Новые пептиды, которые могут быть использованы в антиген- специфической иммуносупрессорной терапии

 

Изобретение относится к пептидам, состоящим из 16-55 аминокислотных остатков, при этом указанные пептиды включают по крайней мере одну из аминокислотных последовательностей: FLCTHIIYS (SEQ ID NO:61), IIYSFANIS (SEQ ID NO: 62), FIKSVPPFL (SEQ ID NO:64), FDGLDLAWL (SEQ ID NO:65), LYPGRRDKQ (SEQ ID NO: 66), YDIAKISQH (SEQ ID NO:67), LDFISIMTY (SEQ ID NO:68), FISIMTYDF (SEQ ID NO: 69), FRGQEDASP (SEQ ID NO: 70), YAVGYMLRL (SEG ID NO:71), MLRLGAPAS (SEQ ID NO:72), LAYYEICDF (SEQ ID NO:73), LRGATVHRT (SEQ ID NO: 74), YLKDRQLAG (SEQ ID NO:75), LAGAMVWAL (SEQ ID NO:76), VWALDLDDF (SEQ ID NO: 77) или LDLDDFQGS (SEQ ID NO:78). Указанные пептиды могут быть использованы при лечении деструкции суставного хряща, вызванной Т-клетками. Введение фармацевтических композиций на основе указанных пептидов может быть использовано для индуцирования системной иммунологической толерантности к аутоантигенам при атаке аутореактивных Т-клеток. Описаны также фармацевтическая композиция и тест-набор, включающие указанные пептиды, а также диагностический способ обнаружения активированных аутореактивных Т-клеток. 5 с. и 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к пептидам и их использованию при лечении хронической деструкции суставного хряща при аутоиммунных заболеваниях; фармацевтическим композициям, включающим указанные пептиды; диагностическому способу обнаружения аутореактивных Т-клеток в исследуемом образце и тест наборам, используемым для осуществления указанного способа.

Иммунная система основана на принципе дискриминации между чужеродными антигенами (несобственными антигенами) и аутоантигенами (выработанными собственным организмом индивидуума), осуществляемом путем выработки толерантности против аутоантигенов.

Иммунная система защищает индивидуумов против чужеродных антигенов и отвечает на воздействие чужеродного антигена, активируя специфические клетки, такие как Т- и В-лимфоциты, и вырабатывая растворимые факторы, такие как интерлейкины, антитела и факторы комплемента. Антиген, на который реагирует иммунная система, разрушается антигенпредставляющими клетками, и на поверхности клетки экспрессируется фрагмент антигена, ассоциированный с главным комплексом гистосовместимости гликопротеина класса II (ГКГС). Комплекс ГКГС-гликопротеин-фрагмент антигена представляется Т-клетке, которая с помощью своих рецепторов распознает фрагмент антигена вместе с главным комплексом гистосовместимости гликопротеина класса II, с которым он связан. Т-клетка активируется, т. е. пролиферирует и/или вырабатывает интерлейкины, что приводит к увеличению активированных лимфоцитов, направленных на атакуемый антиген (Grey et al., Sci. Am., 261: 38-46, 1989).

Гликопротеины главного комплекса гистосовместимости непрерывно воздействуют на аутоантигены и представляют их Т-клеткам в виде фрагментов антигенов (Jardetsky et al., Nature 353: 326-329, 1991). Таким образом, само распознавание изначально присуще иммунной системе. При нормальных обстоятельствах иммунная система толерантна к аутоантигенам, и активации иммунной реакции этими аутоантигенами не происходит.

При утере толерантности к аутоантигенам иммунная система активируется против одного или нескольких, аутоантигенов, что приводит к активации аутореактивных Т-клеток и выработке аутоантител. Это явление называется аутоиммунностью. Иммунная реакция в целом деструктивна, т.е. направлена на разрушение инвазивного чужеродного антигена, аутоиммунные реакции могут вызвать разрушение собственной ткани организма.

Влияние Т-клеток на аутоиммунные заболевания определяется с помощью нескольких видов исследований. У мышей экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) вызывают высокоограниченной группой Т-клеток, связанных своей специфичностью с единичным эпитопом основного миелинового белка (МВР), находящегося в комплексе с молекулой ГКСГ класса II. Выло найдено, что у крыс Льюиса, обладающих высокой восприимчивостью к аутоиммунным заболеваниям, болезнь (опосредуется) Т-клетками.

Предполагается, что у людей аутоиммунные заболевания также связаны с развитием аутоагрессивных Т-клеток. Деструктивная аутоиммунная реакция причастна к различным заболеваниям, таким как ревматоидный артрит (РА), при которых целостность суставного хряща нарушается хроническим воспалительным процессом. Оказывается, само наличие хряща необходимо для поддержания местной воспалительной реакции: было установлено, что разрушение хряща ассоциируется с активностью реагирующих на хрящ аутореактивных Т-клеток при ревматоидном артрите (Sigall et al., Clin. Exp. Rheumat. 6:59, 1988; Giant et al., Biochem. Soc. Trans. 18:796, 1990; Burmester et al., Rheumatoid arthritis Smolen. Kalden, Maini (Eds) Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992). Более того, было установлено, что хирургическое удаление хряща у больных с ревматоидным артритом уменьшает воспалительный процесс. Поэтому белки хряща считаются целевыми аутоантигенами, компетентными в стимулировании Т-клеток. Активация этих аутореактивных Т-клеток ведет к развитию аутоиммунного заболевания. Следовательно, можно ожидать, что функциональное устранение этих Т-клеток окажется благоприятным для уменьшения деструктивного аутоиммунного процесса. Однако идентификация аутоантигенных компонентов, влияющих на развитие ревматоидного артрита, до настоящего времени представляла собой неразрешимую проблему.

Воспалительную реакцию, возникающую при разрушении хряща, можно лечить различными лекарственными средствами. Однако эти лекарственные средства являются иммуносупрессивными, неспецифическими и оказывают побочное токсическое действие. Недостаток, заключающийся в неспецифической иммуносупрессорности, делает такое лечение в высшей степени неблагоприятным.

Антигенспецифическая, нетоксическая иммуносупрессия, как например, описанная в WO-A-9510301, предлагает очень привлекательную альтернативу для неспецифической иммуносупрессии. Антигенспецифическая терапия включает лечение пациентов синтетическими Т-клеточно-реактивными пептидами, напоминающими или мимикрирующими эпитопы, присутствующие на аутоантигене. Поэтому эти пептиды могут быть использованы для индуцирования системной иммунологической толерантности, т.е. толерантности специфических Т-клеток, по отношению как к ним самим, так и к аутоантигену. Индуцированная системная иммунологическая толерантность основана на длительное время наблюдавшемся явлении, что животные, получавшие или вдыхавшие антиген или эпитоп, обладают меньшей способностью к развитию системной иммунной реакции по отношению к указанному антигену или эпитопу при их введении через системный путь. Для эффективного использования индуцированной пептидом системной толерантной терапии при лечении разрушения хряща, опосредованного Т-клетками, существует большая потребность в Т-клеточных реактивных пептидах, которые могут десенсибилизировать пациентов против аутоантигена, активирующего Т-клетки, ответственные за воспалительный процесс.

Целью данного изобретения является разработка пептидов, способных индуцировать системную иммунологическую толерантность, более конкретно специфическую Т-клеточную толерантность, по отношению к ответственному антигену хряща у больных, страдающих от разрушения хряща, опосредованного Т-клетками. Другой целью данного изобретения является разработка способа обнаружения аутореактивных Т-клеток, участвующих в разрушении суставного хряща, и тест наборов, используемых для осуществления указанного способа.

Настоящее изобретение обеспечивает такие пептиды.

Первый аспект данного изобретения обеспечивает пептиды, включающие 16-55 аминокислотных остатков, при этом указанный пептид включает, по крайней мере, одну из аминокислотных последовательностей LVCYYTSWS (SEQ ID NO:60), FLCTHIIYS (SEQ ID NO:61), IIYSFANIS (SEQ ID NO:62), LKTLLSVGG (SEQ ID NO: 63), FIKSVPPFL (SEQ ID NO:64), FDGLDLAWL (SEQ ID NO: 65), LYPGRRDKQ (SEQ ID NO: 66), YDIAKISQH (SEQ ID NO:67), LDFISIMTY (SEQ ID NO:68), FISIMTYDF (SEQ ID NO: 69), FRGQEDASP (SEQ ID NO:70), YAVGYMLRL (SEQ ID NO:71), MLRLGAPAS (SEQ ID NO: 72), LAYYEICDF (SEQ ID NO: 73), LRGATVHRT (SEQ ID NO:74), YLKDRQLAG (SEQ ID NO:75), LAGAMVWAL (SEQ ID NO:76), VWALDLDDF (SEQ ID NO:77) или LDLDDFQGS (SEQ ID NO: 78) (где SEQ здесь и далее означает последовательность).

В частности, пептид по данному изобретению включает по крайней мере одну из аминокислотных последовательностей YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO: 1), YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), NTQSRRTFIKSVPPFL (SEQ ID NO: 16), TFIKSVPPFLRTHGFD (SEQ ID NO:17), PPFLRTHGFDGLDLAW (SEQ ID NO: 18), HGFDGLDLAWLYPGRR (SEQ ID NO:19), DLAWLYPGRRDKQHFT (SEQ ID NO:20), TIDSSYDIAKISQHLD (SEQ ID NO:28), DIAKISQHLDFISIMT (SEQ ID NO:29), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO: 37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), PASKLVMGIPTFGRSF (SEQ ID NO: 39), GTLAYYEICDFLRGAT (SEQ ID NO:46), EICDFLRGATVHRTLG (SEQ ID NO:47), RGATVHRTLGQQVPYA (SEQ ID NO:48), VKSKVQYLKDRQLAGA (SEQ ID NO:53), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54), LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55), WALDLDDFQGSFCGQD (SEQ ID NO:56) или DFQGSFCGQDLRFPLT (SEQ ID NO:57).

Предпочтительно пептид по данному изобретению включает одну из следующих аминокислотных последовательностей YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1), YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO: 30), SPLFRGOEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55).

Более предпочтительно пептид по данному изобретению включает одну или более аминокислотных последовательностей YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55).

Пептиды по данному изобретению состоят из 16-55, предпочтительно 16-35, более предпочтительно 16-25, а наиболее предпочтительно 16 аминокислотных остатков.

В высшей степени предпочтительными пептидами по данному изобретению являются гексадекапептиды, состоящие из аминокислотной последовательности YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1), YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55), более предпочтительно аминокислотных последовательностей YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55).

В объем данного изобретения также входят мультимеры пептидов по данному изобретению, такие как, например, димер или тример указанных пептидов. Мультимер по данному изобретению может представлять собой либо гомомер, состоящий из множества одинаковых пептидов, либо гетеромер, состоящий из различных пептидов.

Характерные аминокислотные последовательности пептидов по данному изобретению могут иметь на своих концах произвольные аминокислотные последовательности. Предпочтительными являются такие концевые последовательности, которые оказывают на пептиды стабилизирующее действие, улучшая таким образом их биологическую доступность.

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, состоящем в том, что гликопротеин 39 человеческого хряща (в дальнейшем обозначаемый как НС gр-39) является целевым аутоантигеном у больных ревматоидным артритом, активирующим специфические Т-клетки, вызывая таким образом или способствуя воспалительному процессу. Пептиды, полученные из гликопротеина 39 человеческого хряща, преимущественно распознаются аутореактивными Т-клетками больных ревматоидным артритом, но редко Т-клетками здоровых доноров, показывая таким образом, что НС gp-39 является аутоантигеном ревматоидного артрита. Артритогенная природа гликопротеина 39 человеческого хряща далее подтверждается с помощью мыши Balb/c. Разовая подкожная инъекция указанного белка мышам Baib/c способна вызвать симптомы артрита у животных. Ход заболевания, вызванного гликопротеином 39 человеческого хряща характеризуется рецидивами, происходящими периодически в передних и/или задних лапах, и постепенно переходит из легкого артрита в его более тяжелую форму. Наблюдается также симметричное распределение пораженных суставов, которое вместе с повторяющимися рецидивами и образованием узелков напоминает процесс протекания артрита, особенно ревматоидного.

Еще более неожиданным является тот факт, что введение гликопротеина 39 человеческого хряща приводит к иммунологической толерантности и, что еще важнее, к замедлению и/или подавлению развития артрита.

Аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 60-78, более конкретно последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 12, 16-20, 28-30, 34, 37-39, 46-48, 53-57 напоминают ограниченные Т-клеточные эпитопы главного комплекса гистосовместимости, класс II, присутствующие на гликопротеине 39 человеческого хряща. Таким образом, также подразумевается, что пептиды по данному изобретению охватывают фрагменты НС gр-39 аутоантигена, включающего один или более вышеуказанных ограниченных Т-клеточных эпитопов ГКСГ, класс II, которые также входят в объем данного изобретения.

Несмотря на то, что гликопротеин 39 человеческого хряща описан Hakala et al. , J. Biol. Chem., т.268, 34, 25803 (1993), где он раскрывается как белок хитиназы и предлагается для использования в качестве подходящего маркера для ревматоидного артрита, в описании отсутствует какое-либо упоминание об артритогенной природе НС gр-39.

Пептиды по данному изобретению могут быть получены хорошо известными в органической химии методами синтеза пептидов, такими как, например, твердофазный пептидный синтез, описанный в J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963) и Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214 (1990).

Пептиды по данному изобретению могут быть также получены с помощью методов рекомбинантной ДНК. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид по данному изобретению или мультимер указанных пептидов, вставляют в вектор экспрессии. Подходящими векторами экспрессии, среди прочих, являются плазмиды, космиды, вирусы и дрожжевые искусственные хромосомы, включающие необходимые регуляторные области репликации и экспрессии. Вектор экспрессии может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Подходящими клетками-хозяевами являются, например, бактерии, дрожжевые клетки и клетки млекопитающих. Такие методы хорошо известны в данной области, см., например, Sambrooke et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.

Пептиды по данному изобретению представляют собой Т-клеточные реактивные пептиды, которые распознаются активированными аутореактивными Т-клетками и способны стимулировать их. Такие аутореактивные Т-клетки обнаруживаются в крови больных ревматоидным артритом и иногда у здоровых доноров.

Таким образом, синтетические пептиды, напоминающие ограниченные Т-клеточные эпитопы главного комплекса гистосовместимости, класс II, присутствующие на гликопротеине 39 человеческого хряща целевого аутоантигена, хорошо подходят для использования в терапии с целью индуцирования специфической Т-клеточной толерантности к НС gр-39 для млекопитающих, более конкретно людей, страдающих от деструкции хрящей, вызванной Т-клетками, такой как, например, артрит, более конкретно, ревматоидный артрит.

Несмотря на то что WO 95/01995 и WO 95/02188 описывают диагностическое использование гликопротеина 39 человеческого хряща в качестве маркера для ревматоидного артрита, артритогенная природа НС gp-39 не раскрывается и не упоминается. Нигде также не упоминается об использовании фрагментов гликопротеина 59 человеческого хряща или Т-клеточных реактивных пептидов по данному изобретению в антигенной или пептидной специфической терапии для индуцирования Т-клеточной специфической толерантности по отношению к НС gp-39 в хряще во время приступа.

В соответствии с данным изобретением пациентов, страдающих от деструкции суставного хряща, опосредованной Т-клетками, можно лечить, используя терапевтическую композицию, включающую один или более пептидов по данному изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель. Введение фармацевтической композиции по данному изобретению индуцирует системную иммунологическую толерантность, в частности толерантность специфических аутореактивных Т-клеток таких пациентов, по отношению к аутоантигенным белкам в больном суставном хряще и другим аутоантигенам, имеющим идентичные (опосредованные) связующие Т-клеточные эпитопы ГКГС, класс II, характеризуемые или имитируемые аминокислотными последовательностями одного или нескольких пептидов по данному изобретению. Индуцированная толерантность приводит таким образом к снижению местной воспалительной реакции в суставном хряще при атаке.

Весьма подходящими пептидами для использования в фармацевтической композиции по данному изобретению являются пептиды, имеющие 16-55, предпочтительно 16-35, более предпочтительно 16-25 и наиболее предпочтительно 16 аминокислотных остатков, при этом указанные пептиды включают по крайней мере одну из аминокислотных последовательностей LVCYYTSWS (SEQ ID NO: 60), FLCTHIIYS (SEQ ID NO:61), IIYSFANIS (SEQ ID NO:62), LKTLLSVGG (SEQ ID NO: 63), FIKSVPPFL (SEQ ID NO:64), FDGLDLAWL (SEQ ID NO:65), LYPGRRDKQ (SEQ ID NO: 66), YDIAKISQH (SEQ ID NO:67), LDFISIMTY (SEQ ID NO:68), FISIMTYDF (SEQ ID NO: 69), FRGQEDASP (SEQ ID NO:70), YAVGYMLRL (SEQ ID NO:71), MLRLGAPAS (SEQ ID NO: 72), LAYYEICDF (SEQ ID NO: 73), LRGATVHRT (SEQ ID NO:74), YLKDRQLAG (SEQ ID NO:75), LAGAMVWAL (SEQ ID NO:76), VWALDLDDF (SEQ ID NO:77) или LDLDDFQGS (SEQ ID NO:78), более конкретно одну из аминокислотных последовательностей YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1), YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO: 2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO: 5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), NTQSRRTFIKSVPPFL (SEQ ID NO:16), TFIKSVPPFLRTHGFD (SEQ ID NO:17), PPFLRTHGFDGLDLAW (SEQ ID NO:18), HGFDGLDLAWLYPGRR (SEQ ID NO: 19), DLAWLYPGRRDKQHFT (SEQ ID NO:20), TIDSSYDIAKISQHLD (SEQ ID NO: 28), DIAKISQHLDFISIMT (SEQ ID NO:29), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), PASKLVMGIPTFGRSF (SEQ ID NO:39), GTLAYYEICDFLRGAT (SEQ ID NO: 46), EICDFLRGATVHRTLG (SEQ ID NO:47), RGATVHRTLGQQVPYA (SEQ ID NO: 48), VKSKVQYLKDRQLAGA (SEQ ID NO:53), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54), LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO: 55), WALDLDDFQGSFCGQD (SEQ ID NO:56) или DFQGSFCGQDLRFPLT (SEQ ID NO:57).

Особо предпочтительными в фармацевтической композиции по данному изобретению являются пептиды, имеющие 16-55, предпочтительно 16-35, более предпочтительно 16-25 и наиболее предпочтительно 16 аминокислотных остатков, при этом указанные пептиды включают по крайней мере одну из аминокислотных последовательностей YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1), YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO: 2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO: 5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55).

Весьма предпочтительными в фармацевтической композиции по данному изобретению являются пептиды, имеющие 16-55, предпочтительно 16-35, более предпочтительно 16-25 и наиболее предпочтительно 16 аминокислотных остатков, при этом указанные пептиды имеют по крайней мере одну из аминокислотных последовательностей YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55).

Наиболее предпочтительными в фармацевтической композиции по данному изобретению являются гексадекапептиды, состоящие из аминокислотной последовательности YKLVCYYTSWSQYREG (SEQ ID NO:1), YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO: 2), LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO: 5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO: 55), в частности аминокислотные последовательности YTSWSQYREGDGSCFP (SEQ ID NO:2), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55).

Преимуществом пептидов по данному изобретению является то, что они оказывают специфическое действие на аутореактивные Т-клетки, оставляя таким образом другие компоненты иммунной системы интактными по сравнению с неспецифическим супрессивным действием иммуносупрессивных лекарственных средств. Лечение пептидами по данному изобретению является безопасным и не вызывает токсического побочного действия.

Системная иммунологическая толерантность может быть достигнута путем введения высоких или низких доз пептидов по данному изобретению. Количество пептида зависит от способа и времени введения, возраста пациента, а также от общего состояния здоровья и диеты.

В целом, может быть использована дозировка, составляющая 0,01-1000 мкг пептида на кг массы тела, предпочтительно 0,5-500 мкг, более предпочтительно 0,1-100 мкг.

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, стерильный солевой раствор, лактозу, сахарозу, фосфат кальция, желатин, декстрин, агар, пектин, арахисовое, оливковое, кунжутное масло и воду. Другими носителями могут быть, например, молекулы главного комплекса гистосовместимости, класс II, при желании внедренные в липосомы.

Кроме того, фармацевтические композиции по данному изобретению могут включать один или более адъювантов. Подходящие адъюванты включают, среди прочих, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, амфиген, токофенолы, монофосфенил липид А, мурамил дипептид и сапонины, такие как Quill A. Предпочтительно адъювантами, используемыми в толерантной терапии по данному изобретению, являются адъюванты слизистой оболочки, такие как токсин холеры, подъединица В, или карбомеры, связывающиеся с эпителием слизистой оболочки. Количество адъюванта зависит от природы самого адъюванта.

Далее, фармацевтическая композиция по данному изобретению может включать один или несколько стабилизаторов, таких как, например, углеводы, включая сорбит, маннит, крахмал, сахарозодекстрин и глюкозу, белки, такие как альбумин или казеин, и буферные растворы, такие как щелочные фосфаты.

Подходящими способами введения являются внутримышечные, подкожные и внутривенные инъекции или внутрибрюшинные инъекции, пероральное введение и назальные аэрозоли.

Пептиды по данному изобретению также хорошо подходят для использования в диагностическом способе обнаружения активированных аутореактивных Т-клеток, вызывающих хроническое воспаление и разрушение суставного хряща.

Диагностический способ по данному изобретению включает следующие стадии: a) отделение периферических мононуклеарных (одноядерных) клеток крови (РВМС) от образца крови индивидуума; b) культивирование указанных периферических мононуклеарных (одноядерных) клеток крови в подходящих условиях, c) инкубирование указанной культуры периферических мононуклеарных (одноядерных) клеток крови и присутствии одного или нескольких пептидов по данному изобретению, и d) определение реакции Т-клеток, например пролиферативной реакции, означающей присутствие активированных аутореактивных Т-клеток в индивидууме.

Определение пролиферативной реакции Т-клеток может осуществляться, например, путем введения ³Н-тимидина.

В объем данного изобретения также входят тест-наборы, включающие один или более пептидов по данному изобретению. Такие тест-наборы подходят для использования в диагностическом способе по данному изобретению.

Следующие примеры иллюстрируют данное изобретение, однако никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

ПРИМЕРЫ СПОСОБЫ Пациенты Это исследование включает 7 DR4 (DRB1^*0401)-положительных пациентов с диагнозом: ревматоидный артрит по критериям ARA (Arnett et al. (1988), Arthritis Rheum. 31, 315). Под расписку получают образцы периферической крови. Группа включает 5 женщин и 2 мужчин в возрасте 46-79 лет. Длительность их заболевания составляет от свыше 10 до свыше 30 лет. 3 из 7 пациентов имеют по крайней мере по 3 опухших сустава. У четырех пациентов не наблюдается каких-либо симптомов активного заболевания. Все пациенты получают лекарственные препараты: 4 пациента - преднизон, 3 пациента - антиревматические препараты и 4 пациента получают также нестероидные противовоспалительные лекарственные средства.

Под расписку получают образцы периферической крови от 5 здоровых доноров, обладающих специфичностью DR4 (DКВ1^*0401), и включают в данное исследование в качестве контроля.

Определение полиморфизмов "человеческие лейкоцитарные антигены - реакция дегенерации" (HLA-DR) Периферические мононуклеарные (одноядерные) клетки крови пациентов и здоровых доноров, отделенные от гепаринизированной периферической крови стандартным центрифугированием на Ficoll-Paque, стимулируют фитогемагглютинином (Welcome, Dartford, UK) для получения 5•10⁶-10⁷ лимфоцитов. Для очистки хромосомной ДНК от культивируемых клеток используют набор для анализа крови QIA амп (QIAGEN Inc.) в соответствии с инструкциями изготовителя. Экстракты хромосомной ДНК анализируют, используя набор SSP "низкого разрешения" для определения реакции дегенерации. Используя набор Dynal DRB1^*04-SSP, проводят субтипирование реакции дегенерации 4. Типирование реакции дегенерации главного комплекса гистосовместимости проводят в Transplant Serology Laboratory, University Hospital, Nijmegen, the Netherlands (см. табл. I).

Синтез пептидов Пептиды синтезируют в Eurosequence (Groningen, the Netherlands). Пептиды синтезируют, начиная с карбоксильного конца до аминоконца по 10-мкмольной шкале, используя твердофазную химию FMOC. Сырые пептиды частично очищают несколькими другими препаратами. Как указывает изготовитель по крайней мере 35% лиофилизированного продукта содержат желаемый продукт, имеющий полную длину. Качество конечного продукта проверяют, используя анализ последовательности, аминокислотный анализ и/или жидкостную хроматографию высокого разрешения ревматоидного фактора (RF-HPLC). Последовательности синтезированных пептидов перечислены в табл. II.

Анализ на связывание пептидов человеческих лейкоцитарных антигенов - реакция дегенерации (HLA-DR)
Используя mab L243, направленный против мономорфной детерминанты комплекса реакции дегенерации (DR), DR4 (DRBl^*0401) и молекулы DR4 (DRB1^*0404) очищают от гомозиготных человеческих В лимфобластоидных человеческих линий Huly 138IC2 и ВМ92, трансформированных вирусами Эпстайна-Барра (L.A. Lampson, R. Levy (1980), J. Immunol. 125:293-299).

Используя полуколичественный анализ конкурентного связывания, проводят исследования по связыванию пептидов (Joosten et al., 1994, Int. Immunol. 6, 751). При этом очищенные молекулы HLA-DR (30 нМ DR4 (DRB1^*0401) или 15 нМ DR4 (DRB1^*0404)) инкубируют при рН 5,0 с 50 нМ биотинилированного пептида-маркера (НА 309_Y-->_F) и концентрации конкурентного пептида в конечном объеме 25 мкл связующего буфера (сополимер стирола с бутадиеном, содержащий 0,01% NaN₃, 0,05% NP-40, 5% диметилсульфоксида, 1 мМ 4-(2-аминоэтил)-бензол сульфонил фторида, 1 мМ N-этил малеимида, 8 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты и 10 мкм пепстатина А). Через 44 часа инкубирования при комнатной температуре, HLA-DR-связанный пептид-маркер отделяют от свободного пептида-маркера, используя 96-луночный вакуумный пунктирно-штриховой аппарат (Hybry.dot, BRL) и нитроцеллюлозную мембрану (Hybond ECL, Amersham, UK). Нитроцеллюлозные фильтры блокируют 0,5% блокирующим реагентом ДНК (Boehringer) в 0,1 М малеиновой кислоте, 150 мМ NaCl, рН 7,5. Через 0,5-1 час фильтры промывают в фосфатно-буферном солевом растворе, 0,05% Твин 20 (Siqma) и инкубируют Streptavidin-HRPO (Southern Biotechnology) при разбавлении 1:10000. Биотинилированные пептиды определяют по увеличению хемолюминесценции (ECL), используя набор ECL Western Blot (Amersham). Выдержка предварительно подсвеченных пленок (Hyperfilm-ECL Amersham) составляет 10 минут. Пятна анализируют, сканируя пленки и используя для анализа математическое обеспечение Image Quant/Excel.

Аффинность определенного пептида к связыванию молекул, кодированных DBR1^*0401, связана с конкурентностью с пептидом-маркером. Относительную связывающую аффинность определяют как концентрацию пептида, при которой сигнал снижается до 50% (IC₅₀).

Пролиферативная реакция мононуклеарных (одноядерных) клеток крови
Для идентификации эпитопов Т-клеток внутри НС gр-39 59 пептидов длиной 16 АА, перекрывающие 10 АА, подвергают анализу на способность индуцировать пролиферативную реакцию периферических мононуклеарных клеток крови у больных ревматоидным артритом и здоровых контрольных образцов, обладающих специфичностью DR4 (DRB1*0401)(табл. I). В табл. II перечислены последовательности подвергнутых анализу пептидов.

Периферические мононуклеарные клетки крови, полученные из гепаринизированной венозной периферической крови, отделяют обычным центрифугированием на градиенте Ficoll-Paque.

Клетки культивируют в четырех повторах при концентрации 1,5•10⁵ клеток на лунку в среде, дополненной 10% термоактивированной аутореактивной плазмой, L-глутамином, 2-МЕ и антибиотиками в микротитрационных планшетах с плоским дном. Клетки инкубируют в этой среде или в присутствии фитогемагглютинина (РНА) (2,5 мкг/мл) для подтверждения жизнеспособности клеток или же в присутствии 10 или 100 мкг/мл пептидов, полученных из НС gр-39. В некоторых случаях анализу подвергаются группы из двух или трех последовательных пептидов из-за ограниченного числа периферических мононуклеарных клеток крови отдельных доноров. Культуры общим объемом 210 мкл инкубируют в течение 7 дней при 37^oС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СO₂. На протяжении последних 18 часов культурам дают импульсы, используя 0,25 мкСi ³H-тимидин ([³H]TdR). Клетки собирают на фильтры из стекловолокна, и измеряют включение [³H] TdR газовой сцинтилляцией (β-счетчик Packard Matrix 96). Считается, что только пептиды, индуцирующие пролиферативную реакцию как при 10, так и 100 мкг/мл, содержат Т-клеточный эпитоп. Реакция определяется как положительная, если величина коэффициента стимулирования (SI, антигенспецифический подсчет за 5 минут (ср5m)/фенотип ср5m) выше или равна 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ
Идентификация Т-клеточных эпитопов по пролиферативной реакции мононуклеарных клеток крови
Реактивность Т-клеток по отношению к пептидам, полученным из НС др-39, анализируется путем измерения пролиферативной реакции периферических мононуклеарных клеток крови у DR4 (DRB1^*0401)-положительных пациентов с ревматоидным артритом и здоровых доноров. В табл. IIIA и IIIB приведены результаты 7 экспериментов, показывающие реакцию больных ревматоидным артритом (табл. IIIA) и реакцию здоровых доноров (табл. IIIB) по отношению к 59 перекрывающим последовательностям, полученным из НС др-39. Доноры, реагирующие на обе концентрации (100 и 10 мкг/мл) пептида, считаются респондерами (R), а доноры, не реагирующие на обе исследуемые концентрации, считаются нереспондерами (NR).

Реакция на отдельные пептиды 1, 2, 5, 6, 12, 15, 30, 34, 37, 38, 40, 41, 54 и 55 (номера отвечают соответствующим SEQ ID NO каждого пептида, например пептид 30 означает: пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30) наблюдается у одного или нескольких доноров, идентифицируя таким образом эти последовательности как Т-клеточные эпитопы.

Интересно отметить, что реакция на пептиды 2, 34, 38, 40, 54 и 55 наблюдалась только у больных ревматоидным артритом.

С другой стороны, пептиды 12 и 41 индуцировали реакцию только у здоровых доноров (230, 235).

Кроме того, как видно из табл. III, реакция имеет место в следующих группах пептидов: 1/2, 1/2/3, 4/5/6, 5/6, 15/16, 17/18, 19/20, 28/29/30, 29/30, 37/38, 37/38/39, 39/40, 46/47/48, 53/54, 55/56 и 55/56/57. Эти результаты согласуются с большей частью результатов отдельных вышеуказанных пептидов. Более того, реакция против групп пептидов определяет участки, содержащие дополнительные Т-клеточные эпитопы, т.е. участки, покрытые пептидами 16-20 (остатки 112-151), 28-29 (остатки 184-205), 38-40 (остатки 244-271), 46-48 (остатки 293-319) и 53-57 (334-373).

6 из 7 DR4 (DRB1^*0401)-положительных больных с ревматоидным артритом реагируют на пептиды, полученные из НС gр-39, или группы пептидов и поэтому считаются респондерами. В группе здоровых доноров 3 из 5 доноров оказались респондерами. В целом, оказалось, что больные с ревматоидным артритом реагируют на гораздо большее число участков НС gp-39, чем здоровые доноры (здоровый донор 230 представляет собой исключение). Например, периферические мононуклеарные клетки крови больного 272 с ревматоидным артритом, исследовавшиеся на отдельные пептиды, реагируют в общей сложности на 11 пептидов (1, 2, 5, 6, 30, 34, 37, 38, 40, 54 и 55). Периферические мононуклеарные клетки крови других больных (больной 287 является исключением) реагируют против групп пептидов, перекрывающих эти 11 последовательностей, и идентифицируют некоторые дополнительные участки, содержащие Т-клеточные эпитопы (пептиды 14-20 и 46-48).

Периферические мононуклеарные клетки крови, полученные от здорового донора (230), еще больше подтверждают присутствие Т-клеточных эпитопов в пептидах 1, 5, 6, 15, 30 и 37.

В целом, наиболее часто распознаваемые пептиды или группы пептидов содержат пептиды 1/2, 5/6, 30, 37/38, 54/55.

Корреляция Т-клеточных эпитопов и связывания DRB4 (DRB1^*0401)
Было найдено, что все пептиды 1, 2, 5, 6, 12, 15, 30, 34, 37, 38, 40, 41, 54 и 55 стимулируют Т-клетки, полученные из периферической крови. Было найдено, что все эти пептиды связываются с DR4 (DRB1^*0401) с относительно высокой аффинностью (за исключением пептидов 2 и 38, которые связываются с промежуточной относительной аффинностью). Пептиды 3, 4, 16, 17, 18, 19, 20, 28, 29, 39, 46, 47, 48, 53, 56 и 57 исследовались в группах, а не индивидуально. Весьма вероятно, что некоторые из этих пептидов также содержат релевантные Т-клеточные эпитопы. В любом случае, все эти пептиды могут связывать DRB4 (DRB1^*0401) с высокой или средней относительной аффинностью (за исключением пептида 20, связывающего с плохой относительной аффинностью).

В табл. IIIA: pos = положительная реакция на 100 и 10 микрограмм/мл пептида или групп пептидов (SI≥2 считается положительным). Вместе пептиды (длиной 16 AА, перекрываемые 10 АА) покрывают полную зрелую последовательность зрелого НС gр-39 (остатки 22-383). Пептиды синтезируют в Eurosequence (Groninden, the Netherlands). RA = больной ревматоидным артритом. 0401 = донор, несущий RA-ассоциированную HLA-DRB1^*0401 специфичность. NR = нереспондер. R = респондер. BG = среднее количество фенотипов, подсчитанное за 5 минут х 10¹³, измеряемое в лунках без антигена. +++ = связывание с высокой аффинностью (IC50<1 мкМ); ++ = связывание с хорошей аффинностью (1<IC50<10 мкМ); + = среднее связывание (10<IC50<100 мкМ); +/- = плохое связывание (100<IC50<1000 мкМ); - = отсутствие связывания (IC50>1000 мкМ).

В табл. IIIB: роs = положительная реакция на 100 и 10 микрограмм/мл пептида или групп пептидов (SI≥2 считается положительным). Вместе пептиды (длиной 16 АА, перекрываемые 10 АА) покрывают полную зрелую последовательность зрелого НС gр-39 (остатки 22-383). Пептиды синтезированы в Eurosequence (Groningen, the Netherlands). HD = здоровый донор. 0401 = донор, несущий RA-ассоциированную HLA-DRB1^*0401 специфичность. NR = нереспондер. R = респондер. BG = среднее количество фенотипов, подсчитываемое за 5 минут х 10^-3, измеряемое в лунках без антигена. +++ = связывание с высокой аффинностью (IC50<1 мкМ); ++ = связывание с хорошей аффинностью (1<IC50<10 мкМ); + = среднее связывание (10<IC50<100 мкМ); +/- = плохое связывание (100<IC50<1000 мкМ); - = отсутствие связывания (IC50>1000 мкМ).

СОКРАЩЕНИЯ
AEBSF: 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонил фторид
ВВ: связывающий буфер
ВСА: бицинхиноновая кислота
BSA: бычий сывороточный альбумин
DMSO: диметилсульфоксид
ECL: повышенная хемолюминесценция
EDTA: этилендиаминтетрауксусная кислота
FACS: установка для сортировки клеток с флуоресцентным возбуждением
HLA: лейкоцитарные антигены главного комплекса гистосовместимости человека
HPLC: жидкостная хроматография высокого давления
HRP: пероксидаза из хрена
МНС CLASS II: главный комплекс гистосовместимости, класс II
NMR: ядерный магнитный резонанс
NP-40: Нонидет Р-40
PBS: фосфатно-буферный солевой растворPVDF: поливинилиден дифторид
RA: ревматоидный артрит
SDS-PAGE: анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсулфатом натрия
Перечень последовательностей приведен в конце описания.

Формула изобретения

1. Пептиды, состоящие из 16-55 аминокислотных остатков, при этом указанный пептид включает, по крайней мере, одну из аминокислотных последовательностей: FLCTHIIYS (SEQ ID NO:61), IIYSFANIS (SEQ ID NO:62), FIKSVPPFL (SEQ ID NO:64), FDGLDLAWL (SEQ ID NO:65), LYPGRRDKQ (SEQ ID NO:66), YDIAKISQH (SEQ ID NO: 67), LDFISIMTY (SEQ ID NO:68), FISIMTYDF (SEQ ID NO:69), FRGQEDASP (SEQ ID NO:70), YAVGYMLRL (SEQ ID NO:71), MLRLGAPAS (SEQ ID NO: 72), LAYYEICDF (SEQ ID NO:73), LRGATVHRT (SEQ ID NO:74), YLKDRQLAG (SEQ ID NO: 75), LAGAMVWAL (SEQ ID NO:76), VWALDLDDF (SEQ ID NO:77) или LDLDDFQGS (SEQ ID NO:78).

2. Пептид, состоящий из 16-55 аминокислотных остатков, при этом указанный пептид включает, по крайней мере одну, из аминокислотных последовательностей: LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO: 5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), NTQSRRTFIKSVPPFL (SEQ ID NO:16), TFIKSVPPFLRTHGFD (SEQ ID NO:17), PPFLRTHGFDGLDLAW (SEQ ID NO:18), HGFDGLDLAWLYPGRR (SEQ ID NO: 19), DLAWLYPGRRDKQHFT (SEQ ID NO:20), TIDSSYDIAKISQHLD (SEQ ID NO: 28), DIAKISQHLDFISIMT (SEQ ID NO:29), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), PASKLVMGIPTFGRSF (SEQ ID NO:39), GTLAYYEICDFLRGAT (SEQ ID NO: 46), EICDFLRGATVHRTLG (SEQ ID NO:47), RGATVHRTLGQQVPYA (SEQ ID NO: 48), VKSKVQYLKDRQLAGA (SEQ ID NO:53), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54), LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO: 55), WALDLDDFQGSFCGQD (SEQ ID NO:56) или DFQGSFCGQDLRFPLT (SEQ ID NO:57).

3. Пептид по п.1 или 2, при этом указанный пептид включает, по крайней мере одну, из аминокислотных последовательностей: LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO: 5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55).

4. Пептид по любому из пп.1-3, при этом указанный пептид включает, по крайней мере одну, из аминокислотных последовательностей: SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO: 34), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO:38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55).

5. Гексадекапептид по пп.1-4, при этом указанный гексадекапептид состоит, по крайней мере из одной, аминокислотной последовательности: LDRFLCTHIIYSFANI (SEQ ID NO:5), THIIYSFANISNDHID (SEQ ID NO:6), PNLKTLLSVGGWNFGS (SEQ ID NO:12), QHLDFISIMTYDFHGA (SEQ ID NO:30), SPLFRGQEDASPDRFS (SEQ ID NO:34), DYAVGYMLRLGAPASK (SEQ ID NO:37), MLRLGAPASKLVMGIP (SEQ ID NO: 38), YLKDRQLAGAMVWALD (SEQ ID NO:54) или LAGAMVWALDLDDFQG (SEQ ID NO:55).

6. Пептид по любому из пп.1-5, обладающий способностью индуцировать Т-клеточную специфическую толерантность.

7. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью индуцировать Т-клеточную специфическую толерантность, включающая один или несколько пептидов по любому из пп.1-5, а также фармацевтически приемлемый носитель.

8. Диагностический способ обнаружения активированных ауто-реактивных Т-клеток, включающий следующие стадии: а) отделение периферических мононуклеарных клеток крови (РВМС) от образца крови индивидуума, b) культивирование указанных периферических мононуклеарных клеток крови в подходящих условиях, с) инкубирование указанной культуры периферических мононуклеарных клеток в присутствии одного или нескольких пептидов по любому из пп.1-5, d) определение реакции Т-клеток, например, пролиферативной реакции, означающей присутствие активированных аутореактивных Т-клеток в индивидууме.

9. Тест-набор для определения активированных аутореактивных Т-клеток, при этом указанный тест/набор включает один или несколько пептидов по любому из пп.1-5.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51