Жидкие композиции, содержащие гонадотропин

 

Настоящее изобретение относится к жидкой композиции, содержащей гонадотропин, включающей гонадотропин, стабилизирующие количества поликарбоновой кислоты или ее соли и тиоэфирного соединения и необязательно дисахарид и неионное поверхностно-активное соединение. Композиция обладает повышенной стабильностью. 5 с. и 9 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к жидкой композиции, содержащей гонадотропин, к способу изготовления указанной композиции, к картриджу, содержащему указанную композицию, и к устройству для введения, содержащему указанный картридж.

Гонадотропины образуют семейство структурно сходных гормонов гликопротеиновой природы. Типичные представители включают хорионический гонадотропин (XГ [CG]), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ [FSH], фоллитропин), лютеинизирующий гормон (ЛГ [LH], лютропин) и тиреостимулирующий (ТСГ [TSH], тиреотропин). ФСГ, ЛГ и ТСГ присутствуют у большинства видов позвоночных животных и синтезируются и секретируются гипофизом. ХГ в настоящее время обнаружен только у приматов, включая человека, а также у лошадей, и синтезируется плацентарной тканью. ФСГ и ЛГ являются гормонами гипофиза, которые необходимы для созревания фолликула и образования желтого тела у женских особей, а также для развития семенников и сперматогенеза у мужских особей. Для стимуляции развития фолликулов в яичниках, что требуется для методик помощи репродукции, таких как метод ин витро оплодотворения (ИВО), среди прочих применяют очищенный ФСГ, который вводят отдельно или в комбинации с полуочищенными менопаузальными гонадотропинами человека, содержащими смесь ФСГ и ЛГ. В клинике применяется также частично очищенный человеческий ФСГ, полученный из мочи, для стимуляции созревания фолликулов у женщин, имеющих ановуляторные циклы при хроническом ановуляторном синдроме или недостаточности фазы желтого тела. У мужчин при различных состояниях, связанных с мужским бесплодием, применяют комбинацию ФСГ и ЛГ.

В последние годы, благодаря методике рекомбинантной ДНК, стали доступными очень чистые препараты гонадотропинов (см., например, Boime et al., Seminars in Reproductive Endocrinology 10, 45-50, 1992: "Expression of recombinant human FSH, LH and CG in mammalian cells"). Рекомбинантные гонадотропины имеют постоянное качество, т.е. имеют воспроизводимые биохимические и биологические свойства. Геномные и кДНК клоны получены для всех субъединиц, и их первичная структура расшифрована. Более того, клетки яичников китайского хомячка (клетки СНО) были трансфектированы генами субъединиц гонадотропина человека, и было показано, что эти клетки способны секретировать интактные димеры (например, Keene et al. (1989), J. Biol. Chem., 264, 4769-4775; Van Wezenbeek et al. (1990) в монографии "From clone to clinic'' (изд. Crommelin D. J.А. и Schellekens H.), 245-251). Было показано, что биохимические и биологические характеристики, например, рекомбинантного ФСГ, почти идентичны характеристикам нативного ФСГ (Mannaerts et al. (1991), Endocrinology, 129, 2623-2630). Более того, после контролируемой суперовуляции в яичниках, вызванной применением рекомбинантного ФСГ, наступала беременность (Germond et al. (1992), Lancet, 339, 1170; Devroey et al. (1992), Lancet, 339, 1170-1171).

Структурно гонадотропины являются гетеродимерами, составленными из двух различных субъединиц α и β, которые соединены нековалентными связями. В пределах одного вида субъединица α практически идентична для каждого представителя семейства гонадотропинов; она также сильно различается у различных видов. Субъединицы β различны у каждого представителя, т.е. у ХГ, ФСГ, ТСГ и ЛГ, но демонстрируют значительное сходство в строении. Помимо этого, субъединицы β также сильно различаются у различных видов. У человека субъединица α состоит из 92 аминокислотных остатков, в то время как размер субъединицы β различен для каждого представителя: 111 остатков для чФСГ, 121 остаток для чЛГ, 118 остатков для чТСГ и 145 остатков для чХГ (Combarnoys, Y. (1992), Endocrine Reviews, 13, 670-691; Lustbader, J.W. et al. (1993), Endocrine Reviews, 14, 291-311). Субъединица β у чХГ значительно больше других субъединиц β, поскольку она содержит дополнительно приблизительно 34 аминокислоты на С-конце, которые здесь упоминаются как карбокси-концевой белок (ККБ).

Относительно чистые препараты гонадотропина коммерчески доступны. Например, композиции, содержащие нативный менопаузальный гонадоторопин человека (чМГ), обладающий активностью ФСГ и ЛГ в соотношении приблизительно 1:1, а также нативный хорионический гонадотропин человека (чХГ), можно приобрести в форме лиофилизированных препаратов под торговыми наименованиями Humegon® и Pregnyl®, соответственно, у компании N.V.Organon, Oss, Нидерланды. Препарат лиофилизированного рекомбинантного ФСГ человека (рекФСГ) можно приобрести, например, под торговым наименованием Pyregon®, в той же компании. Рекомбинантный ФСГ также применяется для индуцирования овуляции и для контролируемой гиперстимуляции яичников.

Стабильность белков в водных композициях в фармацевтической промышленности обычно является проблемой. Так, стабильность водных растворов гонадотропина недостаточна для того, чтобы препарат можно было хранить длительное время. Особенно это относится к препаратам, содержащим очень чистые гонадотропины, изготовленные с помощью технологии рекомбинантной ДНК, в относительно разбавленных растворах. Поэтому обычно эти препараты хранят в сухом виде, в котором они были получены после лиофилизации. Лиофилизированная фармацевтическая композиция, содержащая стабилизированный гонадотропин, раскрыта в Европейском патенте 448146 (Akzo N.V.). Эти препараты содержат органические карбоновые кислоты, в частности, лимонную кислоту, и необязательно - невосстанавливающий сахар, такой как сахароза. Другая твердая фармацевтическая композиция, содержащая гонадоторопин и включающая сахарозу, как стабилизатор, раскрыта в международной патентной публикации WO 93/11788 (Applied Research Systems ARS Holding N.V.).

Несмотря на то, что эти лиофилизованные препараты достаточно стабильны, чтобы гарантировать удовлетворительные сроки хранения, они имеют тот недостаток, что перед введением их необходимо растворять. Пациент, таким образом, должен перед употреблением растворить сухой гликопротеин в растворителе, что создает трудности и неудобно для пациента. Помимо этого, вместе с лиофилизированным препаратом гонадотропина необходимо поставлять растворитель.

Для пациента, который нуждается в регулярных инъекциях гонадотропина, например, для пациента, получающего ежедневные дозы рекФСГ для индуцирования овуляции, достаточно важно, чтобы композицию гонадотропина было легко разводить, отмерять дозу и инъецировать ее. Растворение лиофилизированного препарата гонадотропина требует осторожности и тщательности, и его, по возможности, следует избегать. Применение гонадотропинов будет более простым, если эти гликопротеины будут изготавливаться и продаваться в виде стабильного раствора пациенту, который сможет инъецировать лекарство непосредственно, без растворения. Помимо этого, процесс лиофилизации дорог и длителен, и было бы выгодно избежать его в процессе изготовления композиции гонадотропина.

Таким образом, существует потребность в готовом для использования препарате для инъекций, обладающем стабильностью, достаточной, чтобы гарантировать разумный срок хранения.

В WO 93/22335 (COR Therapeutics Inc.) раскрываются стабильные при хранении жидкие композиции практически чистых полипептидов, которые изготавливают путем растворения полипептида в цитратном буфере с рН от 5,0 до 5,5. Жидкие композиции, содержащие гонадотропин рекомбинантный чХГ, стабилизированный в невосстанавливающем сахаре, предпочтительно, манните, в водном растворе в фосфатном буфере при рН 7, раскрыты в WO 96/29095 (Applied Research Systems ARS Holding N.V.).

Растворы, включающие гонадотропины и соль поликарбоновой кислоты, известны из Европейского патента 448146 (Akzo N.V.). Эти растворы, содержащие, например, лимонную кислоту, описаны для изготовления стабилизированных лиофилизированных композиций гонадотропина.

При хранении самих этих растворов в течение длительного времени (месяцы при комнатной температуре) гонадотропины недостаточно стабильны.

Настоящее изобретение относится к жидкой композиции, содержащей гонадотропин, которая включает гонадотропин и стабилизирующие количества поликарбоновой кислоты или ее соли и тиоэфирного соединения. Композиции настоящего изобретения, содержащие гонадотропин, обладают улучшенной стабильностью при продолжительном хранении по сравнению с композициями, в которых тиоэфирное соединение отсутствует.

Термин "поликарбоновая кислота", используемый здесь, означает органическую кислоту, имеющую две или более частей карбоновой кислоты. Типичными поликарбоновыми кислотами являются лимонная кислота, изолимонная кислота, винная кислота, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота или смеси этих кислот. Можно использовать любую фармацевтически приемлемую соль, в частности, соли щелочных или щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий и кальций. Предпочтительной солью является натриевая соль.

Термин "тиоэфирное соединение" означает соединение, которое включает алкилтиоалкильную функциональную группу, имеющую формулу R₁-S-R₂-, где R₁ представляет низший алкил, a R₂ представляет низший алкилен. Термин "низший алкил" означает разветвленную или неразветвленную алкильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, такую как гексил, пентил, бутил, трет-бутил, пропил, изопропил, этил или метил. Предпочтительной низшей алкильной группой является метил. Термин "низший алкилен" означает алкиленовую группу, имеющую 1-6 атомов углерода, такую как 1,6-гександиил, 1,5-пентандиил, 1,4-бутандиил, 1,3-пропандиил, пропилиден, 1,2-этандиил, этилиден или метилен. Предпочтительно, тиоэфирные соединения имеют алкилтиоалкильную функциональную группу, которая соответствует боковой цепи α-аминокислоты, такой как аминокислоты метионин, гомо- и норметионин, как в форме D-, так и L- энантиомера или в форме рацемической смеси. Предпочтительным тиоэфирным соединением является аминокислота метионин (R₁ представляет метил; R₂ представляет 1,2-этандиил).

Жидкие композиции настоящего изобретения, содержащие гонадотропин, включают гонадотропин в смеси с определенными стабилизаторами в растворе. Эта композиция будет содержать количество поликарбоновой кислоты или ее соли и тиоэфирного соединения, достаточное, чтобы стабилизировать гонадотропин в растворе на желательное время при желательной температуре.

Гонадотропин или производные гонадотропина, используемые в определении композиции настоящего изобретения, представляют собой белки, описанные выше, например, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреостимулирующий гормон (ТСГ), хорионический гонадотропин человека (чХГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ) или их производные, или аналоги и их смеси, с другими или без других белковых компонентов.

Гонадотропин может быть получен из натуральных источников, например, из мочи человека, или изготовлен (био)синтетическим путем, например, с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Рекомбинантные гонадотропины могут быть изготовлены, например, как описано у Кееnе et ai. (1989), "Expression of Biologically Active Human Follitropin in Chinese Hamster Ovary Cells", The Journal of Biological Chemistry, 264, 4769-4775, или как описано у Reddy et al. , в международной патентной публикации WO 86/04589 (Applied Research Systems ARS Holding N.V.).

Используемый в настоящем изобретении гонадотропин, например, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), включает аналоги этого соединения и его рекомбинантные, натуральные, дегликозилированные, негликозилированные, модифицированные гликозилированные и прочие формы. В качестве примера, модифицированные формы гонадотропинов, в который карбокси - конец белка продолжен карбокси - концевым белком (ККБ), последовательность аминокислот в котором получена из β-субъединицы хорионического гонадотропина человека (последовательность аминокислот в ККБ представляет аминокислотные остатки 112-118 до 145 β-субъединицы чХГ или ее варианта), как описано в Европейском патенте 0461200 (Вашингтонский университет), включены в определение гонадотропина. Примерами таких модифицированных форм являются рекомбинантный ФСГ - ККБ и рекомбинантный ЛГ - ККБ.

Наиболее предпочтительным гонадотропином является ФСГ, полученный с помощью технологии рекомбинантной ДНК (рекФСГ), как в отдельности, так и в смеси с ЛГ или чХГ. ФСГ, выделенный из натуральных источников, обычно очищен лишь частично. Представляется, что (белковые) загрязнения действуют как своего рода стабилизаторы. В случае рекФСГ, однако, загрязнения отсутствуют и, следовательно, ФСГ, представленный в сравнительно малой концентрации относительно белкового содержания, более подвержен быстрому распаду.

Используемый здесь термин "стабилизировать" является относительным понятием. Стабилизировать жидкую композицию, содержащую гонадотропин, стабилизирующим агентом или соединением означает возможность предотвратить или задержать снижение активности гонадотропина с помощью стабилизатора. Например, препарат следует считать "стабилизированным", если при добавлении стабилизирующего соединения ("стабилизатора") его распад при определенной температуре и, следовательно, утрата некоторой части активности in vivo и/или in vitro, происходит в течение более длительного периода времени (например, 2 недели вместо одной) по сравнению с препаратом без стабилизатора.

Активность гонадотропинов можно определить известными методами, существующими для конкретных гонадотропинов. Одним возможным способом оценки активности может быть определение количества (инактивированных) олигомеров или модифицированных (например, окисленных) мономеров α- и β-субъединиц, образующихся со временем. Образование олигомеров в образце можно определить посредством ХВРРМ (хроматография высокого разрешения по размеру молекул). Другие методики определения остаточной активности, например, рекФСГ, включают ферментный иммунологический анализ (ФИА), как описано в переизданном патенте США 32696, принадлежащем Schuurs et al., с помощью набора, имеющегося на рынке под торговым наименованием FSHEIA производства BioMerieux, Маrсу I' Etoile 69260 Charbonnieresles-Bains, Франция, для ФСГ, и in vitro, биологический анализ для ФСГ, ФСГ-ККБ и ЛГ, как описано у Mannaerts et al., Applications of in vitro Bioassays for Gonadotropins, Neuroendocrinology of Reproguction, pp. 49-58 (Elsevier Science Publishers BV, Амстердам, Нидерланды, 1987).

В предпочтительном варианте практического осуществления настоящего изобретения жидкая композиция, содержащая гонадотропин, включает в качестве стабилизаторов достаточное количество соли лимонной кислоты, предпочтительно, цитрата натрия, и достаточное количество тиоэфирного соединения метионина (рацемической DL смеси).

Когда для жидкой композиции настоящего изобретения выбирают в качестве стабилизаторов цитрат натрия и метионин, подходящая концентрация цитрата натрия составляет 25-100 мМ, а подходящая концентрация метионина составляет 1-10 мМ.

Было обнаружено, что включение невосстанавливающего дисахарида, такого как сахароза или трегалоза, в композицию, которая уже включает поликарбоновую кислоту или ее соль и тиоэфирное соединение в качестве стабилизаторов, еще более повышает стабильность гонадотропина в жидкой композиции. Предпочтительным дисахаридом в композициях настоящего изобретения является сахароза. Подходящим количеством является концентрация сахарозы приблизительно 25-300 мМ. Особенно предпочтительными являются жидкие композиции, содержащие гонадотропин, которые включают рекомбинатный ФСГ или его производное, цитрат натрия и метионин в качестве стабилизаторов, и дополнительно некоторое количество сахарозы. Когда гонадотропином, который нуждается в стабилизации в жидкой композиции, является рекФСГ из рекФСГ-ККБ, предпочтительное количество сахарозы составляет 50 мг/мл.

Композиция настоящего изобретения предпочтительно включает также один или более неионных поверхностно-активных соединений. Эти поверхностно-активные соединения действуют как агенты, препятствующие адсорбции, и предотвращают потери гонадотропина в результате адсорбции белка на стенках контейнера, в котором содержится композиция. Добавление агента, препятствующего адсорбции, к композициям настоящего изобретения особенно требуется, если композиции включают рекомбинантный гонадотропин в малых концентрациях.

Предпочтительными неионными поверхностно-активными соединениями являются Polysorbate 20 (полисорбат 20), NF (дополнение к Фармакопее США) (Tween 20, (Твин 20), продаваемый компанией Atlas Chemical Company), Polysorbate 80 (полисорбат 80), NF (дополнение к Фармакопее США) (Tween 80 (Твин 80), продаваемый компанией Atlas Chemical Company), Brij 35 (продаваемый компанией ICI Pharmaceuticals) и Pluronic F123 (Плюроник F123) (продаваемый компанией BASF). Особенно предпочтительным является Polysorbate 20 (полисорбат 20), NF (Tween 20 (твин 20)).

Под полисорбатом подразумевается предпочтительно полисорбат, отвечающий описанию Фармакопеи США и дополнению в Фармакопее США (USP/NF XXII), которое опубликовано как "The National Formulary", pp. 1763, 1987, вступивший в силу с 1 января 1990 г. (22-е издание, US Pharmacopeial Convention, Inc. 1989).

Агент, препятствующий адсорбции, или агенты, препятствующие адсорбции, будут присутствовать в таких количествах, чтобы снизить адсорбцию белка на стенках контейнера или стенках сосудов или стеклянных изделиях, которые используются в процессе изготовления. В качестве примера, предпочтительны количества Полисорбата 20, достаточные для получения концентрации в конечной композиции приблизительно от 0,1 до 0,2 мг/мл.

Жидкая композиция настоящего изобретения имеет рН от 6 до 8, и, предпочтительно, от 6,5 до 7,2. Наиболее предпочтительным является раствор, имеющий рН около 7,0. Установлено, что при этих значениях рН жидкие композиции настоящего изобретения наиболее стабильны.

Стабильная композиция настоящего изобретения может быть изготовлена путем смешивания выбранного гонадотропина в водном растворе с достаточными количествами стабилизатора поликарбоновой кислоты или ее соли и стабилизатора тиоэфирного соединения для стабилизации белка, после чего, необязательно, в этой смеси растворяют некоторое количество невосстанавливающего дисахарида и/или неионного поверхностно-активного соединения. рН полученного раствора затем доводят до 6,5-7,2 и раствор (в стерильных условиях) фильтруют.

Используемый в настоящем изобретении водный раствор представляет из себя раствор, содержащий воду, предпочтительно, воду подходящего для парентерального введения качества (вода для инъекций, фармакопея США), в качестве главного, но не обязательно единственного растворителя. В качестве сорастворителя могут присутствовать небольшие количества фармацевтически приемлемых смешивающихся с водой растворителей.

В предпочтительном варианте практического осуществления настоящего изобретения обеспечивается способ изготовления жидкой композиции, содержащей гонадотропин, который включает смешивание в водном растворе по меньшей мере одного гонадотропина с некоторым количеством цитрата натрия до концентрации 25-100 мМ, и некоторым количеством метионина до концентрации 1-10 мМ; необязательно, растворение некоторого количества сахарозы в указанной смеси до концентрации 25-300 мМ и, необязательно, растворение неионного поверхностно-активного соединения, предпочтительно, Полисорбата 20, в указанной смеси; и доведение рН полученного раствора до величины в пределах от 6,5 до 7,2; после чего раствор может быть профильтрован в стерильных условиях.

Основные способы изготовления композиций для парентерального введения, особенно в том, что касается предпринимаемых мер для обеспечения стерильности, известны специалистам, например, как описано у Gennaro et al., Remington's Pharmaceutical Sciences (18-е издание, Mack Publishing Company, 1990, см. часть 8 в "Pharmaceutical Preparations and their Manufacture", и особенно главу "Parenteral Preparations" на стр. 1545-1569). Любой используемый гонадотропин предпочтительно присутствует в композициях в количестве, достаточном для получения терапевтически пригодной концентрации белка для парентерального (например, подкожного, внутримышечного или внутривенного) введения.

Пригодные дозы гонадотропинов известны практикующим врачам, и количество, содержащееся в дозе, обычно зависит от болезненного состояния и конкретного пациента, подлежащего лечению.

Например, для ФСГ пригодные дозы находятся в диапазоне приблизительно от 25 до 1500 Международных Единиц (ME), особенно, 50-225. Терапевтическим количеством считают приблизительно 75 ME.

В качестве примера, вводились такие большие количества как 10 000 Международных Единиц и такие малые количества как 15 Международных Единиц чХГ. Использовались инъекции ЛГ от 20 до 225 Международных Единиц.

Концентрация гонадотропина в жидких композициях настоящего изобретения зависит от растворимости гонадотропина и от терапевтического количества для данной дозы.

Предпочтительными жидкими композициями настоящего изобретения являются композиции, которые включают в качестве гонадотропина рекомбинантные белки рекФСГ или его производное рекФСГ - ККБ. Подходящая концентрация рекФСГ может находиться в пределах приблизительно от 20 до 2000 МЕ/мл, что точно соответствует концентрации 2-200 мкг/мл (для препарата, имеющего специфическую активность ФСГ 10000 МЕ/мл белка). Предпочтительный диапазон составляет 500-1500 МЕ/мл.

В одном предпочтительном варианте практического осуществления настоящего изобретения, комбинацию ФСГ и ЛГ или ФСГ и чХГ растворяют вместе для получения композиции, содержащей терапевтические количества обоих выбранных гонадотропинов.

Жидкие композиции настоящего изобретения, содержащие гонадотропин, можно хранить в жидком состоянии при различных температурах в течение длительного периода времени при сохранении биологической активности и физической стабильности гонадотропина. Предпочтительно, температура хранения ниже 30^oС и выше температуры замерзания. Предпочтительная температура хранения составляет приблизительно 2-8^oС.

Жидкие композиции настоящего изобретения, содержащие гонадотропин, можно при желании подвергать лиофилизации.

Еще одной особенностью настоящего изобретения является создание картриджа, содержащего стерильную жидкую композицию настоящего изобретения. "Картридж" здесь означает закрытый контейнер, такой как ампула, флакон, бутылка или мешочек.

Картридж может содержать количество жидкой композиции гонадотропина, соответствующее одной или более терапевтическим дозам гонадотропина.

Еще одной особенностью настоящего изобретения является создание устройства для введения, которое включает картридж, содержащий стерильную жидкую композицию настоящего изобретения. Предпочтительным устройством для введения является инжектор типа авторучки, включающий средство для легкого отмеривания количества композиции, которое должно быть инъецировано. Такие инжекторы типа авторучки как таковые известны, как, например, хорошо известная система для инъецирования инсулина, В-D Pen (товарный знак Becton Dickinson and Company).

Из вышесказанного следует, что жидкая композиция гонадотропина, обеспечиваемая настоящим изобретением, в противоположность ранее существовавшему уровню техники, может быть инъецирована непосредственно, т.е. без необходимости повторного растворения сухого продукта пациентом перед употреблением. В этой связи настоящее изобретение имеет отношение также к применению гонадотропина для производства жидкого лекарственного средства, предназначенного для непосредственного введения, для лечения бесплодия.

Поскольку такие препараты никогда не существовали и не очевидны относительно современных сложных препаратов для инъекций, такое применение не ожидалось в виду известного уровня техники и имеет очевидные преимущества при лечении пациентов.

Жидкое лекарственное средство, предназначенное для непосредственного введения, можно содержать в контейнере, таком как флакон или ампула, т.е. в контейнере такого типа, из которого его легко извлечь и набрать в устройство для инъекции. Оно может содержаться также в картридже такого типа, который может как таковой помещаться в устройство для инъекции, адаптированное для приема такого картриджа, примером которого является инжектор типа авторучки, упоминавшийся выше. Следует отметить, что еще одним преимуществом настоящего изобретения является то, что жидкое лекарственное средство может находиться в форме картриджа для многократного применения. Используя инжектор с удобной индикаторной шкалой, пациент может легко инъецировать необходимое количество лекарства каждый раз, когда это требуется. Вышеупомянутый инжектор типа авторучки B-D, обычно используемый для введения инсулина, имеет удобную систему, позволяющую набирать нужное для инъекции количество, и может быть относительно просто снабжен индикаторной шкалой, адаптированной для жидкого лекарственного средства, содержащего гонадотропин.

Учитывая вышесказанное, настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения бесплодия путем введения гонадотропина, которое осуществляется путем инъекции жидкого препарата гонадотропина непосредственно из устройства для введения, такого как инжектор типа авторучки, в который помещается картридж, содержащий стабильную жидкую композицию гонадотропина.

Настоящее изобретение далее объясняется с помощью следующих примеров.

Пример 1 Композиции, содержащие рекомбинантный ФСГ Были изготовлены жидкие композиции, содержащие рекомбинантный ФСГ, имеющие состав, приведенный в таблице I, и обозначенные A-J. Аликвоты по 0,5 мл каждой композиции хранили в запечатанных 2-мл флаконах в течение периода времени до 2 месяцев при 8^oС, 30^oС и 40^oС, соответственно.

Затем определяли биологическую активность in vitro хранившихся образцов рекФСГ путем определения степени стимуляции клеток, экспрессирующих рецепторы ФСГ человека. Активность измеряли как количество циклического АМФ, который высвобождался при связывании ФСГ рецепторами ФСГ. В таблице II биологическая активность образцов ФСГ, хранившихся в течение указанных периодов времени и при указанных температурах, выражена как процент от активности такого же образца в начале исследования. Данные таблицы II показывают, что композиция рекФСГ без тиоэфирного соединения метионина менее стабильна по сравнению с композициями рекФСГ, содержащими метионин, особенно при хранении при температурах выше комнатной и в течение длительного периода времени.

Пример 2 Композиции, содержащие рекомбинантный ФСГ - ККБ Были изготовлены жидкие композиции, содержащие рекомбинантный ФСГ - ККБ, имеющие состав, приведенный в таблице III, и обозначенные A-J. Аликвоты по 0,5 мл каждой композиции хранили в запечатанных 2-мл флаконах в течение 2 месяцев при 8^oС, 20^oС, 30^oС и 40^oС, соответственно.

Биологическая активность in vitro, определенная, как описано в примере 1, приведена в таблице IV.

Данные таблицы IV показывают, что композиция рекФСГ - ККБ без тиоэфирного соединения метионина менее стабильна по сравнению с композициями рекФСГ - ККБ, содержащими метионин, особенно при хранении при комнатной температуре и выше.

Формула изобретения

1. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, отличающаяся тем, что она включает гонадотропин и стабилизирующие количества поликарбоновой кислоты или ее соли и тиоэфирного соединения, имеющего тиоалкильную функциональную группу, которая соответствует боковой цепи α-аминокислоты, причем алкильная группа имеет 1-6 атомов углерода.

2. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, по п.1, отличающаяся тем, что тиоэфирным соединением является аминокислота метионин.

3. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, по п.1 или 2, отличающаяся тем, что поликарбоновой кислотой является лимонная кислота или ее натриевая соль.

4. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, по п.3, отличающаяся тем, что концентрация цитрата натрия составляет 25-100 мМ, а концентрация метионина составляет 1-10 мМ.

5. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что она дополнительно включает невосстанавливающий сахар.

6. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, по п.5, отличающаяся тем, что невосстанавливающим сахаром является сахароза в концентрации 25-300 мМ.

7. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что она дополнительно включает неионное поверхностно-активное соединение.

8. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что рН композиции находится в пределах от 6,5 до 7,2 и, предпочтительно, составляет 7.

9. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что гонадотропин выбирают из лютеинизирующего гормона (ЛГ), хорионического гонадотропина человека (чХГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) или их производных, а также их смесей.

10. Жидкая композиция, содержащая гонадотропин, по п.9, отличающаяся тем, что гонадотропином является рекомбинантный ФСГ человека (рекФСГ) или рекомбинантный ФСГ - ККБ.

11. Способ приготовления жидкой композиции, содержащей гонадотропин, который включает: смешивание в водном растворе, по меньшей мере, одного гонадотропина со стабилизирующим количеством поликарбоновой кислоты или ее соли и стабилизирующим количеством тиоэфирного соединения, имеющего тиоалкильную функциональную группу, которая соответствует боковой цепи α-аминокислоты, причем алкильная группа имеет 1-6 атомов углерода; необязательно, растворение определенного количества невосстанавливающего дисахарида в указанной смеси и, необязательно, растворение неионного поверхностно-активного соединения в указанной смеси; и доведение рН полученного раствора до величины в пределах 6,5-7,2.

12. Способ приготовления жидкой композиции, содержащей гонадотропин, который включает: смешивание в водном растворе, по меньшей мере, одного гонадотропина с определенным количеством цитрата натрия до концентрации 25-100 мМ и с определенным количеством метионина до концентрации 1-10 мМ; необязательно, растворение определенного количества сахарозы в указанной смеси до концентрации 25-300 мМ и, необязательно, растворение неионного поверхностно-активного соединения в указанной смеси; и доведение рН полученного раствора до величины в пределах 6,5-7,2.

13. Закрытый контейнер, содержащий стерильную жидкую композицию, содержащую гонадотропин, по любому из пп.1-10.

14. Инжектор типа авторучки, включающий закрытый контейнер по п.13.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3