Способ приготовления суспензии фетальных клеток, предназначенных для трансплантации при хронических заболеваниях печени

 

Изобретение относится к медицине, в частности к трансплантологии, и может найти применение при лечении хронических заболеваний печени. Технический результат: повышение функциональной активности трансплантируемых фетальных клеток. Способ предусматривает забор фетальных тканей, помещение их в среду для разведения, гемогенизацию с сохранением целостности клеток, разведение гомогената и его по меньшей мере двукратное лазерное облучение. При этом способ предусматривает забор фетальных тканей печени, и/или селезенки, и/или тимуса и дополнительно перед забором фетальных тканей вводят в организм донора гепатотропный яд в количестве, не оказывающем токсического действия. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к трансплантологии, и может найти широкое применение при лечении хронических заболеваний печени.

Известен способ приготовления суспензии фетальных клеток в частности гепатоцитов, предназначенных для трансплантации при хронических заболеваниях печени, предусматривающий забор фетальных тканей печени, механическое воздействие для освобождения гепатоцитов, фильтрацию и отмывку гепатоцитов центрифугированием и последующее их разведение до требуемой концентрации фетальных гепатоцитов (см. кн. "Лечение печеночной недостаточности методами трансплантации и экстракорпорального подключения печени и других тканей (биологические и клинические аспекты). Под редакцией академика РАМН В.И. Шумакова, Москва, 1994 г., стр. 43, 63).

Использование полученной суспензии для трансплантации внутрибрюшинно улучшает функционирование печени больного.

Известен способ приготовления суспензии фетальных клеток, предназначенных для трансплантации при хронических заболеваниях печени, выбранный в качестве ближайшего аналога, предусматривающий забор фетальных тканей, помещение их в среду для разведения, гомогенизацию с сохранением целостности клеток и последующее до требуемого разведение гомогената (см. патент 2153344, М.кл. А 61 К 35/407, А 61 Р 43/00, опубл. 27.07.2000 г.).

Данный способ предусматривает забор тканей печени у эмбриона, отмывание ее в питательной среде 199, получение гомогената, центрифугирование, выделение верхнего, среднего и нижнего слоя, отсасывание среднего слоя и верхней части нижнего слоя, разведение в питательной среде 199.

Данный способ достаточно трудоемок поскольку предусматривает дополнительные операции, например центрифугирование, разделение гомогената на три слоя, выделение каждого слоя в отдельную колбу и отсасывание части слоев.

Кроме того, несмотря на увеличение регенерирующей способности печеночной ткани и уменьшение реакции ее отторжения, положительные результаты после трансплантации суспензии гепатоцитов, полученных данным способом, наблюдаются только через 10-20 дней после проведения эксперимента.

Таким образам задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является повышение функциональной активности трансплантируемых фетальных клеток.

Указанная задача достигается тем, что в известном способе приготовления суспензии фетальных клеток, предназначенных для трансплантации при хронических заболеваниях печени, предусматривающем забор фетальных тканей, помещение их в среду для разведения, гомогенизацию с сохранением целостности клеток и последующее до требуемого разведение гомогената, согласно изобретения разведенный гомогенат дополнительно подвергают по меньшей мере двукратному лазерному облучению.

При этом предусматривается забор фетальных тканей печени, и/или селезенки, и/или тимуса.

И кроме того дополнительно предусматривается перед забором фетальных тканей из организма донора, введение в организм донора гепатотропного яда, в количестве, не оказывающем на этот организм токсического действия.

Экспериментально установлено, что дополнительное по меньшей мере двукратное лазерное облучение разведенного гомогената способствует значительному, по сравнению с ближайшим аналогом, повышению функциональной активности трансплантируемых фетальных клеток, их более высокой по сравнению со всеми известными регенерирующей способностью и, как следствие, значительному ускорению процесса регенерации поврежденной печени.

По мнению заявителя, именно воздействие лазерным излучением усиливает иммуностимуляторные свойства фетальных клеток, что и позволяет ускорить процесс регенерации пораженной печени, что в свою очередь повышает эффективность использования данных клеток для лечения хронических заболеваний печени.

Именно лазерное облучение активизирует продуцирование фетальными клетками находящихся в них биологически активных веществ.

Экспериментально установлено, что данный результат достигается именно при использовании фетальных тканей печени, и/или селезенки, и/или тимуса.

Кроме того экспериментально установлено, еще в большей степени происходит повышение функциональной активности фетальных клеток, если дополнительно перед забором фетальных тканей из организма донора, в него ввести однократно гепатотропный яд в количестве, не оказывающем на этот организм токсического действия.

По мнению заявителя, это обеспечивается благодаря тому, что воздействие на фетальные органы, оказываемое гепатотропным ядом резко активизирует выработку в фетальных органах биологически активных веществ, предназначенных для их защиты.

Совокупность существенных признаков заявляемого объекта "способ" имеет отличия от ближайшего аналога и не следует явным образом из изученного уровня техники, что свидетельствует о его соответствии критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Данное изобретение может найти широкое применение в здравоохранении, что свидетельсвует о его соответствии критерию "промышленная применимость".

Способ в эксперименте осуществляется следующим образом.

Фетальные ткани печени, и/или селезенки, и/или тимуса берутся у плодов крыс-самок линии Вистар с 20-дневным сроком беременности и помещаются в физиологический раствор.

Смесь фетальных клеток готовится с помощью гомогенизатора с люфтом, сохраняющим целостность клеток.

При этом кусочки печени, и/или селезенки, и/или тимуса гомогенизируются на физиологическом растворе.

На основе полученных гомогенатов органов готовится суспензия с разведением 3•10⁵. Клеточность суспензии подсчитывается с помощью камеры Горяева. Жизнеспособность клеток оценивается с помощью окраски их взвеси трипановым синим.

Затем суспензия помещается в стерильные стеклянные пробирки. В пробирки вставляется световод, диаметр которого выбран таковым, чтобы он плотно входил в пробирку.

Световод устанавливается на некотором расстоянии от поверхности суспензии, не соприкасаясь с ней, и по меньшей мере дважды облучается лазерным излучением, например гелий-неоновым лазером модели "Улей". Время облучения за один раз составляет от 0,5 до 2 минут. Время перерыва между облучениями от 1 до 5 минут. Плотность мощности лазерного облучения 75 мВ/см².

После облучения световод извлекается из пробирки. Суспензия фетальных клеток готова к трансплантации.

При экспериментах, проводимыx на биологических объектах (крысах), дополнительно за 16 часов до извлечения фетальных тканей из организма крысы-донора, ей вводился 50%-ный масляный раствор четыреххлористого углерода в количестве из расчета 0,4 мл на 100 грамм веса крысы-донора.

Данное количество гепатотропного яда не оказывает на организм крысы-донора токсического действия.

В таблице приведены примеры конкретного выполнения данного способа.

Примечание. В примере 1 за 16 часов до извлечения фетальных органов из организма крысы-донора весом 200 грамм, ей вводили 0,8 мл 50%-ного масляного раствора четыреххлористого углерода.

Формула изобретения

1. Способ приготовления суспензии фетальных клеток, предназначенных для трансплантации при хронических заболеваниях печени, предусматривающий забор фетальных тканей, помещение их в среду для разведения, гомогенизацию с сохранением целостности клеток и последующее до требуемого разведение гомогената, отличающийся тем, что разведенный гомогенат дополнительно подвергают по меньшей мере двукратному лазерному облучению.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предусматривает забор фетальных тканей печени, и/или селезенки, и/или тимуса.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что дополнительно перед забором фетальных тканей предусматривает введение в организм донора гепатотропного яда в количествах, не оказывающих на этот организм токсического действия.

РИСУНКИ

Рисунок 1