Способ обнаружения и идентификации клеток микроорганизмов и вирусов

 

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности к способам обнаружения низкой концентрации аналита в пробе за счет улучшения отношения сигнал/фон. Для осуществления способа дно реакционного сосуда обрабатывают вначале специфическими антителами, а затем антителами, связанными с люминесцентной меткой, в качестве которой используют Pt-комплексы копро- или уропорфирина. Связывание люминесцентной метки с искомым аналитом осуществляют в процессе проведения реакции специфического связывания аналита с компонентами анализа, отмывают несвязавшиеся компоненты анализа, высушивают реакционный сосуд и сканируют микроплощадки на дне этого сосуда пучком лазерного излучения с переменной площадью поперечного сечения. Площадь поперечного сечения лазерного пучка света принимают эквивалентной площади отдельной сканируемой микроплощадки, площадь которой выбирают в 10⁴...3•10⁴ раз больше площади искомого аналита. Использование способа позволяет проводить раннюю диагностику заболеваний человека и контролировать наличие бактерий и вирусной контаминации различных материалов в концентрации 1-100 частиц (клеток) аналита в образце. 4 табл.

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности к способам индикации искомого аналита в биологическом образце с использованием флуоресцентных и люминесцентных систем регистрации сигналов.

В настоящее время требуются быстрые способы детектирования идентификации микробных аналитов, например, микроорганизмов, вирусов, риккетсий, грибов и их фрагментов не только в медицинской диагностике, но также в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, биопроцессах и при очистке воды. Существуют различные способы для решения этой задачи: выращивание клеток на культуральных средах, использование микроскопии (наличие вирионов в пробе может быть обнаружено только с использованием электронной микроскопии), проточной цитометрии, различные иммунологические методы анализа, использование полимеразных цепных реакций с нуклеиновыми кислотами. Однако нет способов, которые позволяли бы проводить обнаружение и идентификацию низких концентраций микробных аналитов в пробе за короткое время, с высокой чувствительностью и специфичностью при средней сложности и невысокой стоимости анализа.

Известен способ обнаружения и идентификации микроорганизмов в биологических жидкостях (патент США 5366858, класс НКИ 435-5). Способ основан на проведении реакции специфического связывания искомого микроорганизма с компонентами анализа, облучении исследуемого образца возбуждающим источником света, измерении оптической реакции частиц в образце на облучение и сравнении статистических данных измеренных значений со статистическими данными контрольного образца без искомого микроорганизма, о наличии которого судят по превышению измеренных сигналов над контрольными. Измерение сигналов осуществляют методом проточной цитометрии, при этом на выходе измерительного устройства получают интегральный сигнал от совокупности клеток.

Известен способ исследования с высоким пространственным и временным расширением малых областей исследуемого образца, находящегося на предметном стекле микроскопа (патент США 4920386, класс НКИ 356-417). При осуществлении способа исследуемый образец освещают источником излучения и измеряют либо отраженный от образца свет, либо проходящий через него свет, либо свет эмиссии. Высокая чувствительность измерений достигается за счет телевизионной камеры. Для получения сигнала используют гематопорфирин, внедренный в клетки, максимум длины волны возбуждения которого 400 нм, а максимум длины волны эмиссии 600 нм.

Способ не может быть использован для идентификации вирусов, т.е. объектов размером менее 0,2-0,3 мкм. Кроме того, способ не позволяет обнаруживать единичные клетки в 1 мл пробы, т.к., например, на подложку площадью 5х5 мм² (площадь, эквивалентная площади дна лунки планшета) наносится проба объемом всего 3-20 мкл, для надежного обнаружения единичных клеток необходимо, чтобы в поле зрения 100х100 мкм было бы не менее 1 клетки, для этого необходимо внесение пробы с концентрацией 10⁴ м.т./мл.

Известен способ измерения пространственного распределения флуоресценции на субстрате (патент США 5424841, класс НКИ 356-417). Способ предназначен для автоматического исследования ДНК-последовательностей при иммуноанализе малых количеств исследуемого образца (порядка фемтомоль). Сущность способа заключается в том, что сканирующий пучок излучения направляют на конкретные площадки субстрата, содержащего множество флуорофорных маркеров, связанных с аналитом. Излучение возбужденного образца собирают волоконно-оптическим коллектором со всего пути сканирования одновременно и направляют на фотодетектор. Для уменьшения влияния фоновой люминесценции, возникающей в субстрате, используют фильтры, установленные на входе и выходе волоконно-оптического коллектора.

Способ не может быть использован для идентификации клеток микроорганизмов и вирионов, т.к. фотодетектор измерят интегральное излучение флуоресценции площадок с уровнем фоновой флуоресценции, многократно превышающий уровень флуоресценции единичных клеток микроорганизмов.

Известен способ многопараметрового биоспецифического анализа биологических жидкостей (патент РСТ 94/01774, класс МКИ G 01 N 33/543). Способ предназначен для определения нескольких аналитов в пробе исследуемого образца, связанного с твердофазным носителем. В качестве вещества-метки для детектирования аналитов в пробе используют Pt- и Pd-комплексы копропорфирина. Это позволяет значительно уменьшить флуоресценцию фона при измерении сигналов с временным разрешением.

Однако при анализе жидких образцов металлопорфирины могут быть использованы в качестве меток только в случае, если они защищены детергентом, например, тритон Х-100 и сульфатом натрия от тушения водой и кислородом, что усложняет способ.

Известен способ иммуноанализа, использующий одноступенчатый сухой реагент "все-в-одном" (патент РСТ 97/38311, класс МКИ G 01 N 33/543). Сущность способа заключается в том, что специфические компоненты анализа иммобилизуют на твердой фазе реакционного сосуда, например в лунке микротитровальной платы. Добавляют меченые специфические компоненты анализа, отмывают несвязавшиеся с твердой фазой компоненты, высушивают микротитровальную плату и хранят до использования. При проведении анализа в лунки с сухим реагентом добавляют образец (общую кровь, плазму, сыворотку), содержащий маркер (определяемый аналит), проводят реакцию специфического связывания маркера с компонентами анализа, отмывают несвязавшиеся компоненты анализа и детектируют сигнал флуоресценции метки на DELFIA plate флуориметре модель 1234 (Wallac OY, F1). Детектирование осуществляют с поверхности дна лунки после операции отмывки. В качестве флуоресцентных меток используют хелаты лантанидов, европия, тербия, самария, обладающих высокой интенсивностью длительной люминесценции и сохраняющих достаточно высокую специфичность и активность конъюгатов, что позволяет использовать для анализа малые объемы образцов. Способ может быть использован для проведения конкурентного и неконкурентного анализа с моно- и поликлональными антителами.

Способ не позволяет проводить обнаружение и идентификацию единичных клеток микроорганизмов и вирусов, т.к. со дна лунок снимается интегральный сигнал. Кроме того, съем сигнала со дна лунок после отмывки при измерении очень малых сигналов люминесценции вносит в измеряемые сигналы значительный сигнал фоновой люминесценции твердой фазы, что ухудшает отношение сигнал/фон и затрудняет проведение индикации и идентификации микроорганизмов и вирусов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ измерения люминесценции образцов (ЕР 0841557, класс МКИ G 01 N 21/64). Способ предназначен для исследования тканей злокачественных опухолей и специфических хромосом последовательностей ДНК. Сущность способа заключается в том, что в лунки подготовленной для анализа микротитровальной платы вносят исследуемый образец, элементы образца метят люминесцентным веществом, и затем образец освещают лазерным лучом. При этом каждую лунку сканируют узким пучком лазерного излучения, площадь поперечного сечения которого изменяется процессором в зависимости от размера лунки (планшет с 6 или 384 лунками) и от количества сканируемых микроплощадок в лунке. Для выявления определенных областей (микроплощадок) в структуре клеток в тканях злокачественных опухолей и в специфических хромосомах ДНК-последовательностей используют несколько люминесцентных красителей. Излучение эмиссии каждой индивидуальной микроплощадки в лунке измеряют через некоторый интервал времени после окончания действия светового импульса.

Способ предназначен для исследования достаточно больших объектов (10-50 мкм) при большой концентрации аналита в образце с использованием визуального распознавания образов на мониторе и не может быть использован для обнаружения и идентификации единичных клеток микроорганизмов и вирионов в пробах, содержащих небольшое количество клеток, в присутствии мешающих примесей.

Задачей является создание способа обнаружения и идентификации единичных клеток микроорганизмов и вирионов в образце в присутствии гетерологичных биообъектов.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение отношения сигнал/фон, что позволяет повысить надежность обнаружения и идентификации единичных клеток микроорганизмов и вирионов при низких концентрациях их в образце, что позволяет диагностировать различные заболевания на ранней стадии и контролировать наличие бактерий и вирусной контаминации различных материалов в очень низких концентрациях (1-100 частиц аналита в образце).

Технический результат достигается предлагаемым изобретением.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе обнаружения аналита в образце, включающем связывание люминесцентной метки с искомым аналитом, находящимся на дне реакционного сосуда, сканирование микроплощадок на дне этого сосуда пучком лазерного излучения с переменной площадью поперечного сечения и детектирование с временным разрешением интенсивности эмиссии люминесцентной метки, обрабатывают дно реакционного сосуда вначале специфическими к искомому аналиту антителами, а затем антителами, связанными с люминесцентной меткой, в качестве которой используют Pt-комплексы копро- или уропорфирина, причем связывание люминесцентной метки с искомым аналитом осуществляют в процессе проведения реакции специфического связывания аналита с компонентами анализа, отмывают несвязавшиеся компоненты анализа и высушивают дно реакционного сосуда, при этом площадь поперечного сечения сканирующего лазерного пучка света принимают эквивалентной площади отдельной сканируемой микроплощадки, площадь которой выбирают в 10⁴...3•10⁴ раз больше площади искомого аналита.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, аналогичную заявляемой. Следовательно, предлагаемое решение отвечает критерию новизны.

От прототипа предлагаемое изобретение отличается новыми признаками и новой их совокупностью. При низких концентрациях искомого аналита в пробе для его обнаружения большое значение имеет отношение величины полезного сигнала к величине фона (с/ф). При измерении сигнала люминесценции метки, связанной с аналитом, непосредственно после операции отмывки большое влияние на величину полезного сигнала оказывает фоновая составляющая флуоресценции остаточного количества реагентов и материала твердой фазы. Высушивание реакционного сосуда снижает влияние первой из этих составляющих. Кроме того, операция высушивания позволяет в качестве метки использовать Pt-комплексы копро- и/или уропорфирина, эмиссия фосфоресценции которых увеличивается при дегидратации. Кроме того, она находится в длинноволновой области спектра, это дает возможность в значительной степени ослабить влияние коротковолновой флуоресценции материала твердой фазы (реакционного сосуда), что позволяет увеличить полезный сигнал и улучшить отношение с/ф. Регулирование поперечного сечения сканирующего лазерного пучка излучения указанным образом позволяет сохранять оптимальное соотношение между площадью сканируемой микроплощадки и площадью поперечного сечения сканирующего пучка излучения, т.е. яркостью освещения искомого аналита, что позволяет получить оптимальное соотношение с/ф. Вся совокупность признаков позволяет получить такое соотношение с/ф, что становится возможным обнаружение, идентификация единичных клеток микроорганизмов и вирусов и их количественная оценка в искомом материале. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию уровня техники.

Изобретение найдет широкое применение в медицинской диагностике, в биохимии, пищевой и других отраслях промышленности, в случаях, когда возникает необходимость быстрой и ранней диагностики заболеваний, загрязнения окружающей среды и т.п. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.

Способ осуществляется следующим образом.

В лунки микротитровальной платы (или на поверхность любого твердофазного носителя) вносят специфические к определяемому аналиту антитела в концентрации 2-10 мкг/мл и инкубируют в течение 2 ч при 37^oС или в течение 12-18 ч при 4^oС. Затем несвязавшиеся антитела удаляют промывкой, а дно и стенки лунок микротитровальной платы обрабатывают блокирующим раствором, например 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА). В подготовленные лунки вносят анализируемую пробу в объеме 100-250 мкл, инкубируют в течение 2-4 ч при комнатной температуре, а несвязавшуюся часть пробы удаляют промывкой. После этого в лунки вносят конъюгат - специфические к искомому аналиту антитела, меченные Pt-комплексом уро- или копропорфирина, в концентрации 50-100 нг на лунку в объеме 200 мкл. При окрашивании антител используют соотношение "метка/белок" 3-10 молекул вещества-метки на одну молекулу белка. После инкубации искомого аналита с конъюгатом лунки промывают 3-6 раз буферным раствором (фосфатный буфер 0,1М или трис буфер 0,1М, рН 7-7,5), а затем двукратно дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Обнаружение аналитов в пробе осуществляют сканированием дна лунки микротитровальной платы импульсным лазерным пучком излучения. При этом площадь поперечного сечения сканирующего пучка света принимают эквивалентной площади единичной сканируемой микроплощадки дна реакционного сосуда, которая изменяется в пределах от 10000 мкм² (для клеток микроорганизмов) до 500 мкм² (для клеток вирионов).

Интенсивность сигнала люминесценции примесей и материала твердой фазы, регистрируемая со дна реакционного сосуда, пропорциональна площади, освещаемой возбуждающим источником излучения, и интенсивности возбуждающего светового потока. В то же время полезный сигнал от фиксированного на носителе количества клеток микроорганизмов (или вирусов) не зависит от освещаемой площади и пропорционально возрастает только при увеличении интенсивности возбуждающего светового потока, т.к. площадь, занимаемая выявляемыми биоагентами, остается постоянной. Т.о., для повышения отношения полезного сигнала к уровню фоновой люминесценции необходимо существенно уменьшить площадь освещаемой микроплощадки и, соответственно, пропорционально увеличить интенсивность возбуждающего светового потока, т.е. уменьшить площадь поперечного сечения светового пучка при одном и том же источнике излучения. Однако чрезмерное уменьшение размеров сканируемой микроплощадки приводит к значительному увеличению времени анализа образца. Ограничение максимального размера микроплощадки обусловлено уровнем сигнала фоновой люминесценции твердофазного носителя (дна реакционного сосуда), с которой биоспецифически связан микробный аналит. Поэтому оптимальным размером микроплощадки будет такой ее размер, при котором уровень сигнала фоновой люминесценции микроплощадки достоверно ниже уровня сигнала люминесценции единичного микробного аналита. Как правило, для достоверного обнаружения микробного аналита достаточно, чтобы уровень сигнала от микробного аналита был выше среднего уровня фоновой люминесценции твердофазного носителя в 3 раза.

При использовании Pt-копро- или уропорфирина при детектировании микробных аналитов на твердой фазе полистирола в режиме временного разрешения люминесценции (время задержки между импульсом возбуждения и регистрацией строба 100 мкс, частота следования импульсов возбуждения 5000 имп./с, λ_возб- 532 нм, λ_эм- 645 нм, мощность падающего лазерного светового потока сохраняется постоянной - 20 мВт) сопоставимый уровень фоновой люминесценции твердой фазы наблюдается при превышении площади микроплощадки над площадью микробного аналита на ней в 10⁴...3•10⁴ раз.

Площадь поперечного сечения лазерного пучка света выбирают эквивалентной площади освещаемой микроплощадки, т.к. с уменьшением или увеличением площади сканируемой микроплощадки должно оставаться оптимальным отношение с/ф, т.е. увеличиваться или уменьшаться мощность падающего на микроплощадку светового потока. При этом количество темновых и фоновых импульсов люминесценции, детектируемых с освещаемой микроплощадки (при измерении в режиме счета фотонов) в заданном временном и спектральном интервале должно быть в три и более раз ниже, чем полезный сигнал от единичных клеток микроорганизмов и вирионов, меченных длительно люминесцирующей меткой.

Уменьшение размеров освещаемой микроплощадки и, соответственно, увеличение интенсивности сканирующего пучка света может осуществляться до определенного предела. Допустимый уровень интенсивности возбуждающего светового потока ограничен люминесцентными характеристиками вещества метки и не должен превышать 10-15% от уровня, при котором все молекулы вещества-метки переводятся в возбужденное состояние. При превышении этого уровня будет искажена концентрационная зависимость сигнала люминесценции от содержания метки в пробе.

Для микроорганизмов возбудителя туляремии среднее число молекул метки составляет 3. . .6•10⁵. Это число определяется количеством эпитопов к моно- или поликлональным антителам и "нагрузкой" метки на молекулу антитела (обычно 4-8 молекул). Для вакцинного вируса натуральной оспы число молекул метки составляет 2...4•10⁴. Разница в числе молекул метки связана с тем, что количество эпитопов на поверхности вируса ниже, чем на поверхности возбудителя туляремии, почти в 10 раз. С учетом этого и для сохранения отношения с/ф, достаточного для обнаружения и идентификации биоагентов, размер единичной освещаемой сканирующим пучком света микроплощадки должен изменяться при детектировании биоагента прямо пропорционально количеству молекул метки. При этом в соответствии с изменением размера единичной микроплощадки, эквивалентно ей, изменяется и площадь сечения сканирующего лазерного пучка. В табл. 1 представлены экспериментальные данные, подтверждающие выбор оптимального размера сканируемой микроплощадки.

Сканирование дна реакционного сосуда осуществляют путем последовательного облучения микроплощадок лазерным пучком света. Время сканирования одной микроплощадки 30-50 мс, что позволяет реакционный сосуд с площадью дна 25•10⁶ мкм² просканировать за 4-6 мин.

Индикацию биоагентов можно осуществлять следующим образом. Измеряют количество фотоимпульсов люминесценции от единичных микроплощадок и количество фотоимпульсов от всех микроплощадок. Вычисляют среднее значение количества фотоимпульсов от одной микроплощадки и определяют отношение количества измеренных фотоимпульсов от единичной микроплощадки к среднему значению количества фотоимпульсов от одной микроплощадки. При достоверном превышении первого сигнала над вторым судят о наличии в пробе микроорганизмов и вирионов. Если это отношение равно 3, констатируют наличие в пробе вирусов, а если 10 - микроорганизмов. Ниже приведены примеры обнаружения единичных клеток микроорганизмов и вирионов.

Пример. 1. Выявление клеток возбудителя туляремии.

Дно лунок микропланшета обрабатывают специфическими антителами к возбудителю туляремии. С этой целью в лунки вносят по 0,05 мл моноклональных мышиных антител, специфичных к липополисахариду Fr.tularensis, в концентрации 1 мкг/мл в виде карбонатно-бикарбонатного (КББ) 0,15 мМ буферного раствора, рН 7,7. Инкубируют раствор в течение 1 ч при 37^oС и затем удаляют раствор и трехкратно промывают лунку изотоничным раствором КББ.

Затем в лунки микропланшета, обработанные специфическими антителами к возбудителю туляремии, вносят по 0,2 мл пробы, содержащей клетки искомого микроорганизма в концентрации от 20 до 600 клеток в мл, и конъюгат специфических антител к Fr. tularensis в концентрации 0,1 мкг/мл, меченых Pt-копропорфирином, в молярном соотношении метка-белок 4:1. В качестве контрольных проб используют суспензию E.coli М-17 в концентрации 10⁴...10⁶ м.т. в мл и осповакцину, содержащую живой вирус, от 10⁶ до 10⁸ вирионов. Контрольные пробы также обрабатывают конъюгатом специфических антител к возбудителю туляремии. С этой целью используют часть лунок, обработанных специфическими к возбудителю туляремии антителами. Количество микроорганизмов в пробе рассчитывают по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Количество вирионов - титрованием на культуре клеток.

После внесения проб и инкубации их в течение 4 ч лунки 3-кратно промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. После этого осуществляют регистрацию сигнала в соответствии с описанной выше процедурой. Данные эксперимента приведены в табл.2. Гетерологичные микроорганизмы не адсорбируются на твердой фазе полистирола, и в контрольных пробах не регистрируются микроплощадки с уровнем сигнала, в 3 и более раз превышающим средний уровень.

Результаты опыта показывают, что искомые биоагенты специфически связывают метку в существенно более высоких концентрациях, чем гетерологичные клетки и вирусы, и могут быть выявлены предлагаемым способом в низких концентрациях. При этом для обнаружения клеток возбудителя туляремии достаточно иметь максимальный размер площадки около 100х100 мкм. При снижении размера площадки в 9 раз эффективность обнаружения практически не изменяется, но время анализа увеличивается в 9 раз. Таким образом, площадь зондирующего луча должна устанавливаться с учетом фоновой фосфоресценции и уровня сигнала фосфоресценции искомого биоагента. Этот уровень зависит от качества используемых меченых антител и числа эпитопов, связывающих меченые антитела на поверхности клетки. Максимальная площадь зондирующего луча должна быть такой, чтобы сигнал фосфоресценции единичной клетки достоверно превышал сигнал фоновой фосфоресценции. В представленном примере для клеток возбудителя туляремии эффективной является площадка 100х100 мкм.

Пример. 2. Выявление вируса осповакцины.

Дно лунок микропланшета обрабатывают специфическими антителами к вирусу осповакцины. С этой целью в лунки вносят по 0,05 мл поликлональных кроличьих антител, специфичных к вирусу осповакцины, в концентрации 1 мкг/мл в виде карбонатно-бикарбонатного (КББ) 0,15 мМ буферного раствора, рН 7,7. Инкубируют раствор в течение 1 ч при 37^oС и затем удаляют раствор и трехкратно промывают лунку изотоничным раствором КББ.

Затем в лунки микропланшета, обработанные специфическими антителами к вирусу осповакцины, вносят по 0,2 мл пробы, содержащей вирус осповакцины в концентрации от 200 до 5000 вирионов, и конъюгат специфических антител к вирусу осповакцины в концентрации 0,1 мкг/мл, меченых Pt-копропорфирином, в молярном соотношении метка-белок 6:1. В качестве контрольных проб используют суспензию E.coli М-17 в концентрации 10⁴...10⁶ м.т. в мл и возбудитель туляремии. Контрольные пробы также обрабатывают конъюгатом специфических антител к вирусу осповакцины. С этой целью используют часть лунок, обработанных специфическими к вирусу антителами. После внесения проб и инкубации их в течение 4 ч лунки 3-кратно промывают дистиллированной водой. После этого осуществляют регистрацию сигнала в соответствии с описанной выше процедурой. Данные эксперимента приведены в табл.3.

Из представленного примера видно, что для обнаружения вируса осповакцины необходимо уменьшение размера площадки сканирования до 30х30 мкм. В этом случае счетная концентрация вирионов соответствует заданной. Уменьшение размера площадки сканирования обусловлено тем, что количество эпитопов на поверхности вируса существенно ниже, чем на поверхности возбудителя туляремии.

Приемник излучения люминесценции меток при работе в режиме счета фотонов должен обеспечивать получение не менее одного фотоимпульса в секунду от одной молекулы метки. Регистрацию сигналов люминесценции метки осуществляют в режиме временного разрешения сигналов люминесценции. При использовании Pt-комплексов уро- и копропорфирина исследуемую пробу образца возбуждают излучением лазера на длине волны 532 нм, а фосфоресценцию метки детектируют на длине волны 645 нм. При этом время задержки между актом возбуждения и приемом излучения фосфоресценции выбирается равным 30-40 мс, а время регистрации строба - 100 мкс. Это позволяет уменьшить влияние фоновой флуоресценции материала твердофазного носителя (дна реакционного сосуда) на более коротких длинах волн, что улучшает отношение сигнал/фон и позволяет повысить чувствительность измерений.

Регистрация сигналов фосфоресценции с высушенной поверхности дна лунки существенно увеличивает постоянную времени затухания (с τ =15-20 мкс до τ =60-80 мкс) и квантовый выход метки, что также улучшает отношение с/ф, а вся совокупность признаков позволяет увеличить чувствительность и надежность обнаружения и идентификации биоагентов в пробе.

Операция высушивания твердой фазы с адсорбированными метками и коньюгатом обеспечивает увеличение уровня полезного сигнала примерно в 40 раз по сравнению с сигналами, измеренными на поверхности твердой фазы без ее высушивания. Это достигается за счет снятия тушащего эффекта воды, кислорода, а также за счет увеличения жесткости молекулярного окружения (подвижности) при дегидратации при сохранении уровня сигнала фоновой длительной люминесценции твердой фазы. В качестве коньюгата используют Pt-комплексы копро- или уропорфирина с моноклональными антителами, адсорбированными на твердой фазе реакционного сосуда. Молекулярное соотношение метка/белок - 4:1. Образец материала для исследования получен путем внесения в лунки раствора конъюгата 300 нг/мл и адсорбции на твердой фазе 300 нг/мл.

Способ найдет широкое применение в различных отраслях техники для обнаружения и идентификации микроорганизмов и вирионов при низкой их концентрации в пробе.

Формула изобретения

Способ обнаружения и идентификации клеток микроорганизмов и вирусов, включающий связывание люминесцентной метки с искомым аналитом, находящимся на дне реакционного сосуда, сканирование микроплощадок на дне этого сосуда пучком лазерного излучения с переменной площадью поперечного сечения и детектирование с временным разрешением интенсивности эмиссии люминесцентной метки, отличающийся тем, что обрабатывают дно реакционного сосуда вначале специфическими к искомому аналиту антителами, а затем антителами, связанными с люминесцентной меткой, в качестве которой используют Pt-комплексы копро- или уропорфирина, причем связывание люминесцентной метки с искомым аналитом осуществляют в процессе проведения реакции специфического связывания аналита с компонентами анализа, отмывают несвязавшиеся компоненты анализа и высушивают реакционный сосуд, при этом площадь поперечного сечения сканирующего лазерного пучка света принимают эквивалентной площади отдельной сканируемой микроплощадки, площадь которой выбирают в 10⁴. . . 3•10⁴ раз больше площади искомого аналита.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5