Металлоценовые производные сахаров и содержащее их средство для активации киллинга микроорганизмов, локализованных внутриклеточно

 

Изобретение относится к производным сахаров общей формулы (1), где n= 1-6, остаток (2) - сахаридный радикал, содержащий в качестве концевого невосстанавливающего сахара, связанного в положении С-1 углерод, маннозу или фукозу, или N-ацетилглюкозамин; Y - мостиковая группа, представляющая собой алифатический углеводород с числом углеродных атомов в цепи от 1 до 6, ковалентно связанный с сахаридным радикалом в положении С-1 углерод посредством простой эфирной связи или через группу -С(O)- и связанный с металлоценом посредством сложноэфирной связи или через группу -NH-C(O)-; СрМе - металлоцен. Соединения по изобретению обладают противоинфекционной активностью. Также предложено средство для активации киллинга микроорганизмов, локализованных внутриклеточно, содержащее в качестве активного ингредиента соединение формулы (1). 2 с. и 2 з.п.ф-лы, 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым металлоценовым производным сахаров, обладающим противоинфекционной активностью в отношении внутриклеточно локализованных возбудителей, и может найти применение в медицине.

Несмотря на то, что современная медицина располагает большим арсеналом средств для борьбы с инфекционными болезнями, продолжается активный поиск новых путей и подходов к решению проблемы противоинфекционной защиты. Стимулирующим фактором такого поиска является наличие целого ряда недостатков у вошедших в клиническую практику противоинфекционных препаратов (антибиотиков, иммунотерапевтических средств и прочее), а также весьма ограниченные возможности для проведения фармакотерапии инфекционных заболеваний, вызываемых возбудителями, способными размножаться внутриклеточно (грибковые, протозойные, паразитные инфекции).

Одним из перспективных направлений при решении проблемы противоинфекционной защиты, особенно в отношении возбудителей с внутриклеточной локализацией, является поиск и синтез химических соединений, обеспечивающих специфическое воздействие на внутриклеточные механизмы киллинга у соответствующих компетентных клеток макроорганизма, в частности у фагоцитов.

Известно, что одним из важнейших бактерицидных механизмов, с помощью которого реализуется киллинг микроорганизмов, является так называемый кислородный взрыв, то есть резкое возрастание потребления кислорода фагоцитирующими клетками. Нарастание метаболизма кислорода идет по пути глюкозомонофосфатного шунта и сопровождается образованием супероксиданионных радикалов, инициирующих цепь свободнорадикальных реакций с участием ферментов фаголизосомального комплекса (пероксидаз), в результате которых образуются перекись водорода, а также галогеновые и гидроксильные радикалы, которые обладают высокой микробицидной активностью.

Вышеописанный механизм киллинга реализуется естественным образом при поглощении микроорганизмов фагоцитами, однако в ряде случаев, например при нарушении гомеостаза конкретного организма, при внедрении в клетку определенных видов возбудителей инфекции (грибов, простейших и прочее) процессы свободнорадикального окисления в фагоцитах оказываются слабо выраженными или совсем подавлены.

Интенсификация рассматриваемых процессов может быть достигнута путем воздействия на ферментативные системы фагоцитоза специальными агентами, в частности иммуномодуляторами, например тимусными пептидами и их аналогами, однако указанные препараты имеют низкую специфичность.

В настоящее время известны некоторые результаты исследований в отношении соединений, способных интенсифицировать процессы свободнорадикального окисления путем специфического воздействия непосредственно на ферментную систему фаголизосомального комплекса фагоцитов. Такие соединения могли бы обеспечить значительный прогресс в создании эффективных средств противоинфекционной защиты в отношении внутриклеточных патогенов. Так, в частности, обнаружено [ж. Infection and Immunity, 1995, vol.63. N 8, р.3042-3047], что введение рекомбинантной миелопероксидазы в макрофаги, инфицированные клетками Е.coli K-12, активирует внутриклеточный киллинг указанных микроорганизмов за счет интенсификации процессов свободнорадикального окисления внутри клетки. Однако микробицидный эффект проявляется и при прямом воздействии рекомбинантной миелопероксидазы на испытуемые микроорганизмы, что говорит о недостаточно высокой специфичности данного препарата.

Естественно, что для обеспечения высокой специфичности действия агента на ферментативную систему фагоцита необходимо не только найти агент с требуемыми свойствами, но и обеспечить его адресную доставку в фаголизосомальную структуру фагоцита.

В настоящее время разработаны подходы к решению проблемы специфичной внутриклеточной доставки биологически активных веществ (БАВ) путем конструирования молекулярной системы, включающей три функционально-значимых фрагмента: собственно БАВ (фармакофор), мостиковую группу (спейсер) и транспортную часть (лиганд) [см., например, Химико-фармацевтический журнал, 3, 2001 г., с.14].

Известно, что успешной стратегией доставки БАВ является использование в качестве лигандов сахаров [см., например, патент РФ 2141963, С 07 Н 1/00, публ. 1999 г., ЕР 0363275, С 07 Н 15/04, публ. 1990 г. и др.].

Анализ уровня техники показывает, что, несмотря на принципиальную известность подходов к организации направленной доставки БАВ к специфическим клеткам и тканям организма, при получении биологически активного синтетического соединения с желаемым набором свойств требуется подбор подходящего лиганда и формирование внутримолекулярных связей в синтезируемом соединении с учетом как природы и свойств используемого БАВ, так и свойств объекта-мишени.

Исходя из имеющихся предпосылок, авторы заявляемого изобретения поставили задачу поиска и синтеза соединений, обладающих способностью активировать киллинг внутриклеточно локализованных микроорганизмов путем повышения интенсивности процессов перекисного окисления в фаголизосоме. Кроме того, задачей изобретения является создание средства с вышеуказанной активностью.

Поставленная цель была достигнута за счет синтеза новых производных сахаров общей формулы где n=1-6, сахаридный радикал, содержащий в качестве концевого невосстанавливающего сахара, связанного в положении С-1 углерод, маннозу или фукозу, или N-ацетилглюкозамин, Y - мостиковая группа, представляющая собой алифатический углеводород с числом углеродных атомов в цепи от 1 до 6, ковалентно связанный с сахаридным радикалом в положении С-1 углерод, СрМе - металлоцен.

Целесообразным является, чтобы соединения вышеуказанной общей формулы в качестве металлоцена содержали ферроцен.

Указанные соединения и их свойства в литературе не описаны.

Специфическая биологическая активность заявляемых соединений обеспечивается металлоценами - циклопентадиенильными соединениями металлов переходной группы сэндвичевой или полусэндвичевой структуры. Экспериментально доказано, что указанные соединения значительно увеличивают активность фаголизосомальных пероксидаз, интенсифицируя тем самым процесс перекисного окисления, приводящего к гибели микроорганизмов, внедренных в фагоциты. Использование ферроценовых производных сахаров является предпочтительным.

Направленная внутриклеточная доставка биологически активного комплекса обеспечивается за счет включенных в молекулярные структуры заявляемых соединений сахаридных радикалов. Сахаридный радикал может быть моносахаридом или содержать до 6-ти звеньев сахаров, при этом в качестве концевого невосстанавливающего сахара, связанного в положении С-1 углерод, сахаридный радикал должен содержать или маннозу, или фукозу, или N-ацетилглюкозамин, которые за счет своей способности к взаимодействию со специфическими мембранными рецепторами клеток обеспечивают транспорт молекул вещества во внутрь указанных клеток.

Мостиковая группа в заявляемых соединениях представляет собой алифатический углеводород с числом атомов углерода в цепи от 1 до 6. Ковалентное присоединение мостиковой группы к сахаридному радикалу может быть реализовано посредством любой известной реакционно-возможной связи, например посредством простой эфирной связи. То же самое касается и присоединения мостиковой группы к металлоцену, например возможно осуществить присоединение посредством сложноэфирной связи.

Полученные металлоценовые производные сахаров способны к мицеллообразованию в водных растворах, при этом металлорганическая часть молекулы находится внутри мицеллы, благодаря чему в процессе транспортировки к клеткам - мишеням металлоорганическая часть молекулы не вступает в контакт с органическими субстратами клеток и тканей. Образованию мицелл способствует линейная ориентация углеводородной цепи мостиковой группы, обусловленная ее ковалентной связью в положении С-1 углерод сахаридного радикала.

После прохождения через мембрану фаголизосомы происходит распад мицеллы, и редокс-активный металлоцен включается в процессы свободнорадикального окисления.

Задача по созданию средства для активации киллинга микроорганизмов, локализованных внутриклеточно, решена авторами изобретения путем использования в качестве активного ингредиента средства любого из группы заявленных соединений или их смеси, в частности соединения по п.4.

Указанное средство может также включать носитель и другие функциональные добавки (стабилизаторы, консерванты и прочее).

В частности, средство может быть приготовлено в виде коллоидного раствора в водно-этанольной смеси, причем количественное соотношение указанных компонентов определяет размер мицелл.

На фиг. 1 приведена структурная формула представителя группы заявляемых соединений - соединения FM1.

На фиг.2 представлена диаграмма, демонстрирующая активацию внутриклеточного киллинга дрожжевых клеток под влиянием соединения FM1.

Предлагаемые соединения могут быть получены по следующей обшей схеме: 1. Проведение реакции исходного углевода с защищенными избыточными функциональными группами (6,2,3,4-положения) с выбранным алифатическим углеводородом для образованием ковалентной связи алифатического углеводорода с сахаридным радикалом в положении С-1 углерод сахара.

2. Проведение реакции полученного на стадии 1 соединения с металлоценом.

3. Снятие защитных функциональных групп.

Пример 1.

Получение ферроценового производного маннозы (соединение FM1).

(1). 6,2,3,4-O-тетраацетат маннозу (1 г) и тритил-N-ε-аминокапроновую кислоту (1 г) растворяли в безводном пиридине при перемешивании. Реакцию проводили в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦГКД) при постоянном перемешивании вначале при 0^oС, а затем при комнатной температуре. По окончании реакции пиридин отгоняли при пониженном давлении. Полученный осадок последовательно обрабатывали водой и хлороформом. Хлороформную порцию упаривали под вакуумом досуха и высушивали над СаСl₂. Получили гигроскопический порошок желтоватого цвета: 6,2,3,4-O-тетраацетат-маннопиранозил-1, О-тритил-ε-аминокапроновую кислоту.

6,2,3,4-О-тетраацетат-маннопиранозил-1,О-тритил-ε-аминокапроновую кислоту (1 г) растворяли в 50%-ной уксусной кислоте и нагревали в течение 5-10 минут на водяной бане. Смесь охлаждали и добавляли воду. Образовавшийся в результате гидролиза трифенилкарбинол отфильтровывали от основного продукта. Растворитель упаривали под вакуумом, осадок обрабатывали водой, а затем спиртом. Получили бледно-желтые гигроскопические кристаллы 6,2,3,4-О-тетраацетил-маннопиранозил-1,О-ε-аминокапроновой кислоты.

(2). 6,2,3,4-О-тетраацетил-маннопиранозил-1,О-ε-аминокапроновую кислоту (343 мг) и ферроценкарбоновую кислоту (170 мг) растворяли в безводном пиридине, охлаждали до 0^oС. Добавляли ДЦГКД и 1-оксибензотриазол при перемешивании. Процесс вели сначала при 0^oС, а затем при комнатной температуре. Побочные продукты реакции отфильтровывали, пиридин упаривали под вакуумом, коричневый осадок высушивали над Р₂О₅.

(3). Полученный на стадии (2) продукт растворяли в абсолютизированном метаноле, добавляли метилат натрия и смесь перемешивали в течение 48 часов. Раствор упаривали под вакуумом, затем обрабатывали хлороформом. Хлороформную фракцию упаривали.

Выделение целевого продукта из конденсированной хлороформной фракции осуществляли на пластинах для препаративной хроматографии фирмы Merk в системе бензол-этанол-гексан (23,5:1,5:25).

Брутто-формула полученного соединения С₂₃Н₃₁O₈N₁Fe₁. Структурная формула приведена на фиг.1 Полученное в результате синтеза соединение представляет собой масло коричневого цвета, не растворимое в воде, растворимое в органических растворителях: этиловом и метиловом спирте, хлороформе.

Структура и чистота полученного соединения были подтверждены результатами анализа, который осуществляли методом тонкослойной хроматографии.

Предварительно проводили идентификацию промежуточного продукта синтеза, выделенного на стадии (2), - тетраацетатманнозного производного целевого продукта.

Хроматография проводилась в системе бензол-этанол-этилацетат (4:1:1). Пятно тетраацетатманнозного соединения имело RF=0,94, светилось в УФ-свете и проявлялось хлорбензолом.

Проводили идентификацию деацетилированного конечного продукта синтеза.

Хроматография проводилась в системе бензол-этанол (15:1) в присутствии аммиака. Проявление пятна осуществляли в УФ-свете и при помощи системы 144. Пятно деацетилированного соединения имело RF=0,69. В этих же условиях дополнительно проводили определение тетраацетатманнозного соединения. Его пятно имело RF=86.

Пример 2.

На основе соединения FM1 готовили средство для активации киллинга микроорганизмов, локализованных внутриклеточно.

2,6 мкг указанного соединения растворяли в 260 мкл 96%-ного этанола с последующим разведением в 10 раз в однократно дистиллированной воде.

Получили коллоидный раствор, диаметр мицелл в котором составил величину порядка 150 нм.

Пример 3.

Определение активности соединения FM1.

Активность полученного соединения проверялась in vitro на модели перитонеальных клеток беспородных мышей. Перитонеальные клетки были получены путем перитонеального лаважа.

Клетки были взвешены в среде RPMI-1640 с 10% FCS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота) с L-глутамином без добавления антибиотиков и помещены в 12-луночную плату по 10⁶ кл. на лунку. После инкубации в течение 1 часа при 37^oС в атмосфере СO₂ (5%), прикрепления макрофагов и смены среды в лунки были внесены дрожжи Saccharomyces cerevisiae в концентрации 10⁶ на лунку. После 1 ч инкубации при вышеуказанных условиях среду меняли и в "экспериментальные лунки" добавляли соединение FM1 в виде коллоидного раствора в водно-этанольной смеси в различных концентрациях: 10 mikroM, 1 mikroM и 0,1 mikroM. Клетки были инкубированы в течение 1 ч, затем трижды заморожены и оттаяны для разрушения макрофагов. Полученная взвесь была посеяна в разведениях на среду LB, дополнительно содержащую 5%-ную глюкозу. Через сутки было подсчитано количество колонеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл содержимого "контрольных" и "экспериментальных" лунок.

Результаты эксперимента представлены в виде диаграммы (см. фиг.2). Как видно из результатов эксперимента, обработка клеток соединением FM1 значительно интенсифицирует киллинг дрожжей макрофагами.

Пример 4 (сравнительный).

Для сравнения определяли активность FM1 в отношении свободных от макрофагов клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Дрожжи в концентрации ~10⁶ кл./мл, взвешенные в физиологическом растворе, вносили в лунки 96-луночной платы по 100 мкл на лунку (в двух параллелях). В "экспериментальные" лунки вносили по 5 мкл водной суспензии FM1 с таким расчетом, чтобы конечная концентрация соединения составила 10^-5 и 10^-6 моль/л. Платы инкубировали 24 ч при 37^oС.

Содержимое лунок сеяли в разведениях на среду LB с 5%-ной глюкозой, затем инкубировали 24 ч при 37^oС. Подсчитывали количество КОЕ/мл исходного раствора.

Количество КОЕ в "контрольных" и "экспериментальных" лунках значимо не различалось:
для концентрации FM1 10^-5 моль/л - 4•10⁶ КОЕ/мл в контроле, 5•10⁶ КОЕ/мл в эксперименте;
для концентрации FM1 10^-6 моль/л - 5•10⁶ КОЕ/мл в контроле, 4•10⁶ КОЕ/мл в эксперименте.

Таким образом, результаты первого и второго (сравнительного) экспериментов говорят о том, что соединение FM1 проявляет специфическую активность в отношении микроорганизмов, локализованных внутриклеточно.

Пример 5.

Оценивали токсичность соединения FM1 по его некротическому воздействию на макрофагоподобные клетки линии ТНР-1, выращенные в среде RPMI-1640, содержащей 10% FCS, L-глютамин и гентамицин. Клетки вносились в количестве ~ 10⁶ в лунки 12-луночной платы, содержащей по 2 мл описанной среды на лунку. В "экспериментальные" лунки добавляли FM1 в виде водной суспензии по 5 мкл на лунку до достижения концентраций FM1 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 моль/л. Клетки инкубировали в течение 24 ч при 37^oС и влажности 95% в атмосфере СО₂. Затем клеточную взвесь центрифугировали, супернатант удаляли. Количество некротических клеток определяли с помощью реактива трепанового синего, окрашивающего некротические клетки.

Результаты теста на токсичность приведены в таблице.

Токсическая концентрация соединения FM1 составляет 10^-4 моль/л.

Таким образом, заявляемые соединения обладают высокой специфической активностью в отношении микроорганизмов, локализованных внутриклеточно, за счет селективного воздействия на ферментативную систему фаголизосомального комплекса фагоцитов.

Указанные соединения, а также содержащее их средство могут быть использованы в экспериментальной медицине и биологии, а также могут послужить основой для получения лекарственных препаратов, предназначенных для борьбы с возбудителями, локализованными внутриклеточно, в частности таких, как грибы, простейшие, паразиты.

Формула изобретения

1. Производные сахаров общей формулы

где n= 1-6;

сахаридный радикал, содержащий в качестве концевого невосстанавливающего сахара, связанного в положении С-1 углерод, маннозу или фукозу, или N-ацетилглюкозамин;
Y - мостиковая группа, представляющая собой алифатический углеводород с числом углеродных атомов в цепи от 1 до 6, ковалентно связанный с сахаридным радикалом в положении С-1 углерод посредством простой эфирной связи или через группу

и связанный с металлоценом посредством сложноэфирной связи или через группу

СрМе - металлоцен.

2. Соединения по п. 1, которые в качестве металлоцена содержат ферроцен.

3. Средство для активации киллинга микроорганизмов, локализованных внутриклеточно, характеризующееся тем, что в качестве активного ингредиента оно содержит соединение по п. 1 или 2.

4. Средство по п. 3, характеризующееся тем, что в качестве активного ингредиента оно содержит производное маннозы, имеющее структурную формулу

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3