherichia coli fatty acyltransferase. J. Biol. Chem. 268: 22156-22163 - ссылка 25.

Аминокислотные и ДНК последовательности кодирующей области гена SLC1-1 хранятся в GenBank/EMBL под входящим номером No. L13282 (сохраненная последовательность, включающая 5' нетранслируемую область, не раскрыта в настоящей заявке).

Ген SLC1 первоначально был клонирован из дрожжевого мутанта, потерявшего способность производить сфинголипиды. Было показано, что мутантная аллель SLC1 кодирует белок, который супрессирует генетический дефект биосинтеза основания длинной цепи сфинголипида. Последовательнсть гена SLC1 гомологична гену PLSC Е.соli, который, как было заявлено, кодирует ацилтрансферазу лизофосфатидиловой кислоты (LPAT; ацилтрансфераза, ацилирующая sn-2 позицию лизофосфатидиловой кислоты (LPA) для образования фосфатидиловой кислоты (PA))(Coleman, 990; Coleman 1992). Ген SLC1 был способен комплементировать дефект роста у JC201 (штамм E.coli, мутированный в PLSC)(Coleman, 1990). Основываясь на наблюдении, что штаммы SLC, растущие в отсутствие основания длинной цепи, производят новые производные фосфатидилинозитола (Lester et al. , (1993) J.Biol.Chem. 268: 845-856.), единственным возможным заключением авторов было то, что SLC1 кодирует белок, способный ацилировать sn-2 позицию инозитолсодержащих глицеролипидов (например, возможно, ацилтрансферазу лизофосфатидил-инозитола, LPIT). Основываясь на этих наблюдениях, было заявлено, что SLC1 кодирует дрожжевую sn-2 ацилтрансферазу. Однако авторы статьи (Dickson, Lester et al.) были неспособны определить активность LPAT в комплементирующем мутанте E.coli JC 201.

В статье Nagiec с соавторами авторы также докладывают последовательность гена для супрессорной аллели, относящейся к SLC1-1, в которой нуклеотид 131 имеет Т вместо А, приводя к аминокислотной замене в позиции 44 с глутамина на лейцин. Рабочей гипотезой является та, что супрессорная аллель SLC1-1 кодирует вариант ацилтрансферазы с измененной специфичностью к субстрату, которая делает ее неспособной использовать очень длинноцепочечные жирные кислоты (26: 0) для ацилирования sn-2 позиции глицеролипидов, содержащих инозитол. К настоящему времени авторы не обеспечили заключительное доказательство активности, которая кодируется SLC1-1 или SLC1.

Основываясь на интересующей изобретателей настоящего изобретения модификации содержания очень длинноцепочечной жирной кислоты (VLCFA) Brassicaceae, изобретатели получили плазмиду р411 ΔВ/С, содержащую ген SLC1-1 супрессорной аллели от доктора Диксона, Университет Кентуки, Лексингтон, Кентуки, США. Изобретатели также считают, что экспрессия чужеродного гена в растениях может дать больше информации о природе того, что кодируют SLC1-1 и SLC1. Сначала работа, проведенная изобретателями, идентифицировала использование модели маслосодержащих семян Arabidopsis thaliana, трансформантов с повышенным содержанием масла в семенах и повышенными пропорциями TAG, содержащих очень длинноцепочечные жирные кислоты (VLCFA=>C₁₈). В дополнение, имеются повышенные пропорции VLCFA в sn-2 позиции TAG и сопутствующее понижение в пропорции полиненасыщенных жирных кислот, эстерифицированных в этой позиции. SLC1-1 трансформанты B.napus cv. Hero и B.carinata (оба являются культиварами высокой эрутиковой кислоты) показывают повышенное содержание масла и повышенное содержание эрутиковой кислоты/мг сухого веса (DW) семян. SLC1-1 трансформанты B. napus cv. Westar (культивар качества Канола) показывают повышенные пропорции олеиновой кислоты (18:1) и пониженные пропорции полиненасыщенных жирных кислот (18:2 и 18:3).

Гены SLC1-1 и SLC1 могут быть введены в геном растений с маслосодержащими семенами и проэкспрессированы с использованием традиционных методов генной инженерии. Например, трансформация может включать использование трансформации Agrobacterium Ti плазмидой (например, in planta, вакуумной инфильтрацией, инфицированием раны семядоли или черешка гипокотиля, или бомбардировкой частиц и т. д.). Конструкции могут управляться конститутивными или тканеспецифичными промоторами, что является очевидным профессионалам в области.

Ожидается возможность широкого приложения изобретения к растениям с маслосодержащими семенами различных типов, т.к. синтез масла следует тем же или близким биохимическим механизмам во всех таких растениях (см. ссылки 29, 30, 37, 38, 39 и 40).

Настоящее изобретение будет описано более детально со ссылкой на следующие экспериментальные детали, которые сопровождаются специальными иллюстрациями. Однако необходимо помнить, что настоящее изобретение не ограничивается деталями, представленными ниже.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДЕТАЛИ Конструирование векторов для трансформации SLC1-1 Следуя стратегии клонирования, проиллюстрированной на фиг.3, были использованы два праймера с добавлением рестрикционного сайта BamHI на 5' конце, ОМО87 (AGAGAGAGGGATCCATGAGTGTGATAGGTAGG) [SEQ ID NO: 5] И ОМО88 (GAGGAAGAAGGATCCGGGTCTATATACTACTCT) [SEQ ID N0:6], составленные в соответствии с последовательностями 5' и 3' концов гена SLC1 [SEQ ID N0:3] соответственно в Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) с плазмидой р411ΔВ/С (полученной от доктора Диксона из Университета Кентуки, Лексингтон, Кентуки, США), наработана супрессорная аллель гена SLC1 (SLC1-1) в качестве матрицы для генерации ПЦР фрагмента SLC1-1 с BamHI сайтом на обоих концах. ПЦР фрагмент (SLC1-1) поэтому представляет собой суппрессорную аллель гена SLC1 с нуклеотидом Т, замещающим нуклеотид А в позиции 131, что приводит к изменению аминокислотного остатка с глутамина на лейцин в позиции остатка 44.

Фрагмент рестрицировали BamHI и лигировали в сайт для клонирования BamHI, локализованный между тандемом промотор 35S и терминатор NOS в векторе рВ1524 (полученном от доктора Раю С.С. Датла, NRC Plant Biotechnology Institute, 110 Gymnasium Place, Saskatoon, Saskatchewan, Канада, S7N OW9; опубликовано Datla et al., 1993 - см. ссылку 9) для получения вектора SLCl-I-pBI-524. Ориентацию SLC1-1 в векторе SLCl-I-pBI-524 подтверждали рестрикционно с ферментом BglII, который разрезает SLC1-1 в нуклеотиде 377 от 5' конца и сразу после промотора 35S в векторе рВ1524. Присутствует кодон инициации трансляции SLC1-1 и, таким образом, конструкция является транскрипционно слитой. Фрагмент HindIII-EcoRI, содержащий тандем промотор 35S, энхансер AMV, кодирующую последовательнсть SLC1-1 и терминатор NOS, выделяли из SLCI-l-pBI-524 и клонировали в сайт EcoRI-HindIII вектора RD400 (также полученного от д. Датла; опубликовано Datia et al., 1992 - см. ссылку 8). Конечный вектор pSLCI-l/pRD400 (депонированный 9 мая 1996 года под названием Budpest Treaty в Американскую Коллекцию Культур Микроорганизмов (American Type Culture Collection), 12301 Parkland Drive, Rockville, MD 20852, США; под депозитарным номером АТСС 97545) вводили в штамм GV 3101 Agrobacterium tumefaciens (несущий хелперную плазмиду рМР90; Koncz и Schell, 1986) путем электропорации.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Все молекулярно-биологические методы были использованы как методы, в основном описанные Ausubel et al., (1995), если не указано иным образом.

УСЛОВИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ РАСТЕНИЙ
Все контрольные и трансгенные растения A.thaliana выращивали в одно и то же время, в камерах с контролем роста при постоянном флуоресцентном освещении (150-200 μЕ м^-2 с^-1) при 22^oС, как описано Katavic et al., (1995). Все другие контроли и трансгенные растения Brassicaceae (B.napus, B.carinata) выращивали в одно и то же время в теплице P.B.I. Transgenic Plant Center при натуральном освещении, дополненном лампами с натрием под высоким давлением (HPS лампы), с фотопериодом 16 часов (16 ч свет/8 ч темнота) при 22^oС и при относительной влажности 25-30%.

ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ
Конструкцию SLC1-1/RD400 тестировали в A.thaliana методом трансформации in planta и в культиварах с высокой и низкой эрутиковой кислотой B.napus, и B. carinata (путем ко-культивированной трансформации черешков семядоли и эксплантов гипокотиля с A.tumefaciens, несущей конструкцию SLC1-1).

Тестирование конструкции SLC1-1 в A. thaliana
Растения дикого типа (WT) A. thaliana экотипа Columbia выращивали в почве. Трансформацию in planta проводили инокуляцией в ране (Katavic et al., 1994) или вакуумной инфильтрацией (Bechtold et al., 1993) с суспензией ночной бактериальной культуры A. tumefaciens штамма GV3101, несущего хелперную плазмиду рМР90 (Ti плазмида без плеч, с полным vir районом, действующим in trans, маркерами селекции гентамицином и канамицином; Koncz и Schell (1986)) и бифункциональным вектором pSLCl-l/pRD400.

После инокуляции или инфильтрации растения выращивали до стадии закладки семян (T₁). Сухие семена (T₁) собирали в большом количестве и делали скрининг на селективной среде с 50 мг/л канамицина. После нахождения от двух до трех недель на селективной среде рассаду переносили в землю. ДНК листьев изолировали из канамицинустойчивых T₁ растений и анализировали ПЦР-амплификацией SLC1-1 фрагмента. Развивающиеся листья из T₁ растений, как и зрелые семена Т₂ из трансгенных линий SLC1-1, использовали для липидных и биохимических анализов. В качестве контролей при анализе липидов семян использовали развивающиеся листья и зрелые семена из нетрансформированных растений дикого типа (WT) Columbia и рВ1121 трансгенные растения (бифункциональный вектор рВ1121, содержащий только маркер селекции канамицин и репортерный ген GUS; Jefferson et al., 1987). Основываясь на этих анализах, семена Т₂ из линий, проявляющих измененные ацильную композицию и/или содержание липидов, выращивали на селективной среде (для удаления гомозиготных сегрегантов WT) и затем переносили в почву для продуцирования Т₃ популяции семян.

Тестирование SLC1-1 конструкций в Brassica napus и Brassica carinata
Эксперименты по трансформации также были проведены на B. napus cv Westar (разнообразные канола, низшая эрутиковая кислота), B. napus cvs. Него, Reston и Argentine (все варианты высшей эрутиковой кислоты) и B. carinata (скрещенная линия С90-1163, линия высшей эрутиковой кислоты) путем ко-культивирования черешков семядолей и эксплантов гипокотиля с A. tumefaclens, несущей конструкцию SLC1-1/RD400. Методы трансформации, соответствующие Moloney et al. (1989) и DeBlock et al. (1989), были модифицированы для оптимизации условий трансформации.

Модификации метода трансформации черешок-семядоля (Moloney et al., 1989) включают внесение 7-дневного периода восстановления экспланта с последующим ко-культивированием на среде MS с гормоном бензиладенином (ВА) и антибиотиком тиментином для удаления Agrobacterium.

Модификации метода трансформации гипокотиль-эксплант (DeBlock et al.; 1989) включали: (1) прекультивирование экспланта на среде MS, уплотненной агаром, с гормонами 2,4-дихлоро-фенокси-ацетиловая кислота (2,4-D) и кинетин (К); (2) ко-культивирование эксплантов гипокотиля с Agrobacterium в чашках Петри с той же средой, что и при прекультивировании, на стерильных бумажных фильтрах; (3) последующее ко-культивирование, 7-дневный период восстановления экспланта на среде с гормонами (2,4-D и К) и с тиментином для удаления Agrobacterium, (4) регенерация трансгенных побегов на среде MS с гормонами бензиладенин (ВА) и зеатин (Z), ингибитором этилена нитратом серебра (АgNO₃) и антибиотиками тиментином (для удаления Agrobacterium) и канамицином (для селекции трансформированные клетки/побеги).

Зеленые побеги переносили в землю и укореняли. Геномную ДНК изолировали из развивающихся листьев и проводили ПЦР анализ и Саузерн анализ (Southern, 1975). Семена (T₁) из трансгенных растений собирали и выращивали в земле десять T₁ растений из каждой трансгенной линии. Зрелые семена (Т₂) из этих растений собирали и подвергали липидному и биохимическому анализам.

ЛИПИДНЫЕ АНАЛИЗЫ И ПРОБЫ АЦИЛТРАНСФЕРАЗЫ (LPAT)
Анализы липидов листьев и семян из SLC1-1 и трансгеников WT/pBI121, и нетрансформированных растений WT.

Липиды изолировали из зрелых семян и развивающихся листьев, как описано выше (Taylor et al., 1992; Katavic et al, 1995) и анализировали с использованием GC на общее содержание жирных кислот и композицию жирных кислот. Триацилглицериловые образцы анализировали высокотемпературными GC, как описано Katavic et al., 1995. Стереоспецифические анализы TAG выполняли на липидах интактных семян (главным образом, TAG), как описано Taylor et al., 1994, 1995 а и b.

Пробы LPAT
Для анализов листьев из контрольной группы и трансгенных растений SLC1-1 отбирали листья среднего размера и подвергали анализу ткани листьев, отобранные из нескольких листьев сверлением коры. Для проведения проб семян собирали 25-30 силик A.thaliana на срединной стадии развития семян (15-18 d.p.a. ), чтобы дать развиться пробам семян Т₃ из обоих контролей (нетрансформированный WT и трансформированный рВ1121), и отбирали трансгеники SLC1-1. ₂ эмбрионов в срединной стадии развития семядолей B.napus и B. carinata собирали из 3 силик контроля и отбирали трансгенные растения SLC1-1. Все растительные материалы немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -70^oС до гомогенизирования. Готовили гомогенаты и листьев растений, и тканей развивающихся семян и проводили анализ LPAT, как описано Taylor et al., (1995 b).

Все методики относительно дрожжевых штаммов проводили, как описано Ausubel et al., (1995, Unit 13.1 Основные методики дрожжевой генетики). Штаммы дикого типа S.cerevisiae и S.pombe культивировали в среде YPD при 28^oС при 270 оборотах в течение ночи. В средней log-фазе собирали клетки, осаждали путем центрифугирования при 5000 оборотах в течение 5 мин и ресуспендировали в 100 мМ Hepes-NaOH, pH 7.4. Лизаты клеток готовили, используя промытые кислотой стеклянные баллотини, как описано Ausubel et al., 1995 (Unit 13.1, Секция 13.13.4).

Пробы LPAT проводили при pH 7.4, при перемешивании при 100 оборотах в водяной бане, при 30^oС в течение 10-30 мин. Смеси проб (конечного объема 0.5 мл) содержали белок (10-200 μг, в зависимости от ткани/экстракта), 90 мМ Hepes-NaOH, 0.5 мМ АТР, 0.5 мM CoASH, 2 мM спермидина, 45 μМ 18:1 - LPA и или 18 μM [l^-14 C]-18:l-CoA, [l^-14C]-2O:1-CoA, или [1^-14С]-22:1-СоА (каждой при специфической активности 10 nCi/нмоль) в качестве ацильного донора. Все прочие условия измерения активности LPAT таковы, как описано у Taylor et al (1995 b).

¹H-ЯМР зрелых семян
Анализы ¹H-ЯМР на относительную продукцию масла (Alexander et al., 1967; Rutar, 1989) проводили на интактных семенах контролей и трансформированных SLC1-1 B.napus cv. Него и B.carinata, используя Bruker AM широкосверлильный спектрометр, работающий в диапазоне 360 мГц. Для понижения анизотропной линии разброса семена (35/пробу) вращали при 1 кГц в циркониевом роторе, ориентированном под углом 54.7^o к магнитному полю (магический угол вращения проб, MASS).

РЕЗУЛЬТАТЫ
Ацил-СоА специфичность дрожжевой (S. cerevisiae; S.pombe) sn-2 ацилтрансферазы (LPAT)
Лизаты дрожжевых клеток и S.cerevisiae, и S.pombe брали на пробы относительной активности sn-2 ацилтрансферазы, используя 18:1 LPA в качестве ацильного акцептора и различные радиомеченые ацил-СоА. Специфичность ацил-СоА дрожжевых LPAT in vitro была довольно широкой, и LPAT была способна вносить и эндогенную (16:0, 18:1), и не эндогенную (18:2, 18:3, 20:1, 22:1 и рицинолеоил) ацильные группы в sn-2 позицию 18:1 LPA, как показано в табл. 1.

Трансформацию маслосодержащих семян, богатых очень длинноцепочечными жирными кислотами (A.thaliana, B.napus), дрожжевым геном SLC1-1 можно провести таким образом, чтобы получить обогащенное содержание VLCFA, включая позицию sn-2, т. к. дрожжевая LPAT (sn-2 ацилтрансфера) имеет относительно широкую специфичность. В дополнение, можно предусмотреть, чтобы дрожжевые трансформанты SLC1 и SLC1-1 были наилучшими хозяевами для трансформации с генами гидроксилазы из кастора (R.communis) и Lesquerella spp. для продуцирования маслосодержащих семян, обогащенных гидрокси жирными кислотами. В противоположность, трансформанты гидроксилазы могут перекрещиваться по полу с трансформантами SLC1-1 или SLC1.

Анализ липидов семян трансформантов A.thallana
Данные по трансформации Arabidopsis thaliana показывают, что ген существенно влияет на общее содержание липидов в семенах и на sn-2 композицию TAG. Большое число Т₂ трансгенных линий SLC1-1 (21 из 48) показали значительное увеличение продуктивности масла над нетрансформированными контролями и контролями рВ1121 (без встройки SLC1-1), как показано в табл. 2.

Особенностью этих Т₂ линий SLC1-1 являются пропорции TAG, содержащих VLCFA (например, в табл. 3 и 4) и, следовательно, общее содержание VLCFA в семенах, особенно эикозеноиковой кислоты и эрутиковой кислоты, которые были значительно повышены (табл. 5). В некоторых случаях также были повышены общие пропорции VLCFA (табл. 6).

Те трансформированные SLC1-1 Т₂ линии, которые показывали наиболее обнадеживающие результаты относительно повышенного содержания масла и увеличенных пропорций TAG, содержащих VLCFA, были отобраны, и отдельные семена выращены, чтобы дать Т₃ потомственную линию. Липидный анализ TAG из различных независимых SLC1-1 трансгенных Т₃ линий показал, что общее липидное содержание было значительно повышено (показано как μг жирных кислот/100 семян; табл. 7), что коррелировало с повышенным содержанием TAG (нмоль TAG/100 семян; табл. 8) по сравнению с контрольными Т₃ трансформантами рВ1121. В особенности, количества VLCFA (μг/100 семян; табл. 7) и уровни VLCFA-содержащих С₅₈ и C₆₀ TAG (табл. 8) были очень увеличены у нескольких трансформантов SLC1-1 над контрольными растениями рВ1121.

Стереоспецифические анализы TAG из селектированных независимых Т₃ SLC1-1 трансгеников показали повышенные пропорции VLCFA (например, эикозеноиковой кислоты, 20:1) в позиции sn-2. Эта тенденция является последовательной, вне зависимости от того, были ли данные выражены как пропорция среди всех жирных кислот позиции sn-2, которые представлены эикозеноиковой кислотой, или как пропорция общей эикозеноиковой кислоты в TAG, которая обнаружена в позиции sn-2 (табл. 9). Далее, в трансгениках SLC1-1 увеличение в пропорциях VLCFA (например, эикозеноиковой кислоты) в позиции sn-2 TAG коррелировало с последовательным понижением в пропорциях полиненасыщенных жирных кислот в этой позиции по сравнению с контрольными растениями рВ1121 (фиг.4).

Анализ липидов семян трансформантов SLC1-1 B.napus и B.carinata
Несколько Т₂ трансформантов SLC1-1 линий семян B. napus cv. Hero, cv. Reston и B. carinata проявляли повышенное содержание масла (табл. 10) и повышенное содержание эрутиковой кислоты, выраженные как μг/мг DW или как μг/семя (табл. 11). У B. napus cvs. Неrо и Reston семена нескольких трансгенных линий SLC1-1 проявляли повышенные пропорции эрутиковой кислоты (табл. 12) по сравнению с соответствующими уровнями у нетрансформированных контрольных растений. Анализы отдельных семян из средних нетрансформированных растений Него (растение 4) и трансформированных линий SLC1-1 с обнадеживающе высокой продуктивностью масла и фенотипом высшей эрутиковой кислоты (Линия 8, растение 6) показали распределение этих характерных особенностей, предполагая, что популяция семян сегрегировала по типичному закону Менделеева для единственной инсерции (табл. 13). Некоторые семена Неrо Линии 8, растения 6 демонстрировали, возможно, гомозиготный дикого типа (например, семена 8-61) или гомозиготный SLC1-1 (например, семена 8-6К и 8-6Н) фенотипов для всех трех характерных особенностей (высокая продуктивность масла, повышенное содержание эрутиковой кислоты, повышенные пропорции эрутиковой кислоты), в то время как другие проявляли скорее гетерозиготные профили дикий тип/SLС1-1 с промежуточными значениями для этих трех характерных особенностей (например, семена 8-6В).

В некоторых трансформированных линиях Него имелись измеряемые увеличения в пропорциях эрутиковой кислоты и общих VLCFA в позиции sn-2 (табл. 14). Влияние дрожжевого трансгена на повышение содержания sn-2 эрутиковой кислоты в B.napus было немного меньшим, чем его способность изменять содержание sn-2 эикозеноиковой кислоты в A.thaliana (табл. 9). Однако это возможно, что не ожидалось, основано на относительной специфичности sn-2 ацилтрансферазы S. cerevisiae к эикозеноил- vs эрукоил-СоА (табл. 1).

Анализы композиции типов TAG с использованием GC показали, что несколько линий трансформантов SLC1-1 Него имели повышенные пропорции С₄₂ TAG и в меньшей степени С₅₄ и С₅₆ TAG (табл. 15). Пропорции С₆₂-С₆₈ TAG, содержащих 2 или более С₂₂ жирных кислот, были значительно повышены в трансгениках Него SLC1-1 (табл. 15), в основном, за счет TAG, содержащих две (C₅₄) или три (С₅₄) С₁₀ жирные кислоты (данные не показаны). Сходное повышение в пропорции TAG С₅₂ наблюдали в некоторых трансгенных линиях B. napus cv. Reston SLC1-1 (табл. 15).

Анализы типичных контролей и трансгеников SLC1-1 B. napus cv. Hero относительно вариаций в пропорциях С₆₂ TAG от семени к семени показали, что популяция семян SLC1-1 Т₂ сегрегировала, но что многие из отдельных семян имели значительно более высокие пропорции TAG С₆₂, чем любые из нетрансформированных контролей (табл. 16).

Оценки продуктивности масла, повышенные относительно контроля в трансгенных линиях SLC1-1, прямо коррелировали, будучи выражены как "на мг сухого веса", или как "на семя" (фиг.5), или как были оценены на относительное содержание масла недеструктивным методом ¹Н-ЯМР (фиг.6). В действительности, результаты ЯМР по увеличенной продуктивности масла также позитивно коррелировали с повышенными весами семян в трансгениках (фиг.7) и показывали, что повышенный сухой вес семян прямо соотносился с увеличением масла, с небольшим влиянием воды семян (отсутствие широкого резонанса воды между химическими сдвигами СН₂ ОСО- и СНОСО-). Типичные ответы ¹H-ЯМР проб 35 семян контроля и "высокомасляных" трансгенных линий SLC1-1 B. napus cv Него и B. carinata. показаны в табл. 17.

Некоторые линии трансформированных Т₂ семян B. napus cv Westar (Canola) SLC1-1 демонстрировали увеличения в относительной пропорции олеиновой кислоты и сопутствующие понижения в относительных пропорциях полиненасыщенных жирных кислот (18: 2 и 18: 3) (табл. 18). Это является противоположным предсказанному эффекту, как предложено в заявке на патент Университета Кентуки. Таким образом, пропорции мононенасыщенных жирных могут быть увеличены в съедобных маслах путем экспрессии SLC1-1. Более того, пропорции насыщенных очень длинноцепочечных жирных кислот в этих линиях канола были значительно повышены (табл. 18).

Анализы LPAT трансформированных линий
Пробы SLC1-1 T₁ трансформированных линий B. napus cv Westar и B. napus cv Argentine проявляли повышенные активности 18:l-CoA:LPAT листьев в препаратах гомогенатов быстрорастущих листьев по сравнению с таковыми из нетрансформированных контрольных растений (табл. 19).

Анализы LPAT развивающихся семян нетрансформированных контролей и SLC1-1 трансгеников B. napus cv Неrо и B. carinata показали, что обе специфические активности 18: l-CoA:LPAT и 22:1-CoA:LPAT (табл. 19) были значительно повышены в трансгениках SLC1-1.

Анализы LPAT развивающихся семян нетрансформированных контролей и SLC1-1 трансгеников A.thaliana показали, что активность 20:1-CoA:LPAT была повышена в нескольких трансгениках SLC1-1 (табл. 19).

Таким образом, в этом депонировании мы впервые обеспечиваем прямое доказательство того, что продукт дрожжевого гена SLC1-1 кодирует фермент, который обладает активностью sn-2 ацилтрансферазы и который может проявлять активность LPAT in vitro.

Генетические анализы трансформантов SLC1-1
Данные ПЦР Саузерн-анализов линий трансгенных растений, процитированных в этом депонировании, суммированы в Таблице 20.

Семена из трансгенных линий (например, линии 16, 20), которые показывали повышения в содержании масла и количествах длинных (C₁₈) и очень длинноцепочечных жирных кислот (С₂₀ и С₂₂), стерилизовали и проращивали на селективной среде (50 мг/л канамицина) для того, чтобы проследить за образцами сегрегации в Т₂ поколении трансформантов SLC1-1 A. thaliana. Обе линии показали одинаковые 3: 1 образцы сегрегации (канамицин - устойчивость: канамицин - чувствительность), что означает, что маркер сегрегирует как один Менделеевский локус. Анализы гибридизации по Саузерну (Southern, 1975) подтвердили присутствие единственной инсерции Т-ДНК на геном. В линиях 23, 42, 52 и 54 анализ гибридизации по Саузерну предполагает, что все линии имеют более чем одну инсерцию Т-ДНК на геном.

Анализ Нозерн гибридизации семян в средней фазе развития, изолированных из силик A. thaliana, линий 16, 20, 23, 42, 52 и 54 подтвердил экспрессию гена SLC1-1 во всех протестированных линиях с наибольшим уровнем экспрессии в линии 42.

Анализ по Саузерну геномной ДНК, которая была изолирована из трансгенных линий B. napus cv. Westar (2, 3, 6, 13, 15, 16), выявил, что только линия 13 имеет единственную инсерцию. Обе трансгенные линии (2, 3) B.napus cv. Argentine SLC1-1 имели множественные инсерции. Трансгенные линии B.napus cv. Неrо (3, 5, 7, 8) и трансгенная линия 10 B.carina, каждые имели единственную инсерцию, в то время как линия 2 B.carina имела множественные инсерции Т-ДНК на геном.

Формула изобретения

1. Плазмида pSLCl-1/pRD400 (АТСС 97545), содержащая дрожжевой ген SLCl-1, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.

2. Штамм GV3101 Agrobacterium tumefaciens, характеризующийся тем, что он модифицирован с использованием плазмиды по п. 1 для введения в него дрожжевого гена SLCl-1, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, который при внесении в трансгенное растение с маслосодержащими семенами обеспечивает увеличение содержания масла и изменение композиции жирных кислот.

3. Способ получения трансгенного растения с маслосодержащими семенами, отличающийся тем, что в геном вышеупомянутого растения вводят штамм, охарактеризованный в п. 2, либо плазмиду, охарактеризованную в п. 1, которые содержат дрожжевой ген SLCl-1, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, либо дрожжевой экспрессибельный ген SLCl, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, причем полученное растение с маслосодержащими семенами имеет улучшенную толерантность к биотическим и абиотическим стрессам растений по сравнению с растением того же генотипа, выращенным в аналогичных условиях и в то же время, но не содержащим ни SEQ ID NO: 1, ни SEQ ID NO: 3.

4. Способ по п. 3, в котором вышеуказанное растение содержит эндогенный ген, кодирующий ацилтрансферазу лизофосфатидиловой кислоты, далее отличающийся репрессированием экспрессии вышеуказанного эндогенного гена, уже присутствующего в трансгенном растении с маслосодержащими семенами, методами антисмысловой РНК или смысловой супрессии/косупрессии.

5. Способ выделения съедобного или несъедобного масла из маслосодержащих семян растений, заключающийся в том, что выращивают маслосодержащее растение, собирают семена вышеуказанного растения и экстрагируют масло из вышеупомянутых маслосодержащих семян, отличающийся тем, что вышеуказанное растение с маслосодержащими семенами является трансгенным растением, полученным способом по п. 3, в геном которого внесен экспрессибельный дрожжевой ген SLCl-1, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, или дрожжевой ген SLCl, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.

6. Способ по п. 5, в котором вышеуказанное растение содержит эндогенный ген, кодирующий ацилтрансферазу лизофосфатидиловой кислоты, отличающийся тем, что экспрессия вышеуказанного эндогенного гена, кодирующего ацилтрансферазу лизофосфатидиловой кислоты, репрессируется технологиями антисмысловой РНК или смысловой супрессии/ко-супрессии.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42