Набор рекомбинантных плазмидных днк рyai 11-19, рyai 2-45, рys 37 и рyai 7-29 для определения происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом человека

 

Изобретение относится к генетической инженерии и медицинской генетике. Набор рекомбинантных плазмидных ДНК состоит из 4 плазмидных ДНК. рYAI 11-19 является геномным фрагментом ДНК человека размером 1500 пар нуклеотидов. Имеет 4 внутренних уникальных сайта рестрикции ЕсоR1. Фрагмент ДНК ограничен Рst1-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В "мягких" условиях этот ДНК зонд гибридизуется с центромерными районами хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19 или в "жестких" условиях только с центромерным районом хромосомы 10. рYAI 2-45 является геномным фрагментом ДНК человека размером 1100 пар нуклеотидов, имеет 3 внутренних уникальных сайта рестрикции ЕсоR1. Ограничен Pst1-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В "мягких" условиях этот ДНК зонд гибридизуется с центромерными районами хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20. В "жестких" условиях - только с центромерным районом хромосомы 4. рYS 37 является геномным фрагментом ДНК человека размером 680 пар нуклеотидов. Имеет 2 внутренних уникальных сайта рестрикции ЕсоR1. Ограничен Pst1-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В "мягких" условиях этот ДНК зонд гибридизуется с центромерными районами хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У или в "жестких" - только с центромерными районами хромосом 13 и 21. рYAI 7-29 является геномным фрагментом ДНК человека размером 2700 пар нуклеотидов. Имеет 7 внутренних уникальных сайтов рестрикции ЕсоR1. Ограничен Pst1-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В "мягких" условиях этот ДНК зонд гибридизуется с центромерными районами хромосом 1, 11, 17, Х или в "жестких" - только с центромерным районом хромосомы 17. Изобретение позволяет определять происхождение добавочных маркерных (мини-) хромосом человека в практике медицинской генетики, а именно, в пренатальной диагностике, клинической цитогенетике и онкоцитогенетике.

Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для определения происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом человека в норме и патологии, включая пренатальную и постнатальную диагностику хромосомных аномалий, в том числе и добавочные хромосомы при различных формах рака. Проблема происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом и связи их с определенной клинической картиной недостаточно изучена. Эти хромосомы часто сегрегируют в семье и у отдельных ее членов могут вызывать клинические проявления патологии в виде умственной отсталости и врожденных пороков развития, в то время как другие члены семьи фенотипически остаются нормальными. Частота встречаемости маркерных хромосом в популяции сравнима с частотой синдрома Дауна и составляет 1-2 случая на 1000, при этом 40% случаев - семейные. Определение происхождения данных хромосом традиционными цитогенетическими методами крайне затруднено. Как правило, эти лишние акроцентрические или метацентрические хромосомы в кариотипе имеют небольшой размер и состоят из материала различных хромосом или их участков с центромерой и околоцентромерным гетерохроматином. Использование ДНК зондов при гибридизации in situ позволяет определить молекулярный состав добавочных хромосом и их происхождение, а также обосновать тактику проведения генетического консультирования и пренатальной диагностики в семье. При определении происхождения маркерных хромосом необходимо иметь большую коллекцию ДНК зондов на все хромосомы человека, то есть необходимо иметь 24 ДНК зонда и провести 24 реакции гибридизации для каждого исследования маркерной хромосомы. С целью проведения более эффективной диагностики и сокращения числа ДНК зондов при идентификации маркерных хромосом нами был создан набор из 4-х ДНК зондов (pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29) для определения группового происхождения добавочных (мини-) хромосом на первом этапе. Это значительно облегчает ее точную идентификацию на последующих этапах с помощью ДНК зондов определенной группы.

В настоящее время известно, что клонированы и охарактеризованы ДНК зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК зондов чаще всего используют уникальные (однокопийные или малокопийные) последовательности ДНК, которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомоспецифичные ДНК зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократно повторяющиеся, от нескольких сотен до несколько тысяч раз, относительно короткие (длиной до 170 пар нуклеотидов) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК зонды со спецификой для альфоидной ДНК хромосом 1, 3, 11, 13, 18, 21 и Х человека (Гиндилис и др., 1984, 1203108; Юров и др., 1989, 1494724; Юров и др., 1992, 1792429; Юров и др., 1997, 2087533; Соловьев и др., 1997, 2087534; Юров и др., 2000, 2161199). Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК зондов для маркирования других хромосом человека и отдельных групп хромосом.

В литературе описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для отдельных групп и разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипов, предлагаемых в данном изобретении рекомбинантных плазмид. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые гибридизуются с отдельными группами хромосом (Catalog "Aneu Vision", 1999, Vysis Inc. 3100 Woodcreek Drive, Downers Grove, IL 60515-5400). Эти ДНК зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения их конструирования для маркирования хромосом человека в прикладных работах. При этом все описанные в литературе рекомбинантные плазмиды, содержащие альфа-сателлитную ДНК человека со спецификой для отдельных групп хромосом, не обладают достаточно высокой групповой специфичностью. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуется корректная идентификация маркерных хромосом с последующим медико-генетическим консультированием, а также с возможной пренатальной диагностикой, вследствие которой решается вопрос о сохранении или прерывании беременности в результате определения их происхождения. Актуальным в молекулярно-цитогенетической диагностике остается конструирование таких маркеров хромосом человека, которые позволили бы в одних условиях проводить идентификацию центромерных районов определенных групп хромосом в метафазных клетках, а в других - центромерные районы отдельных хромосом.

Изобретение не имеет аналогов, так как подобный набор рекомбинантных плазмид для высокоспецифичного маркирования определенных групп хромосом человека в одних условиях и отдельных хромосом в других условиях разработан впервые. Полученные рекомбинантные плазмиды отличаются от известных по литературе клонированных сателлитных ДНК по способу их получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, а также по особенностям хромосомной локализации и высокой специфичности для определенных групп хромосом человека в одних условиях и отдельных хромосом - в других. Предлагаемое техническое решение не имеет общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогов, т.к. для молекулярного маркирования и цитогенетической идентификации центромерных районов определенных групп хромосом данное техническое решение разработано впервые.

Целью изобретения является создание набора новых эффективных молекулярно-генетических маркеров, а именно, специфичных для центромерных районов, включая гетерохроматин обоих плеч, которые в отличие от описанных в литературе рекомбинантных плазмид, обладали бы следующим преимуществом: строго маркировали околоцентромерные районы определенных групп хромосом в одних условиях и отдельных хромосом в других условиях, без перекрестной гибридизации с другими хромосомами.

Сущность изобретения заключается в том, что клонированные в плазмиде pUC 19 (2700 пар нуклеотидов) по Pst-сайтам фрагменты ДНК человека pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 размерами 1500, 1100, 680 и 2700 пар нуклеотидов, соответственно, представляющие собой последовательности альфоидной ДНК, используются в качестве набора специфических молекулярных маркеров определенных групп хромосом человека в одних условиях ("мягких") и отдельных хромосом - в других ("жестких"). Данные фрагменты относятся к классу альфоидной ДНК и маркируют следующие группы и отдельные хромосомы: 1) последовательность альфоидной ДНК pYAI 11-19 - группу хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19 и в специальных условиях только хромосому 10; 2) последовательность альфоидной ДНК pYAI 2-45 - группу хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20 и в специальных условиях только хромосому 4; 3) последовательность альфоидной ДНК pYS 37 - группу хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У и в специальных условиях только хромосомы 13 и 21; 4) последовательность альфоидной ДНК pYAI 7-29 - группу хромосом 1, 11, 17, X и в специальных условиях только хромосому 17, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК зондов, опытов по блот-гибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ.

Таким образом, эти 4 типа альфа-сателлитных последовательностей ДНК с "относительной хромосомной специфичностью" позволяют выявить маркерные хромосомы из 4-х различных групп хромосом: 1) последовательность альфоидной ДНК pYAI 11-19 - из группы хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19; 2) последовательность альфоидной ДНК pYAI 2-45 - из группы хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20; 3) последовательность альфоидной ДНК pYS 37 - из группы хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У; 4) последовательность альфоидной ДНК pYAI 7-29 - из группы хромосом 1, 11, 17, X.

Новые ДНК зонды отличаются от известных следующими характеристиками: 1) pYAI 11-19 является геномным фрагментом ДНК человека размером 1500 пар нуклеотидов, имеющим 4 внутренних уникальных сайта рестрикции EcoRl и ограниченным Pstl-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется или с центромерными районами хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19 или только с центромерным районом хромосомы 10; 2) pYAI 2-45 - геномным фрагментом ДНК человека размером 1100 пар нуклеотидов, имеющим 3 внутренних уникальных сайта рестрикции EcoRl и ограниченным Pstl-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется или с центромерными районами хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20 или только с центромерным районом хромосомы 4; 3) pYS 37 - геномным фрагментом ДНК человека размером 680 пар нуклеотидов, имеющим 2 внутренних уникальных сайта рестрикции EcoRl и ограниченным Pstl-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется или с центромерными районами хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У или только с центромерными районами хромосом 13 и 21; 4) pYAI 7-29 - геномным фрагментом ДНК человека размером 2700 пар нуклеотидов, имеющим 7 внутренних уникальных сайтов рестрикции EcoRl и ограниченным Pstl-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется или с центромерными районами хромосом 1, 11, 17, X или только с центромерным районом хромосомы 17.

Конкретная цель исследования достигалась следующим образом. Источником выделения маркерных фрагментов pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидуума мужского пола) обрабатывают рестриктазой Pstl до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшивают" с помощью лигирования по "липким" концам в Pstl-сайт бактериального плазмидного вектора pUC19 (2700 пар нуклеотидов). Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "short-gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином.

На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфа-ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (³²P) ДНК тотальной фракции АRI-ДНК человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации, отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.

Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в одноразовых шприцах при температуре 37^oС в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 ч. За 1,5 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки со средой культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М КСl и инкубируют 10 мин при температуре 37^oС. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором в отношении 3:1 трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37^oС и используют в 4 опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения; в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl₂; 0,05 М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл ³Н-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 10 мкл ДНК-полимеразы-1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при температуре 20^oС. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25 х 10 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченных радиоактивными предшественниками рекомбинантных ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 с метафазными хромосомами in situ в "мягких" условиях проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70^o и 96^o спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при температуре 100^oС. Гибридизацию проводят при температуре 37^oС в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при температуре 37^oС, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70^o и 96^o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х 1000 или х 1125.

Гибридизация in situ в специально установленных или "мягких" условиях на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированные фрагменты pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 локализованы в прицентромерных районах определенных групп хромосом человека, а именно: 1) pYAI 11-19 - в группе хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19; 2) pYAI 2-45 - в группе хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20; 3) pYS 37 - в группе хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У; 4) pYAI 7-29 - в группе хромосом 1, 11, 17, X, и являются, таким образом, специфическими молекулярными маркерами данных групп хромосом. Следовательно, эти 4 ДНК зонда позволяют легко определить принадлежность маркерных хромосом к одной из 4-х групп хромосом.

Далее проводят гибридизацию меченных радиоактивными предшественниками рекомбинантных ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 с метафазными хромосомами in situ в "жестких" условиях по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70^o и 96^o спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстран-сульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при температуре 100^oС. Гибридизацию проводят при температуре 42^oС в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 0,1 х SSC при температуре 42^oС, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70^o и 96^o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х 1000 или х 1125.

Гибридизация in situ в специально подобранных или "жестких" условиях на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированные фрагменты pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 локализованы в прицентромерных районах отдельных хромосом человека, а именно, pYAI 11-19 - хромосомы 10; pYAI 2-45 - хромосомы 4; pYS 37 - хромосомы 13 и 21; pYAI 7-29 - хромосомы 17, и являются, таким образом, специфическими молекулярными маркерами названных хромосом.

Использование набора рекомбинантных плазмид ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 для идентификации определенных групп и отдельных хромосом человека в метафазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняется следующими примерами.

Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 М NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатом - 500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при температуре 0-4^oС. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450 g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450 g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис-НСl (рН 8,0), 5 мМ MgCl₂, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450 g, 10 мин).

Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50 мМ трис-НСl, рН 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1%. Лизат инкубируют при температуре 65^oС не менее 1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис-НСl, 89 мМ НВО и 5 мМ EDTA (рН 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см² в течение 6-8 ч.

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ.

Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека Е. coli, несущую плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при температуре 37^oС на качалке в течение 12 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора, содержащего 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCl (рН 8,0), 50 мМ EDTA и 5% тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при температуре 65^oС. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 ч инкубации при температуре 65^oС проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (-18^oС, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1 х SSC (lx SSC г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при температуре 81^oС в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1М КСl+20 мМ трис-НСl при рН 7,1 и температуре 0^oС. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см³ объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают в растворах 50^o изопропилового или 70^o этилового спиртов, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-НСl (рН 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 мин при температуре 0^oС. К клеткам добавляют 2 мл раствора 0,2 N NaOH с 1% SDS для лизиса клеток и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на 1 ч при температуре 0^oС. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (12000 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (-18^oС, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-НСl (рН 8,0)+0,1 М ацетата натрия, и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.

Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-НСl (рН 7,4), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 ч при температуре 37^oС. Реакцию останавливают прогреванием пробы при температуре 70^oС в течение 10 мин.

Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pUC 19, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки, несущие плазмиды с ДНК человека.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры E. coli HB 101, выращивают на качалке при температуре 37^oС до мутности А= 0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до температуры 0^oС раствора 100 мМ CaCl₂, клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мл 100 мМ CaCl₂. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М CaCl₂ с 15%-ным глицерином. Культуру можно трансформировать после инкубации полученной суспензии при температуре 0^oС в течение 30 мин. Она хранится в малых порциях при температуре -80^oС, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4-5 месяцев. К 200 мкл компетентной культуры бактерий при температуре 0^oС добавляют 0,1-0,2 мкг лигированной плазмидной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (температура 42^oС) на 1-1,5 мин и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 ч при температуре 37^oС. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) с добавлением необходимых антибиотиков, обуславливающих селекцию трансформированных клонов, как правило ампициллина.

30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в растворе, содержащем 0,015 М NaCl, 5 мМ СаСl₂, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при температуре 70^oС 10 мин, после чего к смеси добавляют буферный раствор, состоящий из 0,4 М трис-НСl (рН 7,4); 50 мМ MgCl₂, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из ³²P - дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 ч при температуре 37^oС. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5 х 10⁸ имп/мин/мкг ДНК.

Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при температуре 37^oС. Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 М NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив с нижней стороны фильтровальной бумагой, фильтр дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-НСl (рН 7,5), а затем раствором, содержащим 1,5 М NaCl с 1 М трис-НСl (рН 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2 х SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при температуре 37^oС. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при температуре 80^oС в течение 1-2 ч.

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при температуре 68^oС в растворе 2 х SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон-350 в течение 60-90 мин. Вслед за этим фильтр насухо промакают фильтровальной бумагой и помещают в 4-5 мл раствора гибридизационной смеси, содержащей 6 х SSC; 0,1% SDS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу ³²Р-меченой ДНК с суммарной активностью 1-5 • 10⁶ имп/мин. Гибридизацию проводят при температуре 68^oС в течение 18-24 ч. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5 х SSC с 0,5% SDS при температуре 68^oС в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 24 ч экспозиции их проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой Pstl фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенная препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoR 1 и идентификации полосы размером в 680 пар нуклеотидов. В указанный образец ДНК вводится изотопная метка методом замещения, описанным ранее. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, четыре из которых получили название pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29.

Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Difco" США) в одноразовых шприцах при температуре 37^oС в среде Игла с добавлением 20% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За 1 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М КСl и инкубируют в течение 10 мин при температуре 37^oС. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37^oС и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой методом замещения: для каждого образца в четырех пробирках в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно по 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl₂); 0,05 М дитиотреитола, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением Н³-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл Н³-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 5 мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл) и по 5 мкл ДНК (1 мкг) одной из проб pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 в разные пробирки. Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при температуре 20^oС. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25 х 10⁶ импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

На первом этапе гибридизацию меченных радиоактивными предшественниками рекомбинантных ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 с метафазными хромосомами in situ проводят в специально подобранных "мягких" условиях с предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70^o и 96^o этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при температуре 100^oС. Гибридизацию проводят при температуре 37^oС в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при температуре 37^oС, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70^o и 96^o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х 1000 или х 1125.

Гибридизация in situ в "мягких" условиях на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированные фрагменты pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 локализуются только в прицентромерных районах определенных групп хромосом человека (pYAI 11-19 - в группе хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19; pYAI 2-45 - в группе хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20; pYS 37 - в группе хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У; pYAI 7-29 - в группе хромосом 1, 11, 17, X) и являются, таким образом, молекулярными маркерами определенных групп хромосом, специфически маркирующими околоцентромерные районы.

Затем, на втором этапе, проводят гибридизацию меченных радиоактивными предшественниками рекомбинантных ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 с метафазными хромосомами in situ в "жестких" условиях. Препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70^o и 96^o этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстран-сульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при температуре 100^oС. Гибридизацию проводят при температуре 42^oС в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 0,1 х SSC при температуре 42^oС, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70^o и 96^o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х 1000 или х 1125.

Гибридизация in situ в "жестких" условиях на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированные фрагменты pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 локализуются только в прицентромерных районах отдельных хромосом человека (pYAI 11-19 - в хромосоме 10; pYAI 2-45 - в хромосоме 4; pYS 37 - в хромосомах 13 и 21; pYAI 7-29 - в хромосоме 17) и являются, таким образом, молекулярными маркерами определенных хромосом, специфически маркирующими околоцентромерные районы.

Пример 2. Особенно важным является применение набора предлагаемых молекулярных маркеров для распознавания групп и отдельных хромосом в тех случаях, когда в кариотипе имеется добавочная или маркерная (мини-) хромосома неизвестного происхождения.

Все процедуры по выделению образцов ДНК pYAI 11-19; pYAI 2-45; pYS 37; pYAI 7-29 и их обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты с нормальным хромосомным набором от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты с хромосомным набором носителя добавочной или маркерной (мини-) хромосомы. Так при цитогенетическом анализе клеток пробанда была обнаружена маркерная (мини-) хромосома неизвестного происхождения. При этом у ребенка отмечались олигофрения и множество микроаномалий развития. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом оказались малоэффективны. Однако после проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярных маркеров pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 для определенных групп хромосом, установить происхождение маркерной хромосомы не составило труда, так как сразу, на первом этапе, была определена ее принадлежность ко 2-й группе хромосом. На следующем этапе уже с помощью ДНК зонда 2-й группы pYAI 2-45 в "жестких" условиях гибридизации была определена принадлежность добавочной хромосомы. Оказалось, что она является дереватом хромосомы 4. Таким образом, с помощью молекулярных маркеров pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 можно быстро определить происхождение маркерных хромосом в кариотипе, а также обосновать тактику проведения медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в семье при повторных случаях.

Пример 3. Еще одной иллюстрацией практического применения набора предлагаемых молекулярных маркеров для распознавания групп и отдельных хромосом может служить пример, когда в кариотипах пробанда и его матери имеются добавочные или маркерные (мини-) хромосомы неизвестного происхождения. При этом мать фенотипически здорова, а у ребенка отмечаются олигофрения и множество микроаномалий развития.

Все процедуры по выделению образцов ДНК pYAI 11-19; pYAI 2-45; pYS 37; pYAI 7-29 и их обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 3 используются препараты хромосомных наборов носителей добавочных или маркерных (мини-) хромосом неизвестного происхождения: пробанд с олигофренией и множеством микроаномалий развития и его фенотипически здоровая мать. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом оказались малоэффективны. Однако после проведения двух этапов гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярных маркеров pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29, установить происхождение маркерных хромосом не составило труда, так как сразу была определена принадлежность добавочных (мини-) хромосом к двум различным группам, третьей и четвертой. На следующем этапе уже с помощью ДНК зондов pYS 37 и pYAI 7-29 было показано, что у пробанда добавочная (мини-) хромосома является дереватом хромосомы 21, а у его фенотипически здоровой матери - не дериватом хромосомы 17, то есть маркерные (мини-) хромосомы имели разное происхождение.

В тех случаях, когда маркерные (мини-) хромосомы не являются дереватами хромосом 10, 4, 17 и 21, на втором этапе гибридизации в "жестких" условиях, можно использовать ДНК зонды со спецификой для альфоидной ДНК хромосом 1, 3, 11, 13, 18, 21 и Х человека, защищенные авторскими свидетельствами ранее (Гиндилис и др., 1984, 1203108; Юров и др., 1989, 1494724; Юров и др., 1992, 1792429; Юров и др., 1997, 2087533; Соловьев и др., 1997, 2087534; Юров и др., 2000, 2161199).

В последующем было определено, что у матери пробанда в примере 3 добавочная маркерная (мини-) хромосома является дериватом хромосомы X.

Итак, появляется реальная возможность корректно, без дополнительных затрат на поочередное использование всех 24 хромосомоспецифичных ДНК зондов, определять происхождение добавочных или маркерных (мини-) хромосом в практике клинической цитогенетики и онкоцитогенетики, а также обосновать тактику проведения медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в семье при повторных случаях.

Таким образом, набор клонированных последовательностей ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 из генома человека является в специальных условиях эффективным инструментом как для распознавания определенных групп хромосом, так и отдельных хромосом на стандартных препаратах хромосом человека. Указанные возможности позволяют использовать изобретение для эффективного определения происхождения добавочных маркерных (мини-) хромосом в практике медицинской генетики, а именно, в пренатальной диагностике, клинической цитогенетике и онкоцитогенетике.

Формула изобретения

Набор рекомбинантных плазмидных ДНК рYAI 11-19, рYAI 2-45, р YS 37 и рYAI 7-29, предназначенный для определения происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом человека, содержащий: 1) рYAI 11-19 -- Pst1-Pst1 - фрагмент ДНК вектора рUC 19 размером 2700 пар нуклеотидов, - Pst1- Pst1- фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный в мягких условиях для центромерных районов группы хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19 или в жестких условиях для центромерного района хромосомы 10 человека, размером 1500 пар нуклеотидов с 4 внутренними уникальными сайтами рестрикции ЕсоR1; генетические маркеры: Аmpr - ген устойчивости к ампициллину; 2) рYAI 2-45 -- Pst1- Pst1- фрагмент ДНК вектора рUC 19 размером 2700 пар нуклеотидов; - Pst1 - Pst1- фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный в "мягких" условиях для центромерных районов группы хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20, или в "жестких" условиях для центромерного района хромосомы 4 человека, размером 1100 пар нуклеотидов с 3-мя внутренними уникальными сайтами рестрикции ЕсоR1; генетические маркеры: Аmpr - ген устойчивости к ампициллину; 3) рYS 37 -- Pst1 - Pst1 - фрагмент ДНК вектора рUC 19 размером 2700 пар нуклеотидов, - Pst1 - Pst1 - фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный в "мягких" условиях для центромерных районов группы хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У, или в "жестких" условиях для центромерных районов хромосом 13 и 21 человека, размером 680 пар нуклеотидов с 2 внутренними уникальными сайтами рестрикции ЕсоR1; генетические маркеры: Аmpr - ген устойчивости к ампициллину; 4) рYAI 7-29 -- Pst1 - Pst1 - фрагмент ДНК вектора рUC 19 размером 2700 пар нуклеотидов, - Pst1 - Pst1 - фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный в "мягких" условиях для центромерных районов группы хромосом 1, 11, 17, Х или в "жестких" условиях для центромерного района хромосомы 17 человека, размером 2700 пар нуклеотидов с 7 внутренними уникальными сайтами рестрикции ЕсоR1; генетические маркеры: Аmpr - ген устойчивости к ампициллину.