Средство и способ лечения плоскоклеточного рака

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к средству и способу лечения плоскоклеточного рака. содержащему активное вещество и определенные конечные добавки. Сущность изобретения состоит в том, что в качестве активного вещества средство содержит эффективное количество антитела или молекулы антитела, которое (которая) связывается на аминокислотной последовательности WFGNRWHEGYR. Данное средство можно использовать для лечения плоскоклеточного рака. Технический результат изобретения состоит в расширении арсенала средств для лечения плоскоклеточного рака. 2 с. и 6 з.п.ф-лы, 5 ил., 6 табл.

Изобретение относится к способу лечения плоскоклеточного рака, основывающемуся на экспрессии вариабельного экзона v6 гена CD44, а также к средству для осуществления такого способа.

Недавно было показано, что экспрессия вариантов гликопротеина поверхности CD44 необходима и достаточна, чтобы вызвать так называемое спонтанное метастатическое поведение не только в неметастазирующей линии клеток аденокарциномы поджелудочной железы крысы, но также в неметастазирующей линии клеток фибросаркомы крысы ( и др., 1991). В то время как наименьшая изоформа CD44 стандартная форма CD44s повсеместно выражается в ряду различных тканей, в том числе эпителиальных клеток, определенные варианты сплайсинга CD44 (CD44v) выражаются только на подгруппе эпителиальных клеток. Изоформы CD44 так вырабатываются через альтернативный сплайсинг, что последовательности 10 экзонов (v1-v10) в CD44s полностью вырезаются, однако при больших вариантах могут существовать в различных комбинациях (Screaton и др., 1992; Heider и др., 1993; Hofmann и др., 1991). Варианты различаются тем, что в определенное положение внеклеточной части белка встраиваются различные аминокислотные последовательности. Такие варианты можно было обнаружить в различных опухолевых клетках человека и в ткани опухоли человека. Так, недавно была исследована экспрессия вариантов CD44 в ходе колоноректального канцерогенеза (Heider и др., 1993). Экспрессия вариантов CD44 недостаточна в нормальном эпителии толстой кишки человека, и лишь слабая экспрессия обнаруживается в пролиферирующих клетках крипт. На поздних стадиях прогрессирования опухоли, например в случае аденокарциномы, выражаются все злокачественные перерожденные варианты CD44. Далее, недавно была показана экспрессия сплай-синговых вариантов CD44 в активированных лимфоцитах, а также в случае неходжкинских лимфом (Koopman и др., 1993).

Известны различные подходы, которые годятся для осуществления дифференциальной экспрессии вариантного экзона гена CD44 в опухолях и нормальных тканях для способов диагностики и лечения (международные заявки на патенты 94/02633, 94/12631, 95/00658, 95/00851, европейский патент 0531300).

Также исследована экспрессия вариантных молекул CD44 при плоскоклеточном раке. Salmi и др. (1993) обнаружили с помощью специфичного к v6 антитела Var3.1 ослабление экспрессии v6 в опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками. Brooks и др. (1995) получили с помощью специфичного к v6 антитела 11.9 гетерогенное окрашивание при раке носоглотки. Только в 2 из 12 случаев было достигнуто сильное окрашивание, в то время как в большинстве случаев смогли обнаружить иммуногистологически только слабую фокальную экспрессию v6.

Задача представленного изобретения состояла в развитии новых способов лечения плоскоклеточного рака, а также в разработке средств для осуществления таких способов.

Эта задача решается предлагаемым средством для лечения плоскоклеточного рака, содержащим активное вещество и определенные конечные добавки, за счет того, что в качестве активного вещества оно содержит эффективное количество антитела или молекулы антитела, которое (которая) связывается на аминокислотной последовательности WFGNRWHEGYR.

Данное средство применяют в способе лечения плоскоклеточного рака, основывающемся на связывании молекулы антитела на эпитопе, кодируемым вариабельным экзоном v6 гена CD44 за счет того, что применяют антитело или молекулу антитела, узнающую аминокислотную последовательность WFGNRWHEGYR, который представляет собой дополнительный объект изобретения.

Согласно предпочтительной форме осуществления способа лечения плоскоклеточного рака в качестве антитела или молекулы антитела применяют моноклональное антитело BIWA-1 (VFF-18), образуемое от депонированной под DSM ACC2174 линии клеток гибридомы, или производное этого антитела.

Согласно дальнейшей предпочтительной форме осуществления способа лечения плоскоклеточного рака в качестве антитела или молекулы антитела применяют моноклональное антитело, Fab- или F(ab')₂-фрагмент иммуноглобулина, рекомбинантно полученное антитело, рекомбинантно полученное химерное или гуманизированное антитело, бифункциональное антитело или одноцепочечное производное антитела (scFv).

Еще одна предпочтительная форма осуществления способа лечения плоскоклеточного рака заключается в том, что применяют антитело или молекулу антитела, которое (которую) соединяют с радиоактивным изотопом, фотоактивируемым соединением, радиоактивным соединением, ферментом, флуоресцентным красителем, молекулой биотина, токсином, цитостатиком, пролекарством, молекулой антитела с другой специфичностью, цитокином или другим иммуномодулирующим полипептидом.

В частности, представленное изобретение относится к способу, который основывается на сильной и гомогенной экспрессии v6 при плоскоклеточном раке, которую неожиданно смогли твердо установить, вопреки теории, известной при существующем уровне техники. Молекулы антител с соответствующей специфичностью пригодны, в частности, в качестве лекарственной основы, чтобы селективно добраться in vivo до плоскоклеточного рака.

При этом предпочтителен способ, отличающийся тем, что при этом применяется молекула антитела, которая узнает аминокислотную последовательность QWFGNRWHEGYRQT, особенно предпочтительно аминокислотную последовательность WFGNRWHEGYR. Особо предпочтительно при этом моноклональное антитело BIWA-1 (клон VFF-18), которое образуется от линии клеток гибридомы, депонированной 7. 6. 1994 под DSM ACC2174 в Германской Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSM) ГмбХ, Машеродер Вег 1b, D-38124 Брауншвейг, Германия (международная заявка на патент 95/33771), или производное этого антитела.

Другой аспект представленного изобретения касается средства для осуществления способа по изобретению.

Известна нуклеотидная и аминокислотная последовательность вариантного экзона v6 гена CD44 (Screaton и др., 1992, и др., 1993). Существование дегенерированных или аллельных вариантов не имеет значения для осуществления изобретения; поэтому подобные варианты определенно включаются. Последовательность экзона v6 человеческого гена CD44 представляет из себя: Q A T P S S T T E E T A T Q ТС CAG GCA ACT CCT AGT AGT АСА ACG GAA GAA АСА GCT ACC CAG R E Q W F G N R W H E G Y R Q AAG GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA T P R E D S H S T T G T A АСА CCC AGA GAA GAC TCC CAT TCG АСА АСА GGG АСА GCT G.

Изобретение может быть осуществлено с поликлональными или моноклональными антителами, специфичными к эпитопу, который кодируется экзоном v6, в частности к эпитопу внутри аминокислотной последовательности QWFGNRWHEGYRQT, особо предпочтительно внутри аминокислотной последовательности WFGNRWHEGYR. Получение антител против известных аминокислотных последовательностей можно осуществить известными способами (Catty, 1989). Например, пептид с такой последовательностью можно получить синтетически и ввести в качестве антигена в протокол иммунизации. Другой путь включает получение составного белка, содержащего желаемую аминокислотную последовательность, таким путем, что нуклеиновая кислота (синтетическая или, например, та, которая может быть получена в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) из подходящей пробы), которая кодирует эту последовательность, интегрируется в экспрессирующий вектор, и образующийся при слиянии составной белок выражается в организме-хозяине. При необходимости очищенный составной белок может затем быть вставлен в качестве антигена в протокол иммунизации, и специфичные к вставке антитела или, в случае моноклональных антител, гибридомы, которые выражают специфичные к вставке антитела, отбираются подходящим способом. Такие способы обуславливаются уровнем техники. Heider и др. (1993, 1996а) и Koopman и др. (1993) описывают получение антител против вариантных эпитопов CD44.

Для способа согласно изобретению могут, однако, применяться также молекулы антител, которые являются производными поли- или моноклональных антител, например Fab- или F(ab')₂-фрагменты иммуноглобулинов, рекомбинантно полученное одноцепочечное производное антитела (scFv), химерное или гуманизированное антитело, а также другие молекулы, специфически связанные на эпитопе, которые кодируются экзоном v6. Из полного иммуноглобулина антитела BIWA-1 (VFF-18) или другого антитела могут, например, быть получены Fab- или F(ab')₂-фрагменты или другие фрагменты (Kreitman и др., 1993). Специалист, кроме того, в состоянии получить рекомбинантные специфические к v6 молекулы антител. В частности, он может согласно анализу аминокислотной последовательности антитела BIWA-1 (VFF-18) и/или при применении линии клеток гибридомы, которая продуцирует это антитело, особенно по содержащейся в ней генетической информации, получить рекомбинантные молекулы антител одинакового идиотипа, как, например, BIWA-1 (VFF-18), то есть молекулы антител, которые в области положения связывания антигена (определяющие комплементарность участки, КОУ) имеют такую же аминокислотную последовательность, что и антитело BIWA-1 (VFF-18). Соответствующие способы обуславливаются уровнем техники. Такие рекомбинантные молекулы антител могут, например, быть гуманизированными антителами (Shin и др., 1989; и Seemann, 1991), биспецифичными или бифункциональными антителами (Weiner и др., 1993; Goodwin, 1989, Featherstone, 1996), одноцепочечным производным антитела (scFv, Johnson и Bird, 1991), полными или фрагментарными иммуноглобулинами (Coloma и др., 1992; Nesbit и др., 1992; Barbas и др., 1992) или полученными путем перемешивания цепей антителами (Winter и др., 1994). Гуманизированные антитела могут, например, быть получены путем трансплантации КОУ (европейский патент 0239409). Также могут быть модифицированы каркасные участки (европейский патент 0519596; международная заявка на патент 9007861). Для гуманизирования антител теперь можно применять такие способы, как ПЦР (см., например, европейский патент 0368684; европейский патент 0438310; международную заявку на патент 9207075), или компьютерное моделирование (см., например международную заявку на патент 9222653). Могут также быть получены и применены составные белки, например, составной белок из одноцепочечного производного антитела и токсина (Chaudhary и др., 1990; Friedman и др., 1993). Под широкое понятие "антитело" или "молекулы антител" должны подпадать, кроме поликлональных и моноклональных антител, все обсуждаемые в этом разделе соединения, а также другие соединения, которые структурно происходят от иммуноглобулинов и получаются известными для этого способами.

В возможностях среднего специалиста находится получение сведений об эпитопе (ср. фиг. 1, фиг. 4) эквивалентного BIWA-1 (VFF-1) антитела с такой же специфичностью к связыванию. Подобные антитела поэтому также включены в изобретение.

Данное изобретение можно также использовать при диагностировании молекулы антител, предпочтительно молекулы антитела BIWA-1, их фрагменты или рекомбинантные молекулы антител с подобным идиотипом, могут соединяться, например, с радиоактивными изотопами, как, например, ¹²⁵J, ¹³¹J, ¹¹¹In, ^99mТc, или с радиоактивными соединениями (Larson и др., 1991; Thomas и др., 1989; Srivastava, 1989), с ферментами, например пероксидазой или щелочной фосфатазой (Catty и Raykundalia, 1989), с флуоресцентными красителями (Johnson, 1989) или с молекулами биотина (Guesdon и др., 1979). Для терапевтического применения специфичные к v6 молекулы антител, предпочтительно молекулы антитела BIWA-1 (VFF-18) или молекулы производного от VFF-18 антитела, например его фрагменты или рекомбинантные молекулы антитела с подобным идиотипом, могут связываться с радиоактивными изотопами, например, ⁹⁰Y, ¹³¹J, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ¹⁷⁷Lu (Quadri и др., 1993; Lenhard и др., 1985; Vriesendorp и др., 1991; Wilbur и др., 1989, Maraveyas и др., 1995а, Jurcic и Scheinberg, 1994), с токсинами (Vitetta и др., 1991; Vitetta и Тhогре, 1991; Kreitman и др., 1993; Theuer и др., 1993), с цитостатиками (Schrappe и др. , 1992), с пролекарствами (Wang и др., 1992; Senter и др., 1989), с фотоактивируемыми веществами (Hemming и др., 1993), с молекулой антитела с другой специфичностью или с радиоактивными соединениями. Молекула антитела может далее соединяться с цитокином или другим иммуномодулирующим полипептидом, например с фактором некроза опухоли, лимфотоксином (Reisfeld и др. , 1996) или интерлейкином-2 (Becker и др., 1996). Молекулы антител для вставки в систему преднацеливания могут быть также модифицированы, например, с помощью стрептавидина или биотина (Goodwin, 1995).

Полезно, чтобы можно было в соответствии с данным способом диагностики исследовать взятые у больных пробы, например из биопсий, по которым устанавливают наличие достаточных данных для диагностирования плоскоклеточного рака или уже ставится диагноз, чтобы достаточно подробно охарактеризовать опухоль. Обнаружение вариантных молекул CD44, содержащих аминокислотную последовательность, кодируемую вариабельным экзоном v6, можно осуществить на поверхности белка с помощью антител или на поверхности нуклеиновой кислоты с помощью специфических зондов нуклеиновых кислот или затравок для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Изобретение относится, следовательно, к молекулам антител и нуклеиновым кислотам, которые годятся в качестве зондов или затравок для таких способов, и к применению таких антител и нуклеиновых кислот для диагностики и анализа плоскоклеточного рака. Например, срезы тканей могут быть исследованы иммуногистохимически с помощью антител известными для этого способами. Полученные из проб тканей экстракты или содержащиеся в организме жидкости могут далее быть исследованы другими иммунологическими способами с использованием антител, например Вестерн-блоттингом, с помощью ферментных иммуносорбентных анализов (ELISA-тест, Catty и Raykundalia, 1989), радиоиммунных анализов (RIA, Catty и Murphy, 1989) или применяемых иммунных анализов. Исследования могут проводиться качественно, полуколичественно или количественно.

Наряду с диагностикой in vitro молекулы антител со специфичностью согласно изобретению годятся также для in vivo диагностики плоскоклеточного рака. Если молекула антитела имеет детектируемую метку, можно осуществить определение метки для диагностических целей, например для визуального обнаружения опухоли in vivo (получение изображения), или, например, для радионаправленной хирургии. Для применения конъюгированных с радиоактивными изотопами антител для иммунной сцинтиграфии (получение изображения) имеется, например, ряд протоколов, на основании которых специалист может осуществить изобретение (Siccardi и др., 1989; Keenan и др., 1987; Perkins и Pimm, 1992; Colcher и др., 1987; Thompson и др., 1984).

Данные, полученные путем обнаружения и/или количественной оценки экспрессии вариантного эпитопа v6 CD44, могут, таким образом, использоваться для постановки диагноза и прогноза. При этом может быть полезна комбинация с другими прогностическими параметрами, например со степенью развития опухоли.

Молекулы антител со специфичностью по изобретению и при необходимости связанные с цитотоксическим агентом могут с пользой применяться для лечения плоскоклеточного рака. При этом применение может быть осуществлено системно или топически, например путем внутривенной (болюсное или длительное вливание), внутрибрюшинной, внутримышечной, подкожной или другой инъекции/вливания. Протоколы введения конъюгированных или неконъюгированных антител (таких как полные иммуноглобулины, фрагменты, рекомбинантные гуманизированные молекулы или другие) составляют основу техники (Mulshine и др., 1991; Larsonn др., 1991; Vitetta и Thorpe, 1991; Vitetta и др., 1991; Breitz и др., 1992. 1995; Press и др. , 1989; Weiner и др., 1989; Chatal и др., 1989; Sears и др., 1982). Терапевтическое применение можно, например, осуществить аналогично применению антитела 1.1 ASML (Setter и др., 1993). Немодифицированные моноклональные антитела могут быть вставлены непосредственно при лечении, когда они обнаруживают подходящую для цитотоксического действия внутреннюю эффекторную функцию, например для индуцированной комплементом или индуцированной антителом клеточной цитотоксичности ( и др., 1994). Подходящими моноклональными антителами для такого применения являются мышиное антитело изотипа IgG2a или антитело человеческого типа IgGl. Немодифицированные антитела могут далее использоваться для индукции противоопухолевой реакции, свойственной больному, по антиидиотипическому механизму (Baum и др. , 1993; Khazaeli и др., 1994).

Предпочтительный вариант осуществления изобретения с точки зрения использования для лечения состоит в том, чтобы гуманизированный специфичный к v6 иммуноглобулин или его F(ab')₂-фрагмент связать с ⁹⁰Y (Quadri и др., 1993; Vriesendorp и др., 1995), ¹³¹J (Maraveyas и др.. 1995а, 1995b; Juweid и др., 1995; Press и др., 1995; Thomas и др., в сборнике: Catty 1985. с. 230-239), ¹⁸⁶Re (Breitz и др., 1992, 1995) или с другим подходящим радиоактивным изотопом и ввести для радиоиммунотерапии плоскоклеточного рака. Например, антитело BIWA-1, или гуманизированная версия BIWA-1, или F(ab')₂-фрагмент BIWA-1, или гуманизированного антитела может связываться с ⁹⁰Y при применении хелатообразующего линкера, как изотиоцианатбензил-диэтилентриаминпентаацетат (ИТЦБ-ДТПА), причем должна быть достигнута удельная активность в 5-20 мКи/мг, предпочтительно 10 мКи/мг. Этот агент может затем вводиться больному с позитивной к антигену опухолью в дозировке от 0,1 до 1 мКи/кг массы тела, предпочтительно от 0,3 до 0,5 мКи/ кг массы тела. Если молекула антитела связана с ¹³¹J, при удельной активности 2 мКи/мг возможна подходящая схема дозировок, например, 2•150 мКи в течение периода в 6 недель. Специалист с помощью известных способов может установить максимально возможные дозировки (Maraveyas и др., 1995а, 1995b). При общем количестве предназначенного для введения белка от 2 до 5 мг введение может осуществляться в виде быстрой внутривенной болюсной инъекции. При больших количествах белка вливание может производиться в удобной для введения форме. В случае моноклональных антител может быть необходимым, чтобы агент перед введением смешивали с избытком (например, с 10-кратным молярным избытком) нерадиоактивного антитела; в этом случае лучше осуществлять введение в виде внутривенного вливания, например, свыше 15 минут. Введение может быть повторено. Лечение можно сочетать с наружной лучевой терапией. Далее лечение может быть подкреплено пересадкой костного мозга; это особенно необходимо тогда, когда при лечении доза более чем 1,6 грей поступает в костный мозг.

Молекулы антител согласно изобретению могут также применяться ex vivo для очистки от позитивных к CD34 препаратов клеточных линий и препаратов клеток предшественников (иммунная очистка). Лучевая терапия или хемотерапия плоскоклеточного рака могут быть подкреплены аутологичной пересадкой костного мозга. Используемый при этом препарат кроветворных линий клеток и клеток предшественников не должен содержать опухолевых клеток. Это может быть достигнуто путем инкубирования с молекулами антител согласно изобретению, например, конъюгатов антитело-токсин (Myklebust и др., 1994; патент Германии 19648209.7).

Молекулы антител согласно изобретению могут далее вводиться в виде рекомбинантной конструкции в Т-клеточный рецептор Т-лимфоцитов. Такие репрограммированные Т-лимфоциты связываются селективно на выражающих антиген опухолевых клетках и проявляют цитотоксическое действие, таким образом, они могут применяться для лечения плоскоклеточного рака (РСТ/ЕР 9604631; Altenschmidt и др., 1996).

Графические материалы Фиг. 1. Определение специфичности к эпитопу антитела BIWA-1 путем связывания на синтетических пептидах, происходящих от последовательности человеческого CD44v6.

Соответствующий пептид CD44v6 крыс испытывали с антителом 1.1 ASML. Связывание определяли с помощью ELISA-теста, причем пептиды были иммобилизованы на планшетах для титрования (для сравнения, Heider и др., 1996Ь, фиг. 2). -: нет связывания, +/-: слабое связывание, +: сильное связывание.

Фиг. 2. Иммуногистохимические анализы плоскоклеточного рака гортани (а) и метастаза в печень рака пищевода (б) с помощью специфичного к CD44v6 моноклинального антитела BIWA-1.

В обоих случаях можно наблюдать реактивность антитела в отношении мембраны опухолевых клеток. Первоначальное увеличение 40х, дополнительное окрашивание гематоксилином.

Фиг. 3. Сравнение связывания антигена различных специфичных к CD44v6 моноклональных антител.

Связывание четырех различных специфичных к CD44v6 моноклональных антител на человеческих клетках А-431 плоскоклеточного рака измеряли с помощью ELISA-теста. Моноклональное антитело BIWA-1 демонстрирует более высокое сродство к опухолевым клеткам, чем другие моноклональные антитела.

Фиг. 4. Рафинированное картирование эпитопа моноклонального антитела BIWA-1.

Связывание BIWA-1 на различных перекрывающихся синтетических пептидах, охватывающих аминокислоты 18-32 кодируемого CD44v6 участка, измеряли в конкурентном ELISA-тесте. Подчеркнута минимальная последовательность связывания (пептид v6(19-29)).

Фиг. 5. Биораспределение меченного ¹²⁵J BIWA-1 у безволосых мышей, подвергшихся ксеногенной трансплантации А-431.

Аккумулирование антитела устанавливается как % инъецируемой дозы (ИГ)/г (среднее значение ± стандартная ошибка измерения) через 4, 24, 48, 120 и 168 часов после инъекции.

Примеры Пример 1. Экспрессия CD44v6 при плоскоклеточном раке Ткань
В общей сложности в 126 случаях анализировали иммуногистохимически запарафинированные опухолевые пробы с помощью моноклонального антитела BIWA-1 (клон VFF-18) на экспрессию CD44v6. В 31 случае пробы включали первичный плоскоклеточный рак (в 15 случаях гортани, в 16 случаях кожи), в 91 случае включали метастазы в лимфатические узлы (гортань, n=38; легкое, n=27; пищевод, n= 11; полость рта, n=11; миндалины, n=4) и в 4 случаях включали метастазы в печень (пищевод).

Антитело
Общий вариантный участок НРКП-типа CD44v (Hofmarm и др., 1991) был амплифицирован путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) из кДНК человеческих кератиноцитов. Обе затравки ПЦР 5'-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3', положения 25-52. и 5'-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3'. положения 1013-984 вариантного участка LCLC97, как описано Hofmann и др., содержали сайт узнавания рестриктазой EcoRI, который использовался, чтобы непосредственно клонировать продукт ПЦР в вектор pGEX-2T (Smith и др., 1988). Получающаяся в результате конструкция (pGEX CD44v HPKII, v3-vl0) кодирует составной белок с молекулярной массой около 70 кДа, состоящий из глутатион-S-трансферазы Schistosoma japonicum и экзонов v3-v10 человеческого СD44 (фиг. 1; Heider и др., 1993). Составной белок выражали в Е.соli и затем подвергали очистке с помощью аффинной хроматографии на глутатион-агарозе (Smith и др., 1988).

Самок мышей Balb/c иммунизировали внутрибрюшинно очищенным аффинной хроматографией составным белком по следующей схеме:
1. иммунизация: 90 мкг составного белка в полном адъюванте Фрейнда;
2. и 3. иммунизации: 50 мкг составного белка в полном адъюванте Фрейнда.

Иммунизации осуществляли с интервалом в 4 недели. Через 14 дней после последней иммунизации животных еще раз иммунизировали в течение трех последующих дней каждый раз 10 мкг составного белка в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР). На следующий после этого день клетки селезенки одного животного с высоким титром антител подвергали слиянию с мышиными миеломными клетками Р3.Х63-Ag8.653 с помощью полиэтиленгликоля 4000. Клетки гибридомы затем подвергали селекции на планшетах для титрования в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ) ( и Milstein, 1975; Keamey и др., 1979).

Определение титра антител в сыворотке или скрининг гибридом проводили с помощью ELISA-теста. В таком тесте планшеты для титрования сначала покрывали составным белком (глутатион-S-трансфераза - CD44v3-10) или только глутатион-S-трансферазой. Затем инкубировали с серийными разведениями сывороточных проб или гибридом и определяли специфические антитела с помощью конъюгированных с пероксидазой антител против мышиного иммуноглобулина. Гибридомы, которые реагировали только с глутатион-S-трансферазой, отбрасывались. Оставшиеся антитела сначала охарактеризовывали в ELISA-тесте с помощью специфичных к домену составных белков (экзон v3, экзон v5+v6, экзон v6+v7, экзон v8-v10) (Koopman и др., 1993). Их иммуногистохимическую реактивность испытывали на срезах кожи человека.

BIWA-1 (VFF-18; о получении и свойствах см. также в международной заявке на патент 95/33771) связывалось только на составных белках, содержащих домен, который кодировался экзоном v6. Чтобы далее установить границу эпитопа антитела, в ELISA-тесте были использованы различные синтетические пептиды, которые представляют части домена v6 (фиг. 1). Пептид из 14 аминокислот, v6D, продемонстрировал самое сильное связывание. Следовательно, эпитоп BIWA-1 лежит полностью или частично внутри последовательности QWFGNRWHEGYRQT домена, который кодируется экзоном v6. Эта последовательность гомологична эпитопу связывания антитела 1.1 ASML, которое было применено в терапевтической крысиной модели и которое специфично к крысиному CD44v6 (фиг. 1).

Иммуногистохимия
Перед инкубированием с первичным антителом парафиновые срезы (4 мкм) депарафинировали во вращающемся приспособлении для гистологических исследований (фирма Рот, Германия) три раза, каждый раз по 10 минут, и затем регидрировали в высших спиртах. Срезы быстро промывали дистиллированной водой и затем кипятили в микроволновой печи (модель Шарп R-6270) трижды по 10 минут при 600 Вт в 0,01 М буфере, содержащем лимонную кислоту - цитрат натрия. После каждого инкубирования в микроволновой печи срезы охлаждали 20 минут. После последнего охлаждения носитель промывали в ЗФР и прединкубировали с нормальной козьей сывороткой (10% в ЗФР). После трех промывок в ЗФР срезы инкубировали в течение часа с первичным антителом (BIWA-1: 5 мкг/мл; мышиный IgG (соответствующий изотипу отрицательный контроль) 5 мкг/мл в ЗФР/1% бычьем сывороточном альбумине /БСА/). В качестве положительного контроля для цветной реакции использовали нормальные человеческие срезы кожи, так как кератиноциты выражают изоформу CD44, содержащую v3-v10. Эндогенные пероксидазы блокированы 0,3% перекисью водорода в ЗФР, и срезы инкубировали в течение 30 минут с биотинилированным вторичным антителом (противомышиный IgG-F(ab')₂, корпорация ДАКО). Для развития окраски срезы инкубировали 30 минут с пероксидазой хрена, которая связывалась на биотине в комплекс стрептавидин-биотин-пероксидаза (корпорация ДАКО). Затем срезы инкубировали 5-10 минут в 3,3-диамино-9-этилкарбазольном субстрате (фирма Сигма Иммунокемикалс), реакцию останавливали прибавлением воды и срезы дополнительно окрашивали гематоксилином. Оценку окрашивания проводили с помощью аксиоскопического светового микроскопа Цейсса, интенсивность окрашивания количественно оценивали следующим образом: "+++" - сильная экспрессия; "++" - умеренная экспрессия; "+" слабая экспрессия; "-" - не детектируемая однозначно экспрессия или отсутствие детектируемой экспрессии. Только опухолевые клетки с четким окрашиванием мембраны оценивались как позитивные. Процент позитивных опухолевых клеток приближенно оценивали в каждом срезе и были сформированы две группы: фокально позитивные опухоли (менее 10% опухолевых клеток реагировали с антителом) и позитивные опухоли (10 или более % опухолевых клеток позитивны). Когда менее 80% опухолевых клеток в позитивных клетках реагировали с антителом, получали соответствующее значение в процентах.

С помощью специфичного к CD44v6 моноклонального антитела BIWA-1 анализировали 126 случаев плоскоклеточного рака различного происхождения. Экспрессия содержащих CD44v6 изоформ наблюдалась во всех, кроме одной, опухолевых пробах. Большая часть проб показала экспрессию антигена на 80-100% опухолевых клеток, окрашивание ограничивалось мембраной опухолевых клеток. Никакой реакции не наблюдали в случае относящейся к строме ткани, лимфоцитов, мышечных клеток или эндотелия.

Для количественной оценки экспрессии молекул CD44v6 на этих опухолевых клетках окрашивали срезы нормальной кожи человека параллельно со срезами опухолей. Нормальные кератиноциты кожи выражают высокий уровень изоформ CD44 и считаются сильнее всего выражающими CD44v6 нормальными клетками, которые описаны на сегодняшний день. Поэтому окраска кератиноцитов была принята за эталон и классифицирована как "сильная" (+++) в примененной системе оценки. В большинстве исследованных опухолевых проб окраска опухолевых клеток была сравнима или даже сильнее окраски кератиноцитов кожи, только в немногих случаях наблюдалась слабая окраска опухоли (3 случая метастазов в лимфатические узлы) или умеренная (2 первичных рака, 10 метастазов). Реакция окрашивания была абсолютно гомогенной внутри определенного опухолевого среза, причем большинство опухолевых клеток среза имели одинаковую интенсивность окраски. В экспрессионном образце CD44v6 не наблюдали никаких существенных различий между первичными опухолями и метастазами. Подробные подытоженные результаты приведены в табл. 1, примеры представлены на фиг. 2.

Позитивно реагировали с BIWA-1 80-100% опухолевых клеток. В случаях, когда меньшее количество опухолевых клеток реагировало с антителом, указано соответствующее число процентов.

Пример 2. Экспрессия CD44v6 при раке почки, раке простаты и метастазах в печень при раке толстого кишечника.

Ткань
Анализировали 19 случаев рака почки (12 случаев светлоклеточного рака, 5 случаев хромофильного, 1 случай хромофобного, 1 онкоцитома), 16 случаев первичной аденокарциномы простаты и 19 случаев метастазов в лимфатические узлы при раке толстого кишечника.

Антитело BIWA-1 (см. пример 1).

Иммуногистохимия
Для проведения исследования см. пример 1.

В отличие от плоскоклеточного рака в большинстве изученных случаев рака почки и простаты не могла быть обнаружена какая-либо экспрессия или обнаруживали только фокальную экспрессию изоформ CD44v6. В случае экспрессии, большей, чем фокальная, при раке простаты окрашивание было преимущественно диффузным цитоплазматическим и слабым или гетерогенным по сравнению с окраской нормального эпителия простаты. В 50% исследованных метастазов в печень при раке толстого кишечника обнаруживалась большая, чем фокальная экспрессия изоформ CD44v6. Окраска в большинстве случаев была от слабой до средней, причем в большинстве случаев менее 100% опухолевых клеток пробы продемонстрировали окраску с BIWA-1. Результаты подытожены в табл. 2.

Пример 3. Характеристика специфичных к CD44v6 антител
Линия клеток
Линия клеток А-431 плоскоклеточного рака человека (спонтанный эпидермоидный рак вульвы) была получена в Американской Коллекции типовых культур (Rockwell MD) и культивировалась согласно указаниям изготовителя. Поверхностную экспрессию содержащих CD44v6 изоформ определяли при анализе с помощью установки для сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS-анализ), причем использовали моноклональное антитело BIWA-1, соединенное с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).

Анализ кинетических констант
Определение сродства и кинетики взаимодействия моноклонального антитела и CD44v6 было проведено с помощью поверхностного плазменного резонанса (ППР), причем была использована система BIAcore 2000 (фирма Фармация Байесенсор). Составной белок, включающий глутатион-S-трансферазу и CD44, который содержал участок, кодируемый экзонами v3-v10 (глутатион-S-трансфераза/CD44 v3-v10), был иммобилизован на сенсорном чипе СМ5, причем был использован способ сочетания с амином согласно указаниям производителя. Антитело в различных концентрациях (8-132нМ) в буфере HBS (10 мМ N-(2-гидpoкcи)этилпипepaзин-N'-2-этaнcyльфoнoвaя кислота, рН 7,4, 150 мМ хлорид натрия, 3,4 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота /ЭДТК/, 0,05% поверхностно-активное вещество Р20 BIAcore) инъецировали через специфичную к антигену поверхность при скорости тока 5 мкл/мин. Взаимодействие рассчитывали по изменению сигнала ППР. Диссоциацию антитела наблюдали в течение 5 минут в токе буфера (HBS). Поверхность чипа регенерировали с помощью отдельного импульса в 15 мкл 30 мМ соляной кислоты. Анализ данных и расчет кинетических констант проводили с помощью программного обеспечения для оценки BIA (фирма Фармация Байесенсор), версия 2.1.

Таким способом сравнивали сродство к антигену моноклонального антитела BIWA-1 и других специфичных к CD44v6 моноклональных антител (VFF4, VFF7, ВВА-13 (IgGl, системы R&D, Абиндон, Англия)). Кинетические константы и константы сродства различных антител определяли в каждом случае в двух независимых экспериментах. В табл. 3 приведены значения скоростей ассоциации (k_a), скоростей диссоциации (k_d) и констант диссоциации (K_d) для четырех моноклональных антител. Все моноклональные антитела имели сходные k_a и k_d за исключением ВВА-13, которое имело в 3 раза меньшую k_a, и VFF7, которое показало значительно более высокую скорость диссоциации (фактор 5) по сравнению с другими моноклональными антителами. Это приводит в результате к пониженному сродству к связыванию для VFF7 и ВВА-13 по сравнению с VFF4 и BIWA-1. Антитело BIWA-1 имеет самую низкую K_d из всех исследованных антител.

Анализ взаимодействия антитело-белок с помощью ELISA-теста
Выражающие CD44v6 клетки А-431 культивировали в 96-ячеечных планшетах (фирма Фалкон Микротест III, Бектон Дикинсон, Линкольн Парк, Нью-Джерси) по 5•10⁴ клеток в ячейке в среде RPMI 1640 с 10% околоплодной сывороткой теленка (ОСТ) в течение ночи при 37^oС. После промывки ЗФР/ 0,05% твином 20 клетки фиксировали охлажденным до 0^oС этиловым спиртом в течение 1 минуты, после чего промывали. Инкубирование с первичными антителами (VFF4, VFF7, BIWA-1, ВВА-13, 1 нг/мл - 600 нг/мл, в каждом случае в буфере для испытания: ЗФР/0,5% БСА/0,05% твин 20) проводили в течение 1 часа при комнатной температуре и затем трижды промывали. В качестве вторичного антитела использовали кроличье конъюгированное с пероксидазой хрена антитело против мышиного IgG (корпорация ДАКО, Копенгаген, Дания; разведение 1:6000 в буфере для испытания) (1 час при комнатной температуре). После трех промывок окрашивали с помощью раствора тимолового синего (фирма Киркегаард + Перри, Гайтерсбург, США). Экстинкцию измеряли с помощью считывающего устройства фирмы Хьюлетт-Паккард. используемого в ELISA-тесте.

На фиг. 3 показано, что относительное сродство антител, как это было определено путем BIAcore - анализа, отражается в их взаимодействии с опухолевыми клетками, причем BIWA-1 четко демонстрирует наивысшее сродство к связыванию.

Домен белка, кодируемый экзоном v6 гена CD44, состоит из 45 аминокислот (фиг. 4). Чтобы точно определить эпитоп, который узнается BIWA-1, в ELISA-испытаниях использовали серию синтетических пептидов. Предварительные эксперименты свидетельствуют о связывании на расположенном в центре 14 - мере (аминокислотные остатки 18-31; фиг. 4, ср. также фиг. 1), а не на пептиде вне этого участка. Поэтому была синтезирована вторая серия пептидов и исследована в конкурентных ELISA-тестах (фиг. 4). Результаты показывают, что пептид 19-29 (WFGNRWHEGYR) представляет минимальную структуру, требующуюся для высокоаффинного связывания. Элиминирование С-концевого аргининового остатка приводит к более чем в 100 раз слабому связыванию.

Пример 4. Биораспределение меченного радиоактивным иодом антитела к CD44v6 у безволосых мышей с ксенотрансплантатом
Модель ксенотрансплантата А-431
Восьминедельным самкам безволосых мышей Balb/c nu/nu (фирма В & К Юниверсал, Рентон, Западная Африка) инъецировали подкожно в левостороннюю среднюю линии 5•10⁶ культивированных клеток А-431 (человеческий эпидермоидный рак вульвы). Животных после ксенотрансплантации, имевших опухоли А-431, использовали в течение двух недель в экспериментах по биораспределению (масса опухоли 40-50 мг).

Введение радиоактивного иода в BIWA-1
Белок G - очищенное моноклональное тело BIWA-1 (мышиный IgGl) связывали на стрептавидине, причем использовали гетеробифункциональный поперечный сшиватель, сукцинимидильный эфир 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Лизильные остатки стрептавидина связывали на востановленных цистеинильных остатках антитела, которые получались при предварительной обработке антитела дитиотреитом. Полученные конъюгаты (1:1) (>90%) далее очищали с помощью ионообменной хроматографии. Для экспериментов по биораспределению BIWA-1/ стрептавидин метили ¹²⁵J по первичной аминогруппе лизина, причем для введения метки использовали п-иодфенильный реагент (ПИФ, фирма НЕН Дюпон, Вилмингтон, Германия), следуя способу Willbur и др. (1989). Маркировка BIWA-1 стрептавидином или ¹²⁵J не меняла иммунореактивности или фармакокинетики антитела у мышей.

Эксперименты по биораспределению
Безволосых мышей, которые подверглись ксенотрансплантации человеческими опухолями А-431, инъецировали внутривенно через латеральную хвостовую вену 5-7 мкКи ¹²⁵J на 50 мкг моноклонального антитела BIWA-1 (удельная активность 0,1-0,14 мКи/мг). Изучение биораспределения в зависимости от времени проводили в группах из 3 животных (n=3) через 4, 24, 48, 120 и 168 часов после инъекции. В выбранные временные моменты мышей усыпляли, обескровливали через ретроорбитальное сплетение и умерщвляли путем декапитации. Собирали девять органов и тканей и измельчали, к ним относятся кровь, хвост, легкое, печень, селезенка, желудок, почки, кишечник и опухоль. Радиоактивность в тканях рассчитывали по сравнению со стандартом инъецированного препарата антитела в гаммасцинтилляционном счетчике (фирма Паккард Инстремент Компани, Мериден, Коннектикут), причем энергетическое окошко счетчика устанавливалось на 25-80 кэ-В для ¹²⁵J. Рассчитывали процент инъецированной дозы/г ткани (% ИД/г).

Предварительные эксперименты показали, что BIWA-1 не реагирует перекрестно с мышиным антигеном CD44v6. В табл. 4 и на фиг. 5 показано поглощение радиоактивности в опухолях и нормальной ткани. В случае иодированного BIWA-1 наблюдалось быстрое поглощение опухолью (7,6% ИД/г к 4 часам после инъекции), которое увеличивалось до более 18% ИД/г к 48 часам и затем оставалось постоянным до 120 часов. Через 7 дней после инъекции (168 часов) опухоль содержала еще 15,3% ИД/г ткани. Пропорции опухоль: ткань были посчитаны на отдельные моменты времени и приведены в табл. 4. Через 24 часа после инъекции пропорция опухоль: кровь составляла 0,48 и поднялась до 3,16 на седьмой день. Поглощение в нормальной ткани было низким и скорее всего вызывалось фоновым значением кровяного пула в биопсийной ткани. При селективном нацеливании in vivo ксенотрансплантатов плоскоклеточного рака человека безволосым мышам показано с помощью меченного ¹²⁵J BIWA-1, что моноклональное антитело имеет высокий потенциал как нацеливающий носитель для диагностического и терапевтического применения у больных плоскоклеточным раком.

Пример 5. Различная экспрессия CD44v6 для большого числа опухолей человека
В другом исследовании изучали иммуногистохимически в общей сложности 544 опухолевые пробы с помощью моноклонального антитела BIWA-1 (клон VFF-18) на экспрессию CD44v6. Пробы либо
парафинировали, либо сразу после хирургического взятия замораживали в жидком азоте и хранили до использования при -70^oС. Анализировали следующие опухоли: базалиомы (n= 16), аденокарциномы (АК) молочной железы (n=55), АК толстой кишки (n= 83), плоскоклеточный рак (ПКР) головы и шеи (n=125), рак легкого (n= 120), АК простаты (n=34), рак почки (n=27), ПКР кожи (n=15) и АК желудка (n= 69). Ткани получали путем обычного хирургического вмешательства или путем взятия биопсии, получение нормальной ткани сопутствовало получению опухолевых проб. Иммуногистохимическое исследование проводили, как в примере 1.

В табл. 5 представлен обзор, касающийся иммуногистохимического анализа 397 различных опухолевых проб с помощью моноклонального антитела BIWA-1.

При мелкоклеточном раке легкого, раке почки и АК простаты не наблюдали или наблюдали только незначительную реактивность. Все другие исследованные типы опухолей выражали содержащие CD44v6 изоформы в различных количествах. Большинство исследованных АК молочной железы показало реактивность с BIWA-1, а исследованные типы ПКР (гортани, легкого и пищевода) выражали CD44v6 в 100% случаев.

Всего было исследовано 185 случаев ПКР различных типов и различной классификации на реактивность с BIWA-1. Это были 67 случаев первичного ПКР (гортани, n=15; полости рта, n=16; ротоглотки, n=3; кожи, n=15), 77 проб метастазов в лимфатические узлы (гортань, n=12; легкое, n=27; пищевод, n=11; полость рта, n=6; ротоглотка, n=7; гортаноглотка, n=10; миндалина, n=4) и 3 пробы из метастазов в печень (пищевод). В табл. 6 приводятся результаты иммуногистохимического анализа всех исследованных проб ПКР.

Экспрессия содержащих CD44v6 изоформ была обнаружена во всех, кроме трех, опухолевых пробах (один случай гортань, 2 случая легкое). Большинство проб показало экспрессию антигена на 80-100% опухолевых клеток внутри одного отдельного среза, причем окраска преимущественно концентрировалась на мембране опухолевых клеток. Сильнее всего окрашенный однородный образец наблюдали в случае рака гортани, пищевода и гортаноглотки, причем большинство опухолевых клеток среза имели одинаковую интенсивность окраски. Протокол последовательностей представлен в конце описания.

Формула изобретения

1. Средство для лечения плоскоклеточного рака, содержащее активное вещество и определенные конечные добавки, отличающееся тем, что в качестве активного вещества оно содержит эффективное количество антитела или молекулы антитела, которое (которая) связывается на аминокислотной последовательности WFGNRWHEGYR.

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно в качестве антитела или молекулы антитела содержит моноклональное антитело BIWA-1(VFF-18), образующееся от линии клеток гибридомы, депонированной под DSM АСС2174, или производное этого антитела.

3. Средство по одному из п. 1 или 2, отличающееся тем, что оно в качестве антитела или молекулы антитела содержит моноклональное антитело, Fab- или F(ab')₂-фрагмент иммуноглобулина, рекомбинантно полученное антитело, рекомбинантно полученное химерное или гуманизированное антитело, бифункциональное антитело или одноцепочечное производное антитела (scFv).

4. Средство по одному из пп. 1 - 3, отличающееся тем, что оно содержит антитело или молекулу антитела, которое (которая) соединяется с радиоактивным изотопом, фотоактивируемым соединением, радиоактивным соединением, ферментом, флуоресцентным красителем, молекулой биотина, токсином, цитостатиком, пролекарством, молекулой антитела с другой специфичностью, цитокином или другим иммуномодулирующим полипептидом.

5. Способ лечения плоскоклеточного рака, основывающийся на связывании молекулы антитела на эпитопе, кодируемым вариабельным экзоном v6 гена CD44, отличающийся тем, что применяют антитело или молекулу антитела, узнающую аминокислотную последовательность WFGNRWHEGYR.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что в качестве антитела или молекулы антитела применяют моноклональное антитело BIWA-1 (VFF-18), образуемое от депонированной под DSM ACC2174 линии клеток гибридомы, или производное этого антитела.

7. Способ по одному из пп. 5 и 6, отличающийся тем, что в качестве антитела или молекулы антитела применяют моноклональное антитело, Fab- или F(ab')₂-фрагмент иммуноглобулина, рекомбинантно полученное антитело, рекомбинантно полученное химерное или гуманизированное антитело, бифункциональное антитело или одноцепочечное производное антитела (scFv).

8. Способ по одному из пп. 5 - 7, отличающийся тем, что применяют антитело или молекулу антитела, которое (которую) соединяют с радиоактивным изотопом, фотоактивируемым соединением, радиоактивным соединением, ферментом, флуоресцентным красителем, молекулой биотина, токсином, цитостатиком, пролекарством, молекулой антитела с другой специфичностью, цитокином или другим иммуномодулирующим полипептидом.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40