Рекомбинантная плазмидная днк ppho-sod23, кодирующая синтез супероксиддисмутазы человека, и штамм saccharomyces cerevisiae № д-11 вниисхм-продуцент супероксиддисмутазы человека

 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, в частности к технологии получения препаратов супероксиддисмутазы (СОД). Рекомбинантная плазмидная ДНК pPHO-SOD23, кодирующая синтез супероксиддисмутазы человека, состоящая из EcoR I/BamH I фрагмента р33, экспрессионной кассеты с геном SOD, Hind III/BamH I - фрагмента с последовательностью алкогольдегидрогеназного терминатора транскрипции и BamHl- фрагмента с последовательностью Hbs-антигена гепатита В. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Д-11 ВНИИСХМ, продуцент супероксиддисмутазы, полученный трансформацией клеток реципиентного штамма 20В12 Saccharomyces cerevisiae генотипа trPU плазмидной ДНК рРНО-SOD23, обладает способностью к селективному поддержанию экспрессионной плазмиды на средах любого состава, не содержащих триптофана. Штамм позволяет существенно повысить выход СОД (содержание СОД в лизате составляет 4200 мкг на мл лизата). 2 с.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, в частности к технологии получения препаратов супероксиддисмутазы (СОД).

Описанный в настоящее время дрожжевой штамм-продуцент супероксиддисмутазы человека синтезирует целевой продукт конститутивно, что ограничивает рост, уменьшает выход биомассы и, соответственно, снижает продуктивность и генетическую стабильность.

Известно получение СОД на основе дрожжевых штаммов (Biotechnology, 1987, v.5, p.363-366).

Недостатком указанной технологии является необходимость использования дорогостоящих селективных сред, а также относительно невысокая стабильность штамма.

Прототипом заявляемой группы изобретений является штамм Saccharomyces cerevisiae YBS13Chgk/pBr-SOD-PGKdel и используемая при его создании экспрессионная плазмида pBr-SOD-PGKdel (пат. РФ 2044771, 1995, кл. C 12 N 1/16).

Недостатком данного штамма и используемой при этом плазмиды является недостаточная стабильность свойств при культивировании.

Задачей, решаемой авторами, являлось создания плазмиды и штамма, позволяющих получать СОД с достаточно высоким выходом на относительно дешевых средах с более высокой стабильностью свойств при культивировании.

Задача была решена созданием дрожжевой экспрессионой плазмиды pPHO-SOD23, содержащей последовательность гена супероксиддисмутазы человека, находящегося под контролем дрожжевого фосфатазного промотора и алкогольдегидрогеназного терминатора транскрипции, а также содержащей последовательность Hbs-антигена гепатита В для стабилизации плазмидной конструкции в дрожжевых клетках; трансформацией этой плазмидой дрожжевого штамма Saccharomyces cerevisiae 20B12; и, в результате, созданием дрожжевого штамма продуцента супероксиддисмутазы человека.

Схема плазмиды pPHO-SOD23 представлена на фиг.1, где А - соответствует EcoRI/BamHI фрагменту коммерческой плазмиды р33 и содержит: А1 - дрожжевой фосфотазный промотор рРНО5, А2 - фрагмент дрожжевой 2 мкм плазмиды В-типа, содержащий ori этой плазмиды, A3 - дрожжевой активный ген TRP1, А4 - фрагмент плазмиды pBR322, содержащий ori и ген BLA этой плазмиды, А5 - дрожжевой фосфатазный терминатор транскрипции tPHО5; В - соответствует последовательности Hbs-антигена гепатита В, фланкированного BamHI сайтами; С - соответствует последовательности алкогольдегидрогеназного терминатора транскрипции (Hind^III/BamHI фрагменту); D - экспрессионная кассета с геном SOD, фланкированная сайтами EcoRI/KpnI, которая имеет следующий вид (см. последовательность 1).

Плазмида pPHO-SOD23 была получена следующим образом. Комплементарная ДНК (кДНК) была синтезирована обратной транскрипцией на матрице информационной РНК, выделенной из плаценты человека. Ген СОД был получен методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на матрице кДНК плаценты человека с затравками, представляющими собой последовательности начала и конца гена СОД человека, содержавшими его сайт инициации (ATG) и терминации (TAATGA) трансляции. К продукту, полученному методом ПЦР, пришивали HindIII адаптеры и клонировали ген СОД человека в HindIII сайт коммерческой плазмиды рААН5. Затем EcoRI-BamHI фрагмент полученной плазмиды, содержащий ген СОД и дрожжевой алкогольдегидрогеназный терминатор транскрипции, был объединен с большим EcoRI-BamHI фрагментом коммерческой плазмиды р33. В полученную плазмиду был встроен BamHI фрагмент плазмиды р33, содержащий последовательность Hbs-антигена гепатита В.

В качестве реципиентного штамма при трансформации плазмидой pPHO-SOD23 использовали дрожжевой штамм Saccharomyces cerevisiae 20B12 генотипа trp1. Трансформанты отбирали по способности к росту на среде, не содержащей триптофана. Один из таких клонов отобран в качестве продуцента и обозначен 20B12/pPHO-SOD23.

Исходя из метода конструирования, в случае утери плазмиды образуется реципиентная клетка генотипа trp^-; такие клетки не способны вести биосинтез триптофана и являются нежизнеспособными на селективной среде. Таким образом, созданный штамм продуцент обладает способностью к селективному поддержанию экспрессионной плазмиды на средах любого состава, не содержащих триптофана.

Штамм Saccharomyces cerevisiae 20B12/pPHO-SOD23 депонирован в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) под номером Д-11 ВНИИСХМ.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Вегетативные клетки двухсуточной культуры, выращенной на твердой питательной среде с 2% глюкозы в качестве единственного источника углерода, имеют овальную форму, размер клеток 10-15 мкм, протоплазма гомогенная, размножение почкованием.

При выращивании на богатой твердой среде YEPD при 30^oС через 72 ч роста колонии имеют следующий вид: колонии белого цвета с ровным или слегка зазубренным краем, матовой поверхностью, приподнятые, непрозрачные.

Рост в жидкой селективной глюкозо-минеральной среде без фосфата, содержащей 0,1% дрожжевого экстракта при 28-32^oС: в течение первых 24 ч культивирования жидкость мутная, осадок белый, не комкуется, пристеночных пленок не образует. Температура роста 25-33^oС (оптимум 28^oС), рН культивирования 4,8-7,0 (оптимум 6,0).

Ассимиляция источников углерода: сбраживает глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, декстрины, крахмал, ассимилирует этанол, глицерин, лактат; не ассимилирует ацетат.

Ассимиляция источников азота: усваивает аминокислоты, мочевину, соли аммония; нитраты не востанавливает.

Штамм Saccharomyces cerevisiae Д-11 ВНИИСХМ не патогенен. Штамм хранится на агаризованной богатой среде YEPD с глюкозой в течение 3 месяцев при +4^oС.

Возможность практического применения штамма иллюстрируется следующим примером.

Пример Клетки штамма-продуцента Д-11 ВНИИСХМ и исходного штамма 20В12 выращивали в колбах при 29±1^oС и аэрации на среде следующего состава на 1 л: дигидрофосфат кальция 1 г, хлорида натрия 0,1 г, сульфат аммония 5 г, казаминовые кислоты (или пептон - НСl гидролизат) 10 г, глюкоза безводная 20 г, сернокислый магний 0,5 г, хлористый кальций 0,1 г, йодистый калий 100 мкг, борная кислота 10 мкг, сернокислое железо 50 мкг, сернокислый марганец 10 мкг, урацил 20 мкг, инозин 10 мкг, канамицин 50 мкг, рибофлавин 0,2 мкг, никотиновая кислота 0,2 мкг, 4-аминобензойная кислота 0,2 мкг, пантетонат кальция 0,2 мкг, пиридоксин 0,2 мкг, тиамин бромид 0,2 мкг, биотин 0,002 мкг. Исходный титр культур составлял 10² кл./мл. Через 18-20 ч выращивания (5•10⁶ кл./мл) культуры переводили на среду, содержащую на 1 л: хлористый калий 1 г, хлористый натрий 0,1 г, сульфат аммония 5 г, казаминовые кислоты (или пептон - НСl гидролизат) 10 г, дрожжевой экстракт 1 г, сульфат цинка 16 мг, глюкоза безводная 20 г, сернокислый магний 0,5 г, хлористый кальций 0,1 г, йодистый калий 100 мкг, борная кислота 10 мкг, сернокислое железо 50 мкг, сернокислый марганец 10 мкг, урацил 20 мкг, инозин 10 мкг, канамицин 50 мкг, рибофлавин 0,2 мкг, никотиновая кислота 0,2 мкг, 4-аминобензойная кислота 0,2 мкг, пантетонат кальция 0,2 мкг, пиридоксин 0,2 мкг, тиамин бромид 0,2 мкг, биотин 0,002 мкг. При этом исходную культуру разводили в 5 раз, до титра 1•10⁶ кл. /мл. Через 20-24 ч культивирования культуры переходили в стационарную фазу роста при титре 1,2•10⁸ кл./мл. Выход биомассы дрожжей, 80%-ной влажности, составлял 15 г/л. Биомассу, собранную в этот период культивирования, использовали для анализа супероксиддисмутазы. Клетки из 20 мл культуры собирали центрифугированием, промывали водой, суспендировали в 20 мл 20 mM фосфатного буфера и разрушали после добавления равного объема стеклянных шариков на вибраторе типа "Вортекс" 4 раза по 5 мин. Для получения фракции растворимых белков дебрис отделяли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20 мин. Осветленный таким образом клеточный экстракт анализировали электрофоретически и определяли в нем содержание супероксиддисмутазы. По результатам электрофореза (фиг.2, где дорожка 1 - чистый препарат СОД человека, дорожка 2 - экстракт клеток штамма 20В12, дорожка 3 - экстракт клеток штамма Д-11 ВНИИСХМ) видно, что штамм-продуцент содержит существенное количество супероксиддисмутазы человека, отсутствующей в экстракте исходного штамма. Из данных денситометрии полосы 3 этой электрофореграммы следует, что супероксиддисмутаза человека составляет 20% растворимого клеточного белка.

Наличие супероксиддисмутазы в клеточных экстрактах измеряли с помощью иммуноферментного анализа по взаимодействию целевого белка с парой моноклональных антител, одно из которых коньюгировано с пероксидазой хрена, что позволяет количественно тестировать присутствие супероксиддисмутазы человека в образцах. Было установлено, что содержание СОД в лизате составляет 4200 мкг на мл лизата.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPHO-SOD23, кодирующая синтез супероксиддисмутазы человека, состоящая из EcoR I/BamH I фрагмента коммерческой плазмиды рЗЗ, экспрессионной кассеты с геном SOD (EcoR I/Крn I фрагмент), последовательности алкогольдегидрогеназного терминатора транскрипции (Hind III/BamH I фрагмент) и последовательности Hbs-антигена гепатита В (ВаmН I фрагмент).

2. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Д-11 ВНИИСХМ - продуцент супероксиддисмутазы.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3