Сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается питательной среды, используемой для культивирования монослойной культуры клеток карциномы гортани человека Нер-2 и суспензионной культуры клеток лимфомы Беркита Namalva. Сухая стерильная малосывороточная питательная среда на основе ферментативного гидролизата белков мышц для культивирования клеток млекопитающих представляет собой комплект из четырех флаконов, в первый из которых входит смесь гидролизата и L-глутамина, во второй - смесь неорганических солей (калий хлористый, калий фосфорнокислый однозамещеннный, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, натрий хлористый, магний хлористый 6-водный, магний сернокислый 6-водный), глюкозы и фенолового красного (индикатор) водорастворимого, в третий - натрий углекислый кислый, в четвертый - ростовые протеины. Содержание в ферментативном гидролизате низкомолекулярных пептидов, обладающих ростовой активностью, а также введение в состав среды ростовых протеинов позволяет при использовании среды снизить концентрацию используемой сыворотки крови крупного рогатого скота до 2%. 1 з.п. ф-лы, 5 табл.

Предлагаемое техническое решение относится к биотехнологии и касается состава малосывороточной питательной среды, используемой для культивирования монослойной культуры клеток карциномы гортани человека Нер-2 и суспензионной культуры клеток лимфомы Беркита Namalva, и может быть использовано при культивировании вирусов в производстве вакцин, а также при проведении различных научных исследований.

Для культивирования клеток животных и человека обычно используют питательные среды, содержащие 5-10% сыворотки крови животных. В настоящее время одним из основных требований к питательной среде, используемой при выращивании клеток in vitro, является уменьшение или по возможности полное исключение содержания в ней сыворотки крови животных, так как сыворотка крови животных, являясь дорогостоящим компонентом питательной среды, не стабильна по своему составу и, кроме этого, содержит различные гетерогенные факторы, например липолипиды, присутствие которых в питательных средах может вызвать нежелательные осложнения при изучении биохимических процессов культивирования клеток. В связи с этим целесообразно применение бессывороточных и малосывороточных питательных сред [1].

Известны питательные среды на основе ферментативных гидролизатов растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе низкомолекулярные пептиды, обладающие ростстимулирующими свойствами [2, 3, 4].

Однако данные питательные среды предполагают использование до 10% сыворотки крови КРС, что снижает ее стабильность.

Наиболее близкой к заявляемой питательной среде - прототипом -является сухая стерильная питательная среда на основе ферментативного гидролизата, состав которой описан в способе получения жидких стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов, представляющая собой комплект из трех флаконов: в первый из которых входит гидролизат, во второй - смесь неорганических солей, глюкоза и феноловый красный, в третий - бикарбонат натрия. Данная среда используется для культивирования клеток млекопитающих при добавлении в нее 5-10% сыворотки крови КРС [5, прототип].

Недостатком такой среды является введение в ее состав непосредственно перед использованием до 10% сыворотки крови КРС и 300 мг/л L-глутамина, который не содержится в ферментативных гидролизатах, который является необходимым компонентом питательной среды.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности и стабильности сухой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата белков мышц, а также снижение количества гетерогенных факторов, присутствующих в среде.

Поставленная цель достигается путем введения в состав сухой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата белков мышц ростовых протеинов, выделенных из сыворотки крови крупного рогатого скота, и L-глутамина.

Сухая стерильная малосывороточная питательная среда на основе ферментативного гидролизата белков мышц представляет собой комплект из четырех частей: в первую входит смесь гидролизата и L-глутамина, во вторую - смесь неорганических солей, глюкозы и фенолового красного, в третью - натрий углекислый кислый, в четвертую - ростовые протеины.

L-глутамин является важным компонентом питательной среды [6].

В 1 л приготовленной жидкой стерильной питательной среды, приготовленной из комплекта сухой стерильной малосывороточной питательной среды, содержатся следующие компоненты (табл.1).

Новым по сравнению с прототипом является: - уменьшение количества сыворотки крови крупного рогатого скота; - введение ростовых протеинов, выделенных из сыворотки крови крупного рогатого скота; - введение в питательную среду L-глутамина.

Данный состав среды ранее не встречался в публикуемой литературе, следовательно, данное изобретение соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Предлагаемое авторами техническое решение поясняется следующими примерами Пример 1. Приготовление смеси, содержащей неорганические соли, глюкозу и феноловый красный.

Для приготовления смеси используют неорганические соли квалификации "хч". Используемые неорганические соли высушивают при температуре, указанной в табл.2.

В барабанную мельницу загружают компоненты смеси в количестве, указанном в табл.3, в следующей последовательности: натрий хлористый, калий хлористый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, глюкоза и феноловый красный и измельчают в течение 3 ч.

Измельченную смесь, содержащую высушенные неорганические соли, глюкозу и феноловый красный, фасуют по (4,41±0,22) г.

Ферментативный гидролизат белков мышц фасуют по (0,50±0,03) г, L-глутамин фасуют по (0,12±0,06) г в ту же емкость, что и ферментативный гидролизат белков мышц.

Натрий углекислый кислый фасуют в емкости по (0,15±0,08) г.

Ростовые протеины, выделенные из сыворотки крови крупного скота, фасуют по (1,2±0,6) г.

Исходя из загруженного количества (500 комплектов), после фасовки получают 480 комплектов, которые стерилизуют ускоренными электронами дозой 24-26 кГр на установке ИЛУ-6 со следующими параметрами пучка электронов: Энергия пучка 2,15-2,2 МэВ Ток пучка импульсный 0,22 А Частота следования импульсов 6 Гц Длительность импульсов 500 мкс Доза облучения 24-26 кГр
Потери при облучении (бой флаконов) составляют 0,4%.

В результате получается 478 комплектов сухой стерильной малосывороточной питательной среды.

Пример 2. Непосредственно перед использованием в асептических условиях в бутылку со стерильной очищенной водой последовательно переносят содержимое стерильного комплекта сухой стерильной малосывороточной питательной среды на основе ферментативного гидролизата белков мышц. Вначале вносят содержимое флакона смеси, содержащей смесь неорганических солей, глюкозы и фенолового красного, после растворения которого вносят содержимое флакона с ферментативным гидролизатом и L-глутамином, закрывают резиновой пробкой и растворяют в течение 5 мин при перемешивании. Натрий углекислый кислый вносят в раствор после растворения гидролизата. Натрий углекислый растворяют в течение 15 мин при перемешивании. В последнюю очередь вносят ростовые протеины. Таким образом, из комплекта приготавливают 400 мл жидкой стерильной питательной среды.

В культуральный флакон вносят 100 мл питательной среды и 2% стерильной сыворотки крови КРС, затем вносят посевную дозу клеток Нер-2 100 тыс.кл/мл. Культуру инкубируют 3-4 сут. при температуре (36±1)^oС. Для снятия клеток со стекла используют раствор 0,02%-ной массовой доли версена и раствор 0,25%-ной массовой доли трипсина в соотношении 1:1. В качестве контроля используют питательную среду с концентрацией сыворотки крови КРС 5%. В таблице 2 приведены результаты оценки ростовых свойств питательной среды.

Клетки Нер-2, выращенные как на опытной, так и на контрольной среде прикрепляются к субстрату и образуют островки размножившихся клеток на первые сутки после посева и через 3-4 суток культивирования сливаются в монослой без признаков дегенерации. Подсчет клеток производят в камере Горяева после 5-го пассажа. Индексы пролиферации клеточной культуры Нер-2, полученные на питательной среде с пониженным содержанием сыворотки крови КРС (2%), сравнимы с индексами пролиферации, полученными на контрольной питательной среде с 5% сыворотки крови КРС.

Пример 3. Приготовление питательной среды аналогично примеру 1.

Ростстимулирующую активность малосывороточной питательной среды на основе ферментативного гидролизата белков мышц оценивают на паспортизованной клеточной культуре лимфомы Беркита (Namalva). Культивирование проводят в течение 5 последовательных пассажей с 3-4 дневным циклом при посевной дозе в каждом пассаже 200 тыс.кл./мл. После 5-го пассажа осуществляют подсчет среднего значения индекса пролиферации и количество жизнеспособных клеток. Результаты оценки ростовых свойств питательной среды приведены в таблице 5.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что питательная среда, представленная в новом составе и используемая для выращивания как монослойной клеточной культуры (Нер-2), так и суспензионной культуры (Namalva), позволяет снизить концентрацию используемой сыворотки крови до 2% без снижения индексов пролиферации клеточных культур.

Источники информации
1. Нариманов А.А. Бессывороточная среда для культивирования лимфоидных клеток человека и миеломных клеток мышей. //Биотехнология, 1991, 1, с.49-51.

2. Н.Н. Гизитдинов, К.С. Куликова, В.И. Вовк. Результаты изучения вируса ящура, выращенного в культуре клеток с использованием среды, приготовленной из белкового гидролизата сои. //Вестник сельхоз. наук, 1970, 7, с.14.

3. Авторское свидетельство СССР 1025722 "Питательная среда для выращивания культур клеток", БИ 24, 1983.

4. Телишевская Л.Я., Максимюк Н.Н. Богаутдинов З.Ф. Значение пептидов в составе питательных сред для суспензионного культивирования. //Цитология, 1994, т.36, c.538.

5. Патент РФ 2161649 "Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата", С 12 N 5/00, опубл. БИ 1, 2001.

6. Автореферат диссертации на соискание звания к.б.н. Богрянцевой М.П. "Технология изготовления и свойства стерильной питательной среды на основе гидролизатов". - М., 2000, с.9.

Формула изобретения

1. Сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих, содержащая ферментативный гидролизат белков мышц для культур клеток, натрий хлористый, магний сернокислый 6-водный, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, натрий углекислый кислый, глюкозу, феноловый красный водорастворимый и L-глутамин, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит калий хлористый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний хлористый 6-водный и ростовые протеины из сыворотки крови, а L-глутамин в сухом виде при следующем содержании компонентов, г из расчета на 400 мл среды:
Калий хлористый - 0,16
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,024
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 1,156
Натрий хлористый - 3,2
Магний хлористый 6-водный - 0,04
Магний сернокислый 6-водный - 0,04
Ферментативный гидролизат белков мышц для культур клеток - 0,5
Натрий углекислый кислый (бикарбонат натрия) - 0,15
Глюкоза - 0,4
Феноловый красный (индикатор) водорастворимый - 0,008
L-глутамин - 0,12
Ростовые протеины, выделенные из сыворотки крови крупного рогатого скота - 1,2
2. Сухая стерильная питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что ингредиенты разделены на четыре части, первая из которых содержит ферментативный гидролизат белков мышц и L-глутамин, вторая - неорганические соли, глюкозу и феноловый красный, третья - натрий углекислый кислый и четвертая - ростовые протеины из сыворотки крови, при этом количественное соотношение ингредиентов каждой части соответствует количественному соотношению ингредиентов среды.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5