Комбинированный препарат для использования в качестве контрастного агента и способ получения изображения

 

Изобретение относится к медицине и касается ультразвуковой визуализации объекта, особенно перфузии миокарда и других тканей. Сущность изобретения заключается в том, что предлагают препараты, содержащие газ контрастных агентов, которые после введения обеспечивают контролируемый и временный рост газовой фазы in vivo и могут, следовательно, действовать как депонированные индикаторы перфузии. Эти препараты включают совместно вводимую композицию, включающую диффундирующий компонент, способный диффундировать внутрь дисперсной газовой фазы и обеспечивать ее временный рост. При получении изображения перфузии сердца эти композиции могут с успехом вводиться совместно с вазодилатирующими лекарственными средствами, такими как аденозин, для усиления разницы интенсивности возвратных сигналов между нормальной тканью миокарда и тканью миокарда с недостаточной перфузией. Изобретение обеспечивает визуализацию тканевой перфузии у объекта, увеличение размеров диспергированного газа, применяемого для обогащения или временной задержки газа микроциркуляторной части сосудистого русла такой ткани, повышая, таким образом ее эхогенность. 2 с. и 30 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к получению ультразвукового изображения, более конкретно к новым препаратам контрастных агентов и их применению для получения ультразвукового изображения, например, при визуализации тканевой перфузии.

Хорошо известно, что контрастные агенты, включающие дисперсии микропузырьков газов, являются особенно эффективными для обратного рассеяния ультразвука, благодаря низкой плотности и легкой сжимаемости микропузырьков. Такие дисперсии микропузырьков, если они должным образом стабилизированы, могут обеспечить получение высококачественного ультразвукового изображения, например, сосудистой системы и микроциркуляторной части сосудистого русла тканей, часто в выгодно малых дозах.

Применение ультразвуковой эхографии для измерения перфузии крови (т.е., тока крови на единицу массы ткани) имеет потенциальную ценность, например, при выявлении опухолей, поскольку опухолевая ткань обычно имеет отличную от здоровой ткани васкуляризацию, а также при исследовании миокарда, например, для выявления инфарктов миокарда. Проблемой при использовании существующих контрастных агентов для ультразвуковых исследований перфузии сердца является то, что информационное содержание полученных изображений ухудшается вследствие затухания, вызванного наличием контрастного агента в желудочках сердца.

Настоящее изобретение основывается на открытии того факта, что ультразвуковая визуализация объекта исследования, в частности перфузии миокарда и других тканей, может достигаться и/или усиливаться посредством препаратов контрастных агентов, содержащих газ, которые после введения способствуют контролируемому и временному росту газовой фазы in vivo. Так, например, такие контрастные препараты могут использоваться для обеспечения контролируемой и временной задержки газовой фазы, например, в форме микропузырьков, в микрососудистом русле ткани, повышая, таким образом, концентрацию газа в этой ткани и, соответственно, повышая ее эхогенность, например, за счет депо крови.

Следует учитывать, что такое применение газа в качестве депонированного индикатора перфузии значительно отличается от существующих предложений, касающихся ультразвуковых контрастных агентов для внутривенного введения, содержащих микропузырьки. Так, обычно считается необходимым избегать роста микропузырьков, поскольку, при отсутствии контроля, это может привести к потенциально опасной эмболизации ткани. Соответственно, может быть необходимо ограничивать вводимую дозу и/или применять газовые смеси с композициями, подобранными таким образом, чтобы свести к минимуму рост пузырьков in vivo путем ингибирования диффузии газов крови внутрь микропузырьков (см., например, WO-A-9503835 и WO-A-9516467).

С другой стороны, в соответствии с настоящим изобретением, композицию, содержащую дисперсную газовую фазу, вводят совместно с композицией, включающей по меньшей мере одно вещество, которое имеет или способно генерировать давление газа или пара in vivo, достаточное для обеспечения контролируемого роста указанной дисперсной газовой фазы, посредством диффузии в нее молекул газа или пара, полученного из указанного вещества, которое далее для краткости будет называться "диффундирующим компонентом", хотя следует понимать, что и другие транспортные механизмы, помимо диффузии, могут дополнительно или альтернативно участвовать в осуществлении настоящего изобретения, как обсуждается далее в настоящем описании более подробно.

Это совместное введение композиции, содержащей фазу диспергированного газа, и композиции, включающей диффундирующий компонент, имеющий соответствующую степень летучести, может быть противопоставлено предыдущим предложениям, предусматривающим введение только летучего вещества, например, в форме коллоидов со сдвигом фазы, как описано в WO-A-9416739. Таким образом, препараты контрастных агентов по настоящему изобретению позволяют контролировать такие факторы как возможность и/или скорость роста диспергированного газа путем подбора подходящих составляющих совместно вводимых композиций, как описывается далее в настоящем описании более подробно, в то время как введение только упоминавшихся выше коллоидов со сдвигом фазы может привести к образованию микропузырьков, которые растут бесконтрольно и неравномерно, возможно, до такой степени, при которой по меньшей мере часть этих микропузырьков может вызвать потенциально опасную эмболизацию, например, сосудов миокарда и головного мозга (см., например, Schwartz, Advances in Echo-Contrast (1994 (3), стр. 48-49).

Было установлено также, что введение только коллоидов со сдвигом фазы может не вызвать надежного или постоянного улетучивания in vivo дисперсной фазы с образованием микропузырьков газа или пара. Grayburn et al. в J.Am.Coll. Cardiol. 26(5) (1995), стр. 1340-1347 высказали предположение о том, что для достижения непрозрачности миокарда у собак может потребоваться предварительная активация перфторпентановых эмульсий в эффективных визуализирующих дозах, достаточно низких, чтобы избежать побочных эффектов со стороны гемодинамики. Методика активации для таких коллоидных дисперсий, включающая приложение к ним гидобарических сил, описана в WO-A-9640282; обычно она включает частичное наполнение шприца эмульсией и с последующим насильственным удаляющим движением поршня шприца и затем его высвобождением для достижения временного изменения давления, что вызывает образование микропузырьков газа в эмульсии. Это несколько обременительная процедура, которая может и не обеспечить постоянных уровней активации.

В US-A-5536489 говорится, что эмульсии нерастворимых в воде газообразующих химических веществ, таких как перфторпентан, могут использоваться в качестве контрастных агентов для получения изображения конкретных участков; эти эмульсии только образуют значительное количество усиливающих изображение микропузырьков газа при приложении ультразвуковой энергии к конкретному участку тела, изображение которого желательно получить. Проведенные исследования показали, что эмульсии летучих соединений, таких как 2-метилбутан или перфторпентан, не дают заметного усиления эхо-сигнала как in vitro, так и in vivo, когда используется ультразвуковая энергия на уровнях, которые достаточны для получения отчетливых контрастных эффектов при использовании двухкомпонентных контрастных агентов по настоящему изобретению.

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения обеспечивается комбинированный препарат для одновременного, раздельного или последовательного использования в качестве контрастного агента для получения ультразвукового изображения; указанный препарат содержит: 1) водную среду для инъекций, включающую диспергированный в ней газ; и 2) композицию, включающую диффундирующий компонент, способный in vivo диффундировать в указанный диспергированный газ так, чтобы по меньшей мере временно увеличивать его размеры.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ получения усиленных изображений у объектов - человека или животных, который включает следующие стадии: i) инъецирование физиологически приемлемой водной среды, включающей диспергированный в ней газ, в кровеносную систему указанных объектов; ii) до, во время или после инъекции указанной водной среды введение указанному объекту композиции, содержащей диффундирующий компонент, способный in vivo диффундировать в указанный диспергированный газ так, чтобы по меньшей мере временно увеличивать его размеры; и iii) получение ультразвукового изображения по меньшей мере части указанного объекта.

Этот способ по настоящему изобретению может с успехом применяться для визуализации тканевой перфузии у объекта, увеличения размеров диспергированного газа, применяемого для обогащения или временной задержки газа микроциркуляторной части сосудистого русла такой ткани, повышая, таким образом, ее эхогенность.

В этой газовой дисперсии может быть представлен любой биосовместимый газ; использующийся в настоящем описании термин "газ" включает любые вещества (в том числе смеси), по меньшей мере, частично, например, в значительной степени или полностью в газообразной форме (включая пар) при нормальной температуре человеческого тела (37^oС). Такой газ может, например, включать воздух; азот; кислород; диоксид углерода; водород; инертный газ, такой как гелий, аргон, ксенон или криптон, фторид серы, такой как гексафторид серы, двусернистый декафторид или пентафторид трифторметилсеры; гексафторид селена; необязательно галогенированный силан, такой как метилсилан или диметилсилан; низкомолекулярный углеводород (например, содержащий до 7 атомов углерода), например алкан, такой как метан, этан, пропан, бутан или пентан, циклоалкан, такой как циклопропан, циклобутан или циклопентан, алкен, такой как этилен, пропен, пропадиен или бутен, или алкин, такой как ацетилен или пропин; простой эфир, такой как диметиловый эфир; кетон, сложный эфир; галогенированный ниэкомолекулярный углеводород (например, содержащий до 7 атомов углерода); или смесь любых вышеупомянутых веществ. Выгодно, если по меньшей. мере некоторые из атомов галогенов в галогенированных газах являются атомами фтора; таким образом, биосовместимые галогенированные углеводородные газы можно выбирать, например, из бромхлордифторметана, хлордифторметана, дихлордифторметана, бромтрифторметана, хлортрифторметана, хлорпентафторэтана, дихлортетрафторэтана, хлортрифторэтилена, фторэтилена, этилфторида, 1,1-дифторэтана и перфторуглеводородов. Типичные перфторуглеводороды включают перфторалканы, такие как перфторметан, перфторэтан, перфторпропаны, перфторбутаны (например, перфтор-н-бутан, необязательно, в смеси с другими изомерами, такими как перфтор-изобутан), перфторпентаны, перфторгексаны или перфторгептаны, перфторалкены, такие как перфторпропен, перфторбутены (например, перфторбут-2-ен), перфторбутадиен, перфторпентены (например, перфторпент-1-ен или перфтор-4-метилпент-2-ен); перфторалкины, такие как перфторбут-2-ин, и перфторциклоалканы, такие как перфторциклобутан, перфторметилциклобутан, перфтордиметилциклобутаны, перфтортриметилциклобутаны, перфторциклопентан, перфторметилциклопентан, перфтордиметилциклопентаны, перфторциклогексан, перфторметилциклогексан или перфторметилциклогептан. Другие галогенированные газы включают метилхлорид, фторированные (например, перфторированные) кетоны, такие как перфторацетон, и фторированные (например, перфторированные) эфиры, такие как перфтордиэтиловый эфир. Применение перфторированных газов, например гексафторида серы и перфторуглеводородов, таких как перфторпропан, перфторбутаны, перфторпентаны и перфторгексаны, может быть особенно выгодным с точки зрения признанной высокой стабильности в кровтоке микропузырьков, содержащих такие газы. Другие газы с физико-химическими свойствами, обеспечивающими формирование высокостабильных микропузырьков в кровотоке, также могут быть полезны.

Диспергированный газ можно вводить в любой удобной форме, например с помощью композиции, содержащей любой подходящий ультразвуковой контрастный агент, такой как композиция, содержащая газ. Типичные примеры таких композиций включают микропузырьки газа, стабилизированные (например, по меньшей мере, частично, инкапсулированные) посредством поверхностной мембраны, устойчивой к слипанию (например, желатиновой, как описано, например, в WO-A-8002365), пленкообразующего белка (например, альбумина, такого как сывороточный альбумин человека, как описано например, в US-A-4718433, US-A-4774958, US-А-4844882, ЕР-А-0359246, WO-A-9112823, WO-A-9205806, WO-A-9217213, WO-A-9406477 или WO-A-9501187), полимерного материала (например, синтетического биоразлагаемого полимера, как описано в ЕР-А-0398935, эластичной разделительной синтетической полимерной мембраны, как описано в ЕР-А-0458745, микрочастиц биоразлагаемого полиальдегида, как описано в ЕР-А-0441468, микрочастиц N-дикарбоксильного производного полиаминокислоты-полициклического имида, как описано в ЕР-А-0458079, или биоразлагаемого полимера, как описано в WO-A-9317718 или в WO-A-9607434, неполимерного и неполимеризующегося материала, образующего оболочку (например, как описано в WO-A-9521631) или поверхностно-активного вещества (например, поверхностно-активного вещества на основе блок-сополимера поли-оксиэтилен-полиоксипропилен, такого как Pluronic, полимерное поверхностно-активное вещество, как описано в WO-A-9506518, или пленкообразующего поверхностно-активного вещества, такого как фосфолипид, например, как описано в WO-A-9211873, WO-A-9217212, WO-A-9222247, WO-A-9428780, WO-A-9503835 или WO-A-9729783).

Другие полезные композиции контрастных агентов, содержащие газ, включают твердые системы, содержащие газ, например микрочастицы (особенно агрегаты микрочастиц), заключающие внутри газ или связанные с ним иным способом (например, адсорбированный на поверхности микрочастиц газ и/или содержащийся в их пустотах, полостях или порах, например, как описано в ЕР-А-0122624, ЕР-А-0123235, ЕР-А-0365467, WO-A-9221382, WO-A-9300930, WO-A-9313802, WO-A-9313808 или WO-A-9313809). Следует учитывать тот факт, что эхогенность таких контрастных агентов, находящихся в форме микрочастиц, может появляться непосредственно благодаря содержащемуся в них или связанному с ними газу и/или благодаря газу (например, микропузырькам), который высвобождается из твердого материала (например, при растворении структуры микрочастиц).

Описания всех вышеупомянутых документов, относящихся к композициям контрастных агентов, содержащим газ, включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Микропузырьки газа и другие содержащие газ материалы, такие как микрочастицы, предпочтительно, имеют первоначальный размер не более 10 мкм (например, 7 мкм или менее), чтобы было возможно их прямое прохождение через легочную систему после введения, например, путем внутривенной инъекции. Однако более крупные микропузырьки могут использоваться, например, если они содержат смесь одного или более относительно растворимых в крови или иным способом способных к диффузии газов, таких как воздух, кислород, азот или диоксид углерода, с одним или более практически нерастворимыми и не способными к диффузии газами, такими как перфторуглеводороды. Обратная диффузия растворимого/способного к диффузии газового содержимого после введения будет вызывать быстрое уменьшение размеров микропузырьков, которое будет определяться количеством присутствующего нерастворимого/не способного к диффузии газа и которое может быть подобрано таким образом, чтобы получившиеся микропузырьки могли проходить через легочные капилляры легочной системы.

Поскольку диспергированный газ, введенный в соответствии с настоящим изобретением, растет in vivo под действием диффундирующего компонента, минимальный размер микропузырьков газа, связанного с твердым носителем, и т.п. при введении может быть значительно меньше размеров, обычно необходимых для обеспечения значительного взаимодействия с ультразвуком (обычно около 1-5 мкм при использовании стандартных ультразвуковых частот); размеры частиц диспергированного газа могут, таким образом, составлять 1 нм и менее. Настоящее изобретение, соответственно, может позволить применять содержащие газ композиции, которые до настоящего времени не предлагались для использования в качестве ультразвуковых контрастных агентов, например, из-за малого размера составляющих диспергированного газа.

Если применяются содержащие фосфолипиды композиции по настоящему изобретению, например, в форме микропузырьков газа, стабилизированных фосфолипидами, типичные примеры пригодных для этой цели фосфолипидов включают лецитины (т. е. фосфатидилхолины), например природные лецитины, такие как лецитин яичного желтка или лецитин соевых бобов, полусинтетические (например, частично или полностью гидрированные) лецитины и синтетические лецитины, такие как димиристоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин или дистеароилфосфатидилхолин; фосфатидные кислоты; фосфатидилэтаноламины; фосфатидилсерины; фосфатидилглицерины; фосфатидилинозитолы; кардиолипины; сфингомиелины; фторированные аналоги любых указанных выше веществ; смеси любых указанных выше веществ и их смеси с другими липидами, такими как холестерин. Использование фосфолипидов, преимущественно (например, по меньшей мере 75%) включающих молекулы, несущие индивидуально чистый общий заряд, например отрицательный заряд, в том числе как это встречается у природных (например, полученных из соевых бобов или яичного желтка), полусинтетических (например, частично или полностью гидрированных) и синтетических фосфатидилсеринов, фосфатидилдиглицеринов, фосфатидилинозитолов, фосфатидных кислот и/или кардиолипинову например, как описано в WO-A-9729783, может быть особенно выгодным.

Типичные примеры содержащих газ материалов в форме микрочастиц, которые могут быть полезны в соответствии с настоящим изобретением, включают углеводы (например, гексозы, такие как глюкоза, фруктоза или галактоза; дисахариды, такие как сахароза, лактоза или мальтоза; пентозы, такие как арабиноза, ксилоза или рибоза; α-, β- и γ- циклодексекстрины; полисахариды, такие как крахмал, гидроксиэтилкрахмал, амилоза, амилопектин, гликоген, инулин, пулуллан, декстран, карбоксиметилдекстран, декстранфосфат, кетодекстран, аминоэтилдекстран, альгинаты, хитин, хитозан, гиалуроновая кислота или гепарин; и сахарные спирты, включая альдитолы, такие как маннит или сорбит), неорганические соли (например, хлорид натрия), органические соли (например, цитрат натрия, ацетат натрия или тартрат натрия), рентгеновские контрастные агенты (например, любые из коммерчески доступных карбоновых кислот и неионных амидных контрастных агентов, обычно содержащих по меньшей мере одну 2,4,6-трииодфенильную группу, имеющую заместители, такие как карбоксил, карбамоил, N-алкилкарбамоил, N-гидроксиалкилкарбамоил, ациламино, N-алкилациламино или ациламинометил в положении 3 и/или 5, как в метризоевой кислоте, диатризоевой кислоте, иоталамовой кислоте, иоксагловой кислоте, иогексоле, иопентоле, иопамидоле, иодиксаноле, иопромиде, метризамиде, иодипамиде, меглумин иодипамиде, меглумин ацетриазоате и меглумин диатризоате), и полипептиды и белки (например, желатин или альбумин, такой как сывороточный альбумин человека).

Другие содержащие газ материалы, которые могут быть полезны в соответствии с настоящим изобретением, включают содержащий газ материал, стабилизированный металлами (например, как описано в US-A-3674461 или US-A-3528809), содержащий газ материал, стабилизированный синтетическими полимерами (например, как описано в US-A-3975194 или Farnand в Powder Technology 22 (1979), стр. 11-16), коммерчески доступные микрогранулы типа Expancel®, например Expancel 551 DE (см., например, Eur.Plast.News 9(5) (1982), стр.39, Nonwovens Industry (1981), стр. 21 и Mat.Plast. Elast. 10 (1980), стр. 468), коммерчески доступные микросферы типа Ropaque® (см., например, J,Coatings Technol. 55(707) (1983), стр.79), микро- и наноструктуры, содержащие газ, такие как зеолиты, неорганические или органические аэрогели, химические наноструктуры, содержащие открытые пустоты, такие как фуллерены, клатраты или нанотрубочки (например, как описано G.E. Gadd в Science 277 (5328) (1997), стр. 933-936), и природные дисперсии микропузырьков, стабилизированные поверхностно-активным веществом (например, как описано d'Arrigo в "Stable Gas-in-Liquid. Emulsions, Studies in phisical and theoretical chemistry" 40 - Elsevier, Amsterdam (1986)).

Обширный ряд диффундирующих компонентов могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, включая газы/пары, летучие жидкости, летучие твердые вещества и предшественники, способные вырабатывать газ, например, после введения, при том принципиальном условии, что этот компонент должен или иметь или быть способным генерировать достаточное давление газа или пара in vivo (например, по меньшей мере 10 мм рт.ст.) так, чтобы быть способным ускорять диффузию молекул газа или пара вовнутрь диспергированного газа. Следует учитывать тот факт, что смеси двух или более диффундирующих компонентов могут, если это желательно, применяться в соответствии с настоящим изобретением; термин "диффундирующий компонент", использующийся в настоящем описании, включает также и эти смеси. Подобно этому, упоминание о введении диффундирующего компонента включает также введение двух или более таких компонентов как в виде смесей, так и за несколько введений.

Композициям, включающим диффундирующий компонент, можно придавать любую подходящую форму и их можно вводить любым подходящим способом; путь введения частично зависит от той области организма, которая подлежит исследованию. Так, например, пероральное введение подходящей композиции, включающей диффундирующий компонент, может быть особенно полезным, если желательно обеспечить временную задержку газа в ткани стенок желудочно-кишечного тракта. В типичные варианты осуществления таких применений дисперсию газа можно вводить внутривенно в дозах, аналогичных тем, которые используются в эхокардиографии, а диффундирующий компонент может изготавливаться в форме эмульсии для перорального введения, например эмульсии перфторуглеводорода в воде, как описано далее более подробно, и применяться, например, в дозе 0,2-1,0 мкл перфторуглеводорода на килограмм. После введения и распределения этих двух композиций рост газовой дисперсии в капиллярном русле стенки желудка или кишечника может усилить контрастность контуров этих участков. Следует учитывать тот факт, что обратная комбинация вводимой перорально газовой дисперсии и вводимого внутривенно диффундирующего компонента также может быть полезна для обеспечения контрастности контуров внутренней стенки или слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Может быть выгодным при применении для перорального введения таких композиций газовой дисперсии или диффундирующего компонента инкорпорировать химические группы или вещества, способствующие адгезии к стенке желудочно-кишечного тракта, например, путем смешивания с композицией или присоединением к ее компоненту, например, поверхностно-активного вещества или другой стабилизирующей части, поскольку это может стимулировать рост фазы диспергированного газа путем усиления ее контакта с диффундирующим компонентом. Примеры таких групп/веществ, способствующих адгезии, ранее были описаны применительно, например, к контрастным агентам для рентгеновского исследования желудочно-кишечного тракта, и включают акриловые эфиры, как описано в WO-A-9722365, иодфенол-сульфонатные эфиры, как описано в US-A-5468466 и иодированные фенильные эфиры, как описано в US-A-5260049.

Для обеспечения роста введенной дисперсии газа немедленно после ее прохождения через легочные капилляры можно использовать ингаляцию удобного летучего диффундирующего компонента, например, так, чтобы газ затем временно задержался в капиллярах миокарда. В таких вариантах осуществления настоящего изрбретения рост диспергированного газа может далее увеличиваться посредством повышения давления диффундирующего компонента в легких, например, избыточного давления до 0,5 бар, например, путем использования респиратора и выдоха с преодолением сопротивления.

Внутримышечное или подкожное введение должным образом составленных композиций диффундирующего агента, например, инкорпорированного в физиологически приемлемый жидкий носитель, может, например, с успехом применяться, если желательно, специфическое ограничение эффекта этого компонента в отношении конкретной области-мишени пациента. Один пример композиции для подкожного введения включает наночастицы, такие, которые используются для лимфоангиографии. Подкожно вводимый диффундирующий компонент может поступать в лимфатическую систему, где он может вызывать рост внутривенно введенной газовой дисперсии, облегчая, таким образом, получение изображения лимфатических узлов. Таким же образом может применяться обратная композиция подкожно вводимой газовой дисперсии и внутривенно вводимого диффундирующего компонента.

Внутривенное введение должным образом составленных композиций диффундирующего агента, например, инкорпорированного в физиологически приемлемый жидкий носитель, позволяет разнообразно использовать настоящее изобретение, поскольку, как будет обсуждаться далее в деталях, составляющие газовой дисперсии и композиций диффундирующего агента могут подбираться таким образом, чтобы можно было контролировать такие параметры как начало и скорость роста диспергированного газа и, таким образом, части тела, в которых эхогенность тканей может быть усилена посредством временной задержки газа, например, в микроциркуляторной части сосудистого русла этих тканей.

Подходящие композиции для местного применения могут наноситься на кожу, чтобы способствовать чрескожному всасыванию диффундирующего компонента. Такой способ введения можно применять для получения изображения и/или лечения кожи, подкожной жировой клетчатки и прилегающих к ним областей и органов, например, при воздействии на периферический кровоток конечностей, таких как нижние конечности.

Диффундирующие компоненты для перорального или инъекционного введения могут, например, изготавливаться в виде растворов в воде или смесей с водой и/или с одним или более смешиваемыми с водой и физиологически приемлемыми органическими растворителями, такими как этанол, глицерин или полиэтиленгликоль; дисперсий в водной среде, например, в виде масляной фазы или составляющей масляной фазы эмульсии типа "масло в воде"; микроэмульсий, т.е. систем, в которых вещество эффективно растворяется в гидрофобном внутреннем содержимом мицелл поверхностно-активного вещества, присутствующих в водной среде; или в ассоциации с микрочастицами или наночастицами, диспергированными в подходящем жидком носителе, например, в адсорбированном на поверхности микрочастиц или наночастиц виде и/или содержащихся внутри пустот, полостей или пор микрочастиц или наночастиц, или в инкапсулированном в микрокапсулах виде.

В тех случаях, когда диффундирующий компонент должен вводиться в форме раствора, парциальное давление, создаваемое им in vivo, будет зависеть от концентрации этого компонента, например, в кровотоке, и от соответствующего давления чистого материала компонента, например, в соответствии с законом Рауля (Raoult's law) для систем, приближающихся к идеальным. Таким образом, если компонент плохо растворяется в воде, желательно, чтобы он имел достаточное давление пара в чистой форме при нормальной температуре человеческого тела, например по меньшей мере 50 мм рт.ст., предпочтительно, по меньшей мере 100 мм рт.ст. Примеры относительно нерастворимых в воде компонентов, имеющих высокое давление пара, включают газы, такие как перечисленные выше, как возможные газы в форме микропузырьков.

Типичные примеры диффундирующих компонентов с более высокой растворимостью в воде и/или смешиваемостью с водой, которые, соответственно могут создавать более низкое давление пара при температуре тела, включают алифатические простые эфиры, такие как этилметиловый эфир или метилпропиловый эфир; алифатические сложные эфиры, такие как метилацетат, метилформиат или этилформиат; алифатические кетоны, такие как ацетон; алифатические амиды, такие как N,N-диметилформамид или N,N-диметилацетамид и алифатические нитрилы, такие как ацетонитрил.

Однако может быть предпочтительным использование практически не смешивающегося с водой диффундирующего компонента, изготовленного в форме эмульсии (например, стабилизированной суспензии) в подходящей водной среде, поскольку в таких системах давление пара в водной фазе диффундирующего компонента будет практически равно таковому чистого материала компонента, даже в очень разбавленных эмульсиях. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения диффундирующий компонент может, например, изготавливаться как часть патентованной фармацевтической эмульсии, такой как Intralipid® (Pharmacia).

Диффундирующий компонент в таких эмульсиях желательно представляет собой жидкость при температурах процесса изготовления и хранения, которые могут быть низкими, как, например, -10^oС, если водная фаза содержит соответствующие антифризы, в то же время являясь газом или создавая значительное давление пара при температуре человеческого тела. Подходящие соединения можно выбрать, например, из различных эмульгирующихся низкокипящих жидкостей, перечисленных в вышеуказанной публикации WO-A-9416379, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Конкретные примеры эмульгирующихся диффундирующих компонентов включают алифатические простые эфиры, такие как диэтиловый эфир; полициклические масла или спирты, такие как ментол, камфора или эвкалиптол; гетероциклические соединения, такие как фуран или диоксан; алифатические углеводороды, которые могут быть насыщенными или ненасыщенными, а также с прямой цепью или разветвленными, например, н-бутан, н-пентан, 2-метилпропан, 2-метилбутан, 2,2-диметилпропан, 2,2-диметилбутан, 2,3-диметилбутан, 1-бутен, 2-бутен, 2-метилпропен, 1,2-бутадиен, 1,3-бутадиен, 2-метил-1-бутен, 2-метил-2-бутен, изопрен, 1-пентен, 1,3-пентадиен, 1,4-пентадиен, бутенин, 1-бутин, 2-бутин или 1,3-бутадиин; циклоалифатические углеводороды, такие как циклобутан, циклобутен, метилциклопропан или циклопентан; и галогенированные низкомолекулярные углеводороды (например, содержащие до 7 атомов углерода). Типичные галогенированные углеводороды включают дихлорметан, метилбромид, 1,2-дихлорэтилен, 1,1-дихлорэтан, 1-бромэтилен, 1-хлорэтилен, этилбромид, этилхлорид, 1-хлорпропен, 3-хлорпропен, 1-хлорпропан, 2-хлорпропан и т-бутилхлорид. Выгодно, если по меньшей мере некоторые из атомов галогенов являются атомами фтора; как, например, в дихлорфторметане, трихлорфторметане, 1,2-дихлор-1,2-дифторэтане, 1,2-дихлор-1,1,2,2-тетрафторэтане, 1,1,3-трихлор-1,2,2-трифторэтане, 2-бром-2-хлор-1,1,1-трифторэтане, 2-хлор-1,1,2-трифторэтил дифторметиловом эфире, 1-хлор-2,2,2-трифторэтил дифторметиловом эфире, частично фторированные алканы (например, пентафторпропаны, такие как 1Н,1Н,3Н-пентафторпропан, гексафторбутаны, нонафторбутаны, такие как 2Н-нонафтор-т-бутан, и декафторпентаны, такие как 2Н, 3Н-декафторпентан), частично фторированные алкены (например, гептафторпентены, такие как 1Н,1Н,2Н-гептафторпент-1-ен, и нонафторгексены, такие как 1Н,1Н,2Н-нонафторгекс-1-ен), фторированные простые эфиры (например, 2,2,3,3,3-пентафторпропилметиловый эфир или 2,2,3,3,3-пентафторпропилдифторметиловый эфир) и, более предпочтительно, перфторуглеводороды. Примеры перфторуглеводородов включают перфторалканы, такие как перфторбутаны, перфгорпентаны, перфторгексаны (например, перфтор-2-метилпентан), перфторгептаны, перфтороктаны, перфторнонаны и перфтордеканы; перфторциклоалканы, такие как перфторциклобутан, перфторметилциклобутаны, перфторциклопентан и перфтордиметилциклопентан; перфторалкены, такие как перфторбутены (например, перфторбут-2-ен или перфторбута-1,3-диен), перфторпентены (например, перфторпент-1-ен) и перфторгексены (например, перфтор-2-метилпент-2-ен или перфтор-4-метилпент-2-ен); перфторциклоалкены, такие как перфторциклопентен или перфторциклопентадиен; и перфторированные спирты, такие как перфтор-т-бутанол.

Такие эмульсии могут также содержать по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество для стабилизации дисперсии; это может быть любое то же или другое поверхностно-активное вещество (вещества), которое используется для стабилизации газовой дисперсии. Природа любого такого поверхностно-активного вещества может значительно влиять на такие факторы как скорость роста фазы диспергированного газа. Обычно может быть пригоден целый ряд поверхностно-активных веществ, например, выбранных из перечня, представленного в патенте ЕР-А-0727225, включенного в настоящее описание в качестве ссылки. Типичные примеры пригодных поверхностно-активных веществ включают жирные кислоты (например, насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты с прямой цепью, например, содержащие 10-20 атомов углерода) и их углеводные и триглицеридные эфиры, фосфолипиды (например, лецитин), фторсодержащие фосфолипиды, белки (например, альбумины, такие как сывороточный альбумин человека), полиэтиленгликоли и блок-сополимерные поверхностно-активные вещества (например, блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, такие как Pluronics, расширяющиеся полимеры, такие как ацилоксиацил полиэтиленгликоли, например, полиэтиленгликольметиловый эфир 16-гексадеканоилоксигексадеканоата, например, в котором доля полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу 2300, 5000 или 10000), и фторсодержащие поверхностно-активные вещества (например, те, которые носят торговое наименование Zonyl и Fluorad, или те, которые описаны в публикации WO-A-9639197, включенной в настоящее описание в качестве ссылки). Особенно полезные поверхностно-активные вещества включают фосфолипиды, содержащие молекулы, несущие индивидуально чистый общий отрицательный заряд, такие как имеющие природное происхождение (например, полученные из соевых бобов или яичного желтка), полусинтетические (например, частично или полностью гидрированные) и синтетические фосфатидилсерины, фосфатидилдиглицерины, фосфатидилинозитолы, фосфатидные кислоты и/или кардиолипины.

Размер капель диспергированного диффундирующего компонента в эмульсиях, предназначенных для внутривенного введения, должен предпочтительно составлять менее 10 мкм, например менее 7 мкм и более 0,1 мкм, чтобы облегчать беспрепятственное прохождение через легочную систему.

Как отмечалось выше, не смешивающиеся с водой диффундирующие компоненты могут также изготавливаться в форме микроэмульсий. Такие системы имеют преимущества в силу своей термодинамической стабильности и того факта, что диффундирующий компонент практически однородно распределен в водной фазе; таким образом, микроэмульсии имеют вид растворов, но могут обладать свойствами эмульсий с точки зрения парциального давления дисперсной фазы.

Предшественники газа, которые можно использовать, включают любые биосовместимые компоненты, способные генерировать газ in vivo, т.е. при температуре тела и физиологических значениях рН. Типичные примеры включают неорганические и органические карбонаты и бикарбонаты, а также вещества, генерирующие азот, такие как пиразолины, пиразолы, триазолины, диазокетоны, соли диазония, тетразолы и азиды. Следует учитывать тот факт, что в таких системах присутствует выделяющийся в конечном итоге газ, который является реальным диффундирующим компонентом.

С целью обеспечения максимальной летучести диффундирующего компонента после введения и для усиления роста диспергированного газа, каждый из которых является эндотермическим процессом, может быть выгодным манипулировать температурой раствора или суспензии диффундирующего компонента и/или газовой дисперсии перед введением и/или инкорпорировать в них экзотермически реакционные составляющие; применение таких составляющих, которые экзотермически реагируют под влиянием ультразвука, может быть особенно выгодным.

Рост дисперсной газовой фазы in vivo может, например, сопровождаться расширением любого инкапсулирующего материала (если он имеет достаточную эластичность) и/или отделением избытка поверхностно-активного вещества из введенного материала в увеличивающиеся поверхности раздела газа и жидкости. Однако возможно также, что растяжение инкапсулирующего материала и/или взаимодействие материала с ультразвуком может значительно увеличить его порозность. В то время как такой разрыв инкапсулирующего материала, как представляется в настоящее время, во многих случаях приводит к быстрой утрате эхогенности из-за диффузии вовне и растворению "обнажившегося" газа, было обнаружено, что при использовании препаратов контрастных агентов по настоящему изобретению этот газ демонстрирует значительную стабильность. Без связи с теоретическими расчетами, можно предположить, что "обнажившийся" газ, например, в форме освобожденных микропузырьков, может быть стабилизирован, например, от спадения микропузырьков, путем перенасыщения окружающей среды диффундирующим компонентом, что создает внутренний градиент давления для противодействия тенденции диффузии вовне микропузырьков газа. Обнажившаяся поверхность газа вследствие практического отсутствия инкапсулирующего материала может придать препарату контрастного агента исключительно благоприятные акустические свойства, о чем свидетельствует высокое рассеяние и низкое поглощение энергии (например, выраженное как соотношение высокое рассеяние:затухание); этот эхогенный эффект может продолжаться в течение значительного периода времени, даже при продолжающейся иррадиации ультразвуком.

Стабилизирующий эффект совместно введенного диффундирующего компонента может, таким образом, с большим успехом использоваться для увеличения как продолжительности, так и величины эхогенности существующих композиций содержащих газ контрастных агентов, в случаях, когда эти параметры могут быть недостаточными при введении только композиции контрастного агента. Так, например, продолжительность эффекта контрастных агентов на основе альбумина часто резко ограничивается из-за спадения инкапсулирующего альбуминового материала как в результате изменений систолического давления в сердце или венозной системе, так и вследствие действия самого ультразвука, но может быть значительно увеличена путем совместного с диффундирующим компонентом введения в соответствии с настоящим изобретением.

В типичном варианте осуществления способа по настоящему изобретению композицию, включающую дисперсию газа, и композицию, включающую суспензию диффундирующего агента, выбирают таким образом, чтобы по меньшей мере часть диспергированного газа проходила через легкие, а затем, после прохождения через легкие, претерпевала бы быстрый рост посредством внутренней диффузии диффундирующего компонента так, чтобы временно задерживаться в миокарде и, таким образом, обеспечивать ультразвуковую визуализацию перфузии миокарда. По мере падения концентрации летучего диффундирующего компонента в кровотоке, например, при клиренсе крови от этого компонента, например, посредством удаления через легкие и выдыханием пациента, посредством метаболизма или перераспределения в другие ткани, диффундирующий компонент будет в типичном случае диффундировать из диспергированного газа, который, следовательно, будет сокращаться до прежних меньших размеров, и в конце концов вновь будет свободно перемещаться в кровотоке и обычно будет удаляться оттуда с помощью ретикулоэндотелиальной системы. Эта картина значительного преходящего повышения эхогенности, а затем исчезновения контрастного эффекта существенно отличается от любых эхогенных свойств, присущих каждой из двух композиций при их введении поодиночке. Следует учитывать тот факт, что контроль продолжительности задержки диспергированного газа может, следовательно, достигаться путем должного подбора дозы и/или композиции диффундирующего компонента.

Другие капиллярные системы, такие как (но не ограничиваясь эти перечнем) капиллярные системы почки, печени, селезенки, щитовидной железы, скелетной мышцы, молочной железы и пениса, также можно визуализировать описанным способом.

Следует учитывать, что такие факторы как скорость и/или степень роста диспергированного газа могут, в целом, контролироваться путем должного подбора газа и любого инкапсулирующего стабилизирующего материала и, более конкретно, природой диффундирующего компонента и характером содержащей его композиции, включая природу любого используемого поверхностно-активного вещества и размер капель дисперсной фазы, когда компонент включается в композицию в форме эмульсии; в этом последнем контексте для данного количества эмульгированного диффундирующего компонента сокращение размеров капель может увеличить скорость переноса диффундирующего компонента по сравнению со скоростью при более крупным каплях, поскольку более быстрое высвобождение может наблюдаться из более мелких капель, имеющих более высокие соотношения площади поверхности и объема. Другие параметры, позволяющие осуществлять контроль, включают относительные количества, в которых вводятся эти две композиции, и, если они вводятся отдельно друг от друга, последовательность введения, интервал времени между введениями, а также возможное пространственное разделение этих двух введений. В этом последнем аспекте следует обратить внимание на тот факт, что коэффициент диффузии, присущий диффундирующему компоненту, может позволить его применение в различных частях тела самыми разными способами, например, путем ингаляции, накожным, чрескожным, внутривенным, внутримышечным или пероральным путем, в то время как доступные формы введения для диспергированного газа могут быть до некоторой степени более ограниченными.

Особенно важными параметрами, относящимися с диффундирующему компоненту, являются его растворимость в воде/крови и его коэффициент диффузии (например, выраженный константами диффузии), которые будут определять скорость его транспорта через жидкий носитель или кровь, и его проникающую способность через любую мембрану, инкапсулирующую диспергированный газ. Давление, генерируемое диффундирующим компонентом in vivo, также будет влиять на скорость его диффузии в диспергированный газ, то же относится и к его концентрации. Таким образом, в соответствии с законом Фика (Fick's law), градиент концентрации диффундирующего компонента относительно расстояния между, например, отдельными микропузырьками газа и каплями эмульсии, вместе с коэффициентов диффузии диффундирующего вещества в окружающую жидкую среду, будет определять скорость переноса простой диффузией; градиент концентрации определяется растворимостью диффундирующего компонента в окружающей среде и расстоянием между отдельными микропузырьками газа и каплями эмульсии.

Эффективная скорость транспорта диффундирующего компонента может, если желательно, контролироваться путем подбора вязкости композиции, содержащей фазу диспергированного газа, и/или композиции диффундирующего компонента, например, путем включения в состав одного или более биосовместимых усилителей вязкости, таких как рентгеноконтрастные агенты, полиэтиленгликоли, углеводы, белки, полимеры или спирты. Может иметь преимущества, например, совместная инъекция этих двух композиций в форме болюса относительно большого объема (например, объемом по меньшей мере 20 мл для человека весом 70 кг), поскольку это будет задерживать полное смешивание этих составляющих с кровью (и, таким образом, задерживать начало роста диспергированного газа) до тех пор, пока не пройден правый желудочек сердца и легочные капилляры. Задержка роста диспергированного газа может быть доведена до максимума путем применения жидкого носителя, не полностью насыщенного газами и любыми другими диффундирующими компонентами, определенными выше, например, в результате охлаждения.

Как отмечалось выше, в настоящем изобретении могут участвовать и другие механизмы транспорта, помимо диффузии. Так, например, транспорт может наблюдаться также в результате гидродинамического потока в окружающей жидкой среде; это может быть важным в сосудах и капиллярах, где может наблюдаться большая разница скоростей потока. Транспорт диффундирующего компонента в диспергированный газ может наблюдаться также в результате процессов соударения или почти соударения, например, между микропузырьками газа и каплями эмульсии, например, приводящих к адсорбции диффундирующего компонента на поверхности микропузырьков и/или проникновения диффундирующего компонента в микропузырьки, т.е. форма коалесценции. В таких случаях коэффициент диффузии и растворимость диффундирующего компонента оказывают минимальное влияние на скорость переноса, размер частиц диффундирующего компонента (например, размер капель в случае эмульсии) и частоту соударения между микропузырьками и каплями, являясь в то же время главными факторами контроля за скоростью и степенью роста микропузырьков. Так, например, для данного количества эмульгированного диффундирующего компонента сокращение размеров капель приведет к увеличению их общего количества и, таким образом, может увеличить скорость переноса путем сокращения среднего расстояния между частицами микропузырьков газа и каплями эмульсии, и, таким образом, повысить вероятность соударения и/или коалесценции. Следует учитывать тот факт, что скорость переносов, происходящих посредством процессов соударения, может значительно увеличиться, если к пузырькам газа и каплям эмульсии диффундирующего компонента будет приложен дополнительной осциллирующий момент в результате воздействия энергии ультразвука. Кинетика процессов соударения, индуцированных энергией ультразвука, может отличаться от кинетики для транспорта диффундирующего компонента в жидкий носитель и/или кровь, например, в том, что для инициации коалесценции соударяющихся микропузырьков газа и капель эмульсии могут понадобиться особые уровни энергии. Соответственно, может быть выгодным подбирать размер и, следовательно, массу капель эмульсии, таким образом, чтобы они генерировали достаточную силу соударения с осциллирующими микропузырьками для индуцирования коалесценции.

Выше отмечалось также, что проницаемость любого материала, инкапсулирующего фазу диспергированного газа, является параметром, который может влиять на скорость роста газовой фазы, и может, следовательно, быть желательным подбирать такой диффундирующий компонент, который легко проникает через любой такой инкапсулирующий материал (который может, например, быть мембраной из полимера или поверхностно-активного вещества, например, однослойным или одним или более двойными слоями мембранообразующего поверхностно-активного вещества, такого как фосфолипид). Было установлено однако, что можно использовать также практически непроницаемый инкапсулирующий материал, поскольку, как представляется, воздействие ультразвуком, включая более низкие и более высокие частоты по сравнению с теми, которые обычно применяются при получении ультразвукового изображения в медицинских целях (например, в пределах от 10 Гц до 1 ГГц, предпочтительно, от 1 кГц до 10 МГц), а также длительное излучение или простые или сложные пульсирующие режимы, с использованием комбинированных препаратов контрастных агентов, вводимых в соответствии с настоящим изобретением, может само по себе способствовать или усиливать рост диспергированного газа. Такой рост может, например, индуцироваться воздействием ультразвукового излучения, использующегося для исследования, или воздействием предварительным локализованным излучением, например, для создания эффекта временной задержки газа в микроциркуляторной части сосудистого русла конкретного органа-мишени. Альтернативно, активацию роста диспергированного газа можно индуцировать приложением достаточных количеств других форм энергии, например, встряхиванием, вибрацией, электрическим полем, радиацией или бомбардировкой частицами, например нейтронами, ионами или электронами.

Без связи с теоретическими расчетами, предполагается, что, возможно, воздействие ультразвуком по крайней мере временно изменяет проницаемость инкапсулирующего материала, диффузионную способность диффундирующего компонента в окружающую жидкую фазу и/или частоту соударений капель эмульсии и инкапсулированных микропузырьков. Поскольку этот эффект может наблюдаться при использовании ультракоротких ультразвуковых импульсов (например, продолжительностью около 0,3 мкс при В-режиме действия ультразвукового прибора или около 2 мкс при допплеровском или втором гармоническом режиме), маловероятно, чтобы он представлял собой пример чистой диффузии, при которой продолжающееся воздействием ультразвуком вызывает стойкое увеличение равновесных радиусов пузырьков газа (см. Leighton, E.G. - "The Acoustic Bubble", Academic Press (1994), стр. 379), а, возможно, ультразвуковые импульсы разрывают инкапсулирующую мембрану и облегчают, таким образом, рост диспергированного газа посредством диффузии диффундирующего компонента вовнутрь подвергаемой указанному воздействию газовой фазы.

Если это желательно, диспергированный газ или диффундирующий компонент может включать азеотропную смесь или может быть подобран таким образом, чтобы азеотропная смесь образовывалась in vivo по мере того как диффундирующий компонент будет смешиваться с диспергированным газом. Такая азеотропная формация может, например, эффективно использоваться для усиления летучести относительно высокомолекулярных соединений, например галогенированных углеводородов, таких как фторуглеводороды (включая перфторуглеводороды), которые в обычных условиях являются жидкостями при нормальной температуре человеческого тела 37^oС так, что их можно при этой температуре вводить в газообразном состоянии. Это имеет значительные преимущества с точки зрения эффективного эхогенного времени существования in vivo контрастных агентов, содержащих такие азеотропные смеси, поскольку известно, что такие параметры как растворимость в воде, растворимость в жирах, диффузионная способность и реэистентность к давлению таких соединений как фторуглеводороды, снижаются с увеличением молекулярной массы.

В целом, известная природная резистентность азеотропных смесей к разделению их на составляющие будет усиливать стабильность компонентов контрастных агентов, содержащих такие смеси, во время изготовления, хранения и последующего применения.

Азеотропные смеси, пригодные в соответствии с настоящим изобретением, можно, например, выбирать, опираясь на литературные данные по азеотропам, на результаты экспериментальных исследований и/или на теоретические прогнозы, например, как описано у Tanaka в Fluid Phase Equilibria, 24 (1985), стр. 187-203, у Kittel, C. and Kroemer, H. в 10 главе Thermal Physics (W.H. Freeman &. Co., New York, USA, 1980) или у Hemmer, P.С. в 16-22 главах Statistisk Mekanikk (Tapir, Trondheim, Norway, 1970)" указанные источники включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Одним литературным примером азеотропа, который эффективно снижает температуру кипения более высокомолекулярного компонента ниже нормальной температуры человеческого тела, является смесь 57:43 (по весу) 1,1,2-трихлор-1,2,2-трифторметана (точка кипения 47,6^oС) и 1,2-дифторметана (точка кипения 29,6^oС), описанная в патенте US-A-4055049 как имеющая азеотропную точку кипения 24,9^oС. Другие примеры азеотропных смесей, содержащих галогензамещенные углеводороды, описаны в патентах ЕР-А-0783017, US-A-5599783, US-A-5605647, US-A-5605882, US-A-5607616, US-A-5607912, US-A-5611210, US-A-5614565 и US-A-5616821, включенных в настоящее описание в качестве ссылки.

Simons et al. в J.Chem.Phys. 18(3) (1950), стр. 335-346, сообщают, что смеси перфтор-н-пентана (точка кипения 29^oС) и н-пентана (точка кипения 36^oС) демонстрируют большое положительное отклонение от закона Рауля; этот эффект наиболее ярко выражен у приблизительно эквимолярных смесей. На практике было установлено, что точка кипения этой азеотропной смеси составляет приблизительно 22^oС или менее. Смеси перфторированных углеводородов и ненасыщенных углеводородов обычно могут обладать полезными азеотропными свойствами; сильные аэеотропные эффекты наблюдались у смесей таких компонентов, имеющих практически одинаковые температуры кипения. Примеры таких азеотропов - перфторированный углеводород:углеводород включают смеси перфтор-н-гексана (точка кипения 59^oС) и н-пентана, при которых азеотроп имеет точку кипения между комнатной температурой и 35^oС, и перфтор-4-метилпент-2-ена (точка кипения 49^oС) и н-пентана, при которых азеотроп имеет точку кипения около 25^oС.

Другие потенциально пригодные азеотропные смеси включают смеси галотана и диэтилового эфира и смеси двух или более фторированных газов, например перфторпропана и фторэтана, перфторпропана и 1,1,1-трифторэтана или перфторэтана и дифторметана.

Известно, что фторированные газы, такие как перфторэтан могут образовывать азеотропы с диоксидом углерода (см, например, WO-A-9502652). Соответственно, введение контрастных агентов, содержащих такие газы, может привести к образованию in vivo тройных или более азеотропов с газами крови, такими как диоксид углерода, еще больше увеличивая, таким образом, стабильность диспергированного газа.

Когда две композиции комбинированных препаратов контрастных агентов по настоящему изобретению необходимо ввести одновременно, они могут, например, инъецироваться из отдельных шприцев через подходящее соединяющее устройство или могут быть предварительно смешаны, предпочтительно, в контролируемых условиях так, чтобы избежать преждевременного роста микропузырьков.

Композиции, предназначенные для смешивания перед одновременным введением, можно с успехом хранить в подходящем двух- или многокамерном контейнере. Таким образом, например, композиция газовой дисперсии или ее предшественник в сухом виде [например, включающий лиофилизированный остаток суспензии микропузырьков газа в амфифильной содержащей материал водной среде, особенно, в которой амфифильный материал состоит практически только из фосфолипидов (например, по меньшей мере на 75%, предпочтительно, практически полностью), включающих молекулы с индивидуальным общим чистым (например, отрицательным) зарядом] , может содержаться в первой камере, такой как флакон, с которым герметично соединен шприц, содержащий композицию диффундирующего компонента; выходное отверстие шприца закрыто, например, мембраной или пробкой, чтобы избежать преждевременного смешивания. Ход поршня шприца разрывает мембрану и вызывает смешивание композиции диффундирующего компонента и композиции газовой дисперсии или смешивание и восстановление его предшественника; после какого-либо необходимого встряхивания и/или разведения смесь может быть извлечена (например, с помощью шприца) и введена пациенту.

Альтернативно, эти две композиции могут храниться внутри одного запечатанного флакона или шприца, разделенными, например, мембраной или пробкой; к любой из композиций или к обеим может быть приложено избыточное давление газа или пара. Разрыв мембраны или пробки, например, проколом флакона иглой для подкожных инъекций, приводит к смешиванию композиций; смешивание можно усилить, если это желательно, встряхиванием вручную, после чего смесь может быть извлечена и введена пациенту. Можно использовать также другие варианты осуществления настоящего изобретения, например, при которых флакон, содержащий в сухом виде предшественник композиции газовой дисперсии, соединен с первым шприцем, содержащим жидкость для редиспергирования указанного предшественника, и с вторым шприцем, содержащим композицию диффундирующего компонента, или при которых флакон, содержащий разделенные мембраной композицию диффундирующего компонента и предшественник композиции газовой дисперсии в сухом виде, соединен со шприцем, содержащим жидкость для редиспергирования указанного предшественника.

В вариантах осуществления настоящего изобретения, при которых композицию газовой дисперсии и композицию диффундирующего компонента смешивают перед введением, как на стадии изготовления или впоследствии, эту смесь следует хранить при повышенном давлении или пониженной температуре так, чтобы давление диффундирующего компонента было недостаточным, чтобы вызвать рост диспергированного газа. Активация роста диспергированного газа может быть индуцирована простым устранением избыточного давления или нагреванием до температуры тела, что происходит после введения смеси, или, если это желательно, ее можно предварительно нагреть непосредственно перед введением.

В вариантах осуществления настоящего изобретения, при которых композицию газовой дисперсии и композицию диффундирующего компонента вводят раздельно, можно использовать промежуток времени между введениями для того, чтобы воздействовать на те области тела, в которых преимущественно наблюдается рост фазы диспергированного газа. Так, например, диффундирующий компонент может инъецироваться первым и концентрироваться в печени, что позволяет получать более четкое изображение этого органа после последующей инъекции газовой дисперсии. Там, где стабильность газовой дисперсии позволяет, ее можно инъецировать первой и позволить ей сконцентрироваться в печени, после чего можно вводить диффундирующий компонент для усиления эхогенности органа.

Режимы получения изображения, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, включают методики получения двух- и трехмерного изображения, такие как В-режим получения изображения (например, с помощью изменяющейся во времени амплитуды кривой сигнала, генерированной из фундаментальной частоты испускаемого ультразвукового импульса, от субгармоник или более высоких гармоник или из суммы или разницы частот, полученных из испускаемого импульса и указанных гармоник; изображения, генерированные из фундаментальной частоты или второй гармоники предпочтительны), цветное допплеровское изображение, амплитудное допплеровское изображение и сочетание двух последних методик, с любым другим режимом из описанных выше. Для данной дозы композиций газовой дисперсии и диффундирующего компонента было показано, что использование цветного допплеровского ультразвукового изображения для индуцирования роста диспергированного газа обеспечивает более мощный контрастный эффект во время последующего использования В-режима, возможно, в результате использования более интенсивного ультразвука. Для снижения эффектов движения успешное изображение таких тканей как сердце или почка можно получать с помощью адекватной методики синхронизации (например, с привязкой к ЭКГ или дыхательным движениям пациента). Измерение изменений резонансной частоты или частоты поглощения, которые сопровождают рост диспергированного газа, также могут с пользой применяться для детектирования контрастного агента.

Следует учитывать тот факт, что диспергированный газ, входящий в состав комбинированных препаратов контрастных агентов по настоящему изобретению, будет иметь тенденцию временно задерживаться в ткани в концентрациях, пропорциональных региональной скорости тканевой перфузии. Соответственно, при использовании таких режимов получения ультразвукового изображения как обычный или гармоничный В-режим, при которых воспроизведение изображения получается непосредственно из интенсивности возвратного сигнала, изображения такой ткани можно интерпретировать как карты перфузии, на которых воспроизведенная интенсивность сигналов является функцией легальной перфузии. Иначе обстоят дела при получении изображения с помощью свободно циркулирующих контрастных агентов, при использовании которых регионарная концентрация контрастного агента и соответствующая интенсивность возвратного сигнала зависят скорее от реального содержания в крови контрастного агента, чем от скорости перфузии локальной ткани.

При исследованиях сердца, когда перфузионные карты получают от интенсивности возвратного сигнала в соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения, может быть выгодным подвергнуть пациента физическому или фармакологическому стрессу с целью усиления различия и, таким образом, разницы интенсивностей изображения между нормально перфузируемым миокардом и любыми участками миокарда, которые кровоснабжаются стенозированными артериями. Как известно, в результате получения изображения сердца с помощью радионуклидов такой стресс индуцирует вазодилатацию и повышает кровоток в здоровой ткани миокарда, в то время как кровоток в ткани с недостаточным кровоснабжением, обеспечиваемым стенозированной артерией, практически не изменяется, поскольку способность артериол расширяться уже истощена в результате ауторегуляторных процессов, с помощью которых организм пытается повысить ограниченный кровоток.

Применение стресса, такого как физическая нагрузка или фармакологическое воздействие агонистов адренергических рецепторов, может вызвать дискомфорт, такой как боли в груди, у пациентов с потенциальным заболеванием сердца, и поэтому предпочтительно усиливать перфузию здоровой ткани путем введения вазодилататора, выбранного, например, из аденозина, дипиридамола, нитроглицерина, изосорбида мононитрата, празозина, доксазозина, дигидралазина, гидралазина, нитропруссида натрия, пентоксифиллина, амелодипина, фелодипина, исрадипина, нифедипина, нимодипина, верапамила, дилтиазема и оксида азота. В случае аденозина коронарный кровоток в здоровой ткани миокарда может увеличиться четырехкратно, в большой степени увеличивая поглощение и временную задержку контрастных агентов в соответствии с настоящим изобретением, и, таким образом, значительно увеличивая разницу интенсивностей возвратных сигналов между нормальной и плохо перфузируемой тканью миокарда. Поскольку здесь участвует главным образом физический процесс захвата, задержка контрастных агентов по настоящему изобретению является высокоэффективной; ее можно сравнить с поглощением радионуклидных меток, таких как таллий 201 и технеций sestamibi, которое ограничено малым временем контакта метки и ткани, и поэтому может потребовать поддержания вазодилатации на весь период распределения метки по объему циркулирующей крови (например, 4-6 минут для сцинтиграфии с использованием таллия) для получения оптимального эффекта. Контрастные агенты по настоящему изобретению, с другой стороны, не имеют этих диффузионных или транспортных ограничений, и, поскольку их задержка в ткани миокарда может быть также быстро прекращена, например, прекращением вызывающего рост воздействия ультразвука, период вазодилатации, необходимый для получения изображения перфузии сердца в соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения, может быть очень коротким, например менее одной минуты. Это сократит продолжительность любого возможного дискомфорта, причиняемого пациентам введением вазодилататоров.

С точки зрения того факта, что требующаяся вазодилатация очень непродолжительна, аденозин является особенно полезным вазодилататором, являясь эндогенным веществом и имея очень непродолжительное действия, о чем свидетельствует его период полувыведения из кровотока, только 2 секунды. Вазодилатация, соответственно, будет наиболее интенсивной в сердце, поскольку это лекарство имеет тенденцию достигать наиболее дистальных тканей в концентрациях менее фармакологически активных. Следует учитывать тот факт, что в силу короткого периода полувыведения аденозина во время получения изображения сердца в соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения могут потребоваться повторные инъекции или инфузия аденозина; например, первоначальное введение 150 мкг/кг аденозина можно осуществлять практически одновременно с введением композиции контрастного агента, а затем через 10 секунд медленно инъецировать еще 150 мкг/кг аденозина, например, в течение 20 секунд.

Препараты контрастных агентов в соответствии с настоящим изобретением можно с успехом применять в качестве доставляющих агентов для биологически активных средств, таких как лекарственные средства (т.е. агенты, оказывающие благоприятный эффект в отношении конкретного заболевания живого человека или животного), особенно в целевые участки. Так, например, терапевтические соединения могут быть представлены в диспергированном газе, могут быть связаны с частью инкапсулирующей стенки или матрикса, например, посредством ковалентных или ионных связей, если желательно, через пространственный мостик, или могут представлять собой физическую смесь с указанным инкапсулирующим материалом или матриксом; этот последний вариант особенно применим там, где терапевтическое соединение и инкапсулирующий материал или матрикс имеют одинаковую полярность или растворимость.

Свойство диспергированного газа контролируемым образом расти может быть использовано для осуществления его временной задержки в микроциркуляторной части сосудистого русла области-мишени, представляющей интерес; применение ультразвукового воздействия для индуцирования роста и, следовательно, задержки газа и связанного с ним терапевтического соединения в структуре-мишени, особенно выгодно. Локализованная инъекция композиции газовой дисперсии или, более предпочтительно, композиции диффундирующего компонента, например, такого как описано выше, также может использоваться для концентрации роста диспергированного газа в области-мишени.

Терапевтическое соединение, которое может быть, если желательно, присоединено к сайт-специфичному вектору, обладающему аффинностью в отношении конкретных клеток, структур или патологических участков, может высвобождаться в результате, например, растяжения или разрывов инкапсулирующего материала или матрикса, которое вызывается ростом диспергированного газа, солюбилизацией инкапсулирующего материала или матрикса или дезинтеграцией микропузырьков или микрочастиц (например, индуцированной воздействием ультразвука или обратным изменением градиента концентрации диффундирующего компонента в области-мишени) В случае, когда терапевтический агент химически связан с инкапсулирующей стенкой или матриксом, эта связь или любой пространственный мостик, соединяющий их, может содержать с успехом одну или более лабильных групп, которые способны расщепляться и высвобождать указанный агент. Типичные расщепляемые группы включают амид, имид, имин, сложный эфир, ангидрид, ацеталь, карбамат, карбонат, карбонатный сложный эфир и дисульфидные группы, которые биологически расщепляются in vivo, например, в результате гидролитических и/или ферментативных процессов.

Типичные и не ограничивающие примеры лекарственных средств, пригодных в соответствии с эти вариантом осуществления настоящего изобретения, включают антинеопластические агенты, такие как винкристин, винбластин, виндезин, бусульфан, хлорамбуцил, спироплатин, цисплатин, карбоплатин, метотрексат, адриамицин, митомицин, блеомицин, цитозина арабинозид, арабинозил аденин, меркаптопурин, митотан, прокарбазин, дактиномицин (актиномицин и D), даунорубицин, доксорубицина гидрохлорид, таксол, пликамицин, аминоглутетимид, эстрамустин, флутамид, лейпролид, мегестрола ацеатат, тамоксифен, тестолактон, трилостан, амсакрин (m-AMSA), аспарагиназу (L-аспарагиназу), этопозид, интерферон а-2а и 2Ь, препараты крови, такие как гематопорфирины или их производные; модификаторы биологического ответа, такие как мирамилпептиды; противогрибковые агенты, такие как кетоконазол, нистатин, гризео-фульвин, флуцитозин, миконазол или амфотерицин В; гормоны или аналоги гормонов, такие как гормон роста, меланоцитстимули-рующий гормон, эстрадиол, беклометазона дипропионат, бетаметазон, кортизона ацетат, дексаметазон, флунизолид, гидрокортизон, метилпреднизолон, параметазона ацетат, преднизолон, преднизон, триамцинолон или флудрокортизона ацетат; витамины, такие как цианкобаламин или ретиноиды; ферменты, такие как щелочная фосфатаза или марганец-супероксиддисмутаза; противоаллергические агенты, такие как амелексанокс; антикоагулянтные агенты, такие как варфарин, фенпрокоумон или гепарин; антитромботические агенты; лекарственные средства, воздействующие на циркуляцию, такие как пропранолол; усилители обмена веществ, такие как глутатион; противотуберкулезные средства, такие как п-аминосалициловая кислота, изониазид, капреомицина сульфат, циклосексин, этамбутол, этионамид, пиразинамид, рифампин или стрептомицина сульфат; противовирусные средства, такие как ацикловир, амантадин, азидотимидин, рибавирин или видарабин; сосудорасширяющие средства, такие как дилтиазем, нифедипин, верапамил, эритритола тетранитрат, изосорбида динитрат, нитроглицерин или пентаэритритола тетранитрат; антибиотики, такие как дапсон, хлорамфеникол, неомицин, цефаклор, цефадроксил, цефалексин, цефрадин, эритромицин, клиндамицин, линкомицин, амоксициллин, ампициллин, бакампициллин, карбенициллин, диклоксациллин, циклациллин, пиклоксациллин, гетациллин, метициллин, нафциллин, пенициллин или тетрациклин; противовоспалительные средства, такие как дифлунизал, ибупрофен, индометацин, меклефенамат, мефенамовая кислота, напроксен, фенилбутазон, пироксикам, толметин, аспирин или салицилаты; антипротозойные средства, такие как хлорохин, метронидазол, хинин или меглумина антимонат; противоревматические средства, такие как пеницилламин; наркотики, такие как парегорик; опиаты, такие как кодеин, морфин или опиум; сердечные гликозиды, такие как десланезид, дигитоксин, дигоксин, дигиталин или дигиталис; блокаторы нейромышечной передачи, такие как атракуриум мезилат, галламина триэтиодид, гексафлуорений-бромид, метокурина иодид, панкуроний-бромид; сукцинилхолин-хлорид, тубокурарин-хлорид или векуроний-бромид; седативные средства, такие как амобарбитал, амобарбитал-натрий, апропбарбитал, бутабарбитал-натрий, хлоралгидрат, этхлорвинол, этинамат, флуразепам-гидрохлорид, глутетимид, метотримепразин-гидрохлорид, метиприлон, мидазолам-гидрохлорид, паральдегид, пентобарбитал, секобарбитал-натрий, талбутал, темазепам или триазолам; местные анестетики, такие как бупивакаин, хлорпрокаин, этидокаин, лидокаин, мепивакаин, прокаин или тетракаин; общие анестетики, такие как дроперидол, этомидат, фентанил-цитрат с дроперидолом, кет амин-гидрохлорид, метогекситал-натрий или тиопентал и их фармацевтически приемлемые соли (например, соли присоединения кислот, такие как гидрохлорид или гидробромид, или основные соли, такие как соли натрия, кальция или магния) или производные (например, ацетаты); а также радиоактивные химические вещества, например, включающие бета-эмиттеры. Особую важность имеют антитромботические агенты, такие как антагонисты витамина К, гепарин и агенты, обладающие гепариноподобной активностью, такие как антитромбин III, дальтепарин и эноксапарин; ингибиторы агрегации тромбоцитов, такие как тиклопидин, аспирин, дипиридамол, илопрост и абциксимаб; и тромболитические ферменты, такие как стрептокиназа и активатор плазминогена. Другие примеры лекарственных средства включают генетический материал, такой как нуклеиновые кислоты, РНК и ДНК природного или синтетического происхождения, включая рекомбинантные РНК и ДНК. ДНК, кодирующие некоторые белки, можно использовать цель лечения многих различных видов заболеваний. Например, фактор некроза опухолей или интерлейкин-2 могут обеспечиваться для лечения запущенных злокачественных опухолей; тимидинкиназа может обеспечиваться для лечения рака яичника или опухолей головного мозга; интерлейкин-2 может обеспечиваться для лечения нейробластомы, злокачественной меланомы или рака почки; и интерлейкин-2 может обеспечиваться для лечения рака.

Препараты контрастных агентов в соответствии с настоящим изобретением могут применяться как носители усиливающих контрастный эффект агентов для иных способов получения изображения, помимо ультразвука, например рентгеновских исследований, световой томографии, магнитного резонанса и, более предпочтительно, как носители агентов для сцинтиграфии. Контролируемый рост фазы диспергированного газа можно использовать для помещения указанных агентов в области тела пациента, представляющие интерес, например, с помощью воздействия ультразвуком на орган- или ткань-мишени, для индуцирования желательного контролируемого роста и временной задержки агента; затем можно получать изображение этих объектов с помощью подходящих неультразвуковых способов визуализации.

Препараты контрастных агентов в соответствии с настоящим изобретением могут также применяться как носители терапевтически активных веществ, которые не требуют обязательного высвобождения из препарата для того, чтобы оказывать лечебный эффект. Указанные препараты могут, например, инкорпорировать радиоактивные атомы или ионы, такие как бета-эмиттеры, которые обладают локализованным эмиттирующим радиацию эффектом, после того, как фаза диспергированного газа выросла и произошла временная задержка этого агента в участке-мишени. Следует учитывать тот факт, что такие агенты должны, предпочтительно, изготавливаться таким образом, чтобы последующее уменьшение размеров и прекращение задержки диспергированного газа не случалось раньше чем будет введена желательная терапевтическая доза радиоактивности.

Препараты контрастных агентов в соответствии с настоящим изобретением могут сами по себе дополнительно демонстрировать терапевтические свойства. Так, например, диспергированный газ может быть нацелен на капилляры, ведущие к опухолям, и может действовать как цитотоксический агент, блокируя такие капилляры. Таким образом, применяя локализованную энергию ультразвука, возможно создание контролируемой и локализованной эмболизации; это может иметь важное значение как само по себе, так и в сочетании с другими терапевтическими мероприятиями. Концентрации диспергированного газа в капиллярах могут также усиливать поглощение ультразвуковой энергии при гипертермической терапии; это может использоваться, например, при лечении опухолей печени. Облучение сфокусированным ультразвуковым лучом с относительно высокой энергией (например, 5W), например, с частотой 1,5 МГц может быть подходящим выбором в указанных ситуациях.

Следует учитывать тот факт, что настоящее изобретение распространяется на препараты, включающие водную среду, заключающую в себе диспергированный газ, и композицию, включающую диффундирующий компонент, в качестве основных композиций изобретения, а также на их применение для целей, не связанных с целью получения изображения.

Следующие не ограничительные примеры служат иллюстративным материалом для настоящего изобретения.

Пример 1 - Препараты a) Перфторбутановая газовая дисперсия Гидрированный фосфатидилсерин (100 мг) в 2% растворе пропиленгликоля в очищенной воде (20 мл) нагревали до 80^oС в течение 5 минут и полученную дисперсию оставляли охлаждаться до комнатной температуры в течение ночи. Порции по 1 мл переносили в 2 мл флаконы, в пространство над каждой порцией направляли струю газообразного перфторбутана, и флаконы встряхивали в течение 45 секунд с помощью мешалки Espe CapMix® для стоматологическзырьков со средним диаметром объема 5,0 мкм, по результатам измерения счетчиком Coulter (все измерения на счетчике Coulter производились при комнатной температуре с помощью инструмента, снабженного 50 мкм отверстием и имеющего измерительные пределы 1-30 мкм; в качестве электролита использовали Isoton II).

b) Дисперсия лиофилизированной перфторбутановой газовой дисперсии Образец мелочно-белой дисперсии, полученной в примере 1(а), промывали три раза путем центрифугирования и удаления инфранатанта, после чего добавляли равный объем 10% раствора сахарозы. Полученную дисперсию лиофилизировали, а затем редиспергировали в дистиллированной воде, с получением молочно-белой дисперсии микропузырьков со средним диаметром объема 3,5 мкм, по результатам измерения счетчиком Coulter.

c) 2-метилбутановая эмульсия Гидрированный фосфатидилсерин (100 мг) в очищенной воде (20 мл) нагревали до 80^oС в течение 5 минут и полученную дисперсию охлаждали до 0^oС в течение ночи. 1 мл дисперсии переносили в 2 мл флакон, в который добавляли 200 мкл 2-метилбутана (точка кипения 28^oС). Флакон затем встряхивали в течение 45 секунд с помощью мешалки CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента, которую хранили при 0^oС до использования. Средний диаметр объема капель эмульсии составлял 1,9 мкм, по результатам измерения счетчиком Coulter.

d) Перфторпентановая эмульсия
Процедуру примера 1(с) повторяли с заменой 2-метилбутана перфторпентаном (точка кипения 29^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

e) Эмульсия 2-хлор-1,1,2-трифторэтил дифторметилового эфира
Процедуру примера 1(с) повторяли с заменой 2-метилбутана 2-хлор-1,1,2-трифторэтил дифторметиловым эфиром (точка кипения 55-57^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

f) Эмульсия 2-бром-2-хлор-1,1,1-трифторэтана
Процедуру примера 1(с) повторяли с заменой 2-метилбутана 2-бром-2-хлор-1,1,1-трифторэтаном (точка кипения 49^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

g) Эмульсия 1-хлор-2,2,2-трифторэтил дифторметилового эфира
Процедуру примера 1(с) повторяли с заменой 2-метилбутана 1-хлор-2,2,2-трифторэтил дифторметиловым эфиром (точка кипения 49^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

h) Дисперсия содержащих газ частиц из полимера/сывороточного альбумина человека
Содержащие газ частицы полимера, покрытые сывороточным альбумином человека, приготовленные из этилиден бис (16- гидроксигексадеканоата) и адипоилхлорида в соответствии с примером 3(а) из публикации WO-A-9607434 (100 мг), растирали в ступе и диспергировали в 0,9% водном растворе хлорида натрия (10 мл) путем встряхивания в лабораторном шейкере в течение 24 часов.

i) Дисперсия содержащих газ частиц из полимера/желатина
Содержащие газ частицы полимера, покрытые желатином, приготовленные из этилиден бис(16-гидроксигексадеканоата) и адипоилхдорида в соответствии с примером 3(е) из публикации WO-A-9607434 (100 мг), растирали в ступе и диспергировали в 0,9% водном растворе хлорида натрия (10 мл) путем встряхивания в лабораторном шейкере в течение 24 часов.

j) 2-метилбутановая эмульсия
Процедуру примера 1(с) повторяли, за исключением того, что эмульсию разводили в 10 раз перед использованием, а до использования хранили в ледяной бане.

k) Перфторпентановая эмульсия
Процедуру примера 1(d) повторяли, за исключением того, что эмульсию разводили в 10 раз перед использованием, а до использования хранили в ледяной бане.

l) Перфторпентановая эмульсия
Гидрированный фосфатидилсерин (100 мг) в очищенной воде (20 мл) нагревали до 80^oС в течение 5 минут и полученную дисперсию охлаждали до 0^oС в течение ночи. 1 мл дисперсии переносили в 2 мл флакон, в который добавляли 100 мкл перфтор-н-пентана (точка кипения 29^oС). Флакон затем встряхивали в течение 75 секунд с помощью мешалки CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента, которую хранили при 0^oС до использования. Средний диаметр объема капель эмульсии составлял 2,9 мкм, по результатам измерения счетчиком Coulter.

m) Перфторбутановая эмульсия
Процедуру примера 1(1) повторяли с заменой перфторпентана перфторбутаном (точка кипения -2^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

n) Перфторпентановая эмульсия, приготовленная путем воздействия ультразвуком
Гидрированный фосфатидилсерин (500 мг) в очищенной воде (100 мл) нагревали до 80^oС в течение 5 минут и полученную дисперсию оставляли охлаждаться до комнатной температуры в течение ночи. 10 мл дисперсии переносили в 30 мл флакон, в который добавляли перфторпентан (1 мл). Обработка ультразвуком полученной смеси в течение 2 минут давала дисперсию диффундирующего компонента, в которой капли имели средний диаметр <1 мкм.

о) Перфторпентановая эмульсия
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что объем добавляемого перфторпентана сокращали до 60 мкл. Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

р) Перфторпентановая эмульсия
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что объем добавляемого перфторпентана сокращали до 20 мкл. Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

q) Эмульсия перфторпентан:перфтор-4-метилпент-2-ен (1:1)
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли смесью 50 мкл перфторпентана (точка кипения 29^oС) и 50 мкл перфтор-4-метилпент-2-ена (точка кипения 49^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования. Средний диаметр объема капель эмульсии составлял 2,8 мкм, по результатам измерения счетчиком Coulter.

r) Эмульсия перфторпентан:1Н,1Н,2Н-гептафторпент-1-ен (1:1)
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли смесью 50 мкл перфторпентана (точка кипения 29^oС) и 50 мкл 1Н,1Н, 2Н-гептафторпент-1-ена (точка кипения 30-31^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

s) Перфторпентановая эмульсия, стабилизированная дистеароилфосфатидилхолином:дистеароилфосфатидилсерином (1:1)
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли смесью дистеароилфосфатидилхолина (50 мг) и натриевой соли дистеароилфосфатидилсерина (50 мг). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

t) Перфторпентановая эмульсия, стабилизированная дистеароилфосфатидилхолином:дистеароилфосфатидилсерином (3:1)
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли смесью дистеароил-фосфатидилхолина (75 мг) и натриевой соли дистеароилфосфатидилсерина (25 мг). Полученную таким образом эмульсию диффун-дирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

u) Перфторпентановая эмульсия, стабилизированная дистеароилфосфатидилхолином:дистеароилфосфатидилглицерином (3:1)
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли смесью дистеароил-фосфатидилхолина (75 мг) и натриевой соли дистеароилфосфати-дилглицерина (25 мг). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

v) Перфторпентановая эмульсия, стабилизированная гидрированным фосфатидилхолином:гидрированным фосфатидилсерином (11:1)
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли смесью гидрированного фосфатидилхолина и гидрированного фосфатидилсерина (11:1). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

w) Эмульсия перфтор-4-метилпент-2-ена, стабилизированная дистеароилфосфатидилхолином:дистеароилфосфатидилсерином (3:1)
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли смесью дистеароил-фосфатидилхолина (75 мг) и натриевой соли дистеароилфосфатидилсерина (25 мг), а перфторпентан заменяли перфтор-4-метилпент-2-еном. Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

х) Эмульсия перфторпентан:перфтор-4-метилпент-2-ен (1:1), стабилизированная дистеароилфосфатидилхолином:дистеароилфосфатидилсерином (3:1)
Процедуру примера 1(w) повторяли за исключением того, что перфтор-4-метилпент-2-ен заменяли смесью 50 мкл перфторпентана и 50 мкл перфтор-4-метилпент-2-ена. Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

y) Эмульсия перфторпентан:перфтор-4-метилпент-2-ен (1:1), стабилизированная дистеароилфосфатидилхолином:дистеароилфосфатидилглицерином (3:1)
Процедуру примера 1(х) повторяли за исключением того, что натриевую соль дистеароилфосфатидилсерина заменяли натриевой солью дистеароилфосфатидилглицерина. Полученную таким образом эмульсию дифундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

z) Эмульсия перфтордекалин:перфторбутан
Гидрированный фосфатидилсерин (100 мг) в водном растворе глицерина (5,11%)/пропиленгликоля (1,5%) (20 мл) нагревали до 80^oС в течение 5 минут и полученную дисперсию охлаждали до 0^oС в течение ночи. 1 мл дисперсии переносили в 2 мл флакон, в который добавляли 100 мкл перфтордекалина (точка кипения 141-143^oС), насыщенного перфторбутаном (точка кипения -2^oС). Флакон затем встряхивали в течение 60 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии дифундирующего компонента, которую хранили при 0^oС до использования.

аа) Эмульсия перфтордекалин:перфторпропан
Процедуру примера 1(z) повторяли за исключением того, что перфтордекалин, насыщенный перфторбутаном, заменяли перфтордекалином, насыщенным перфторпропаном (точка кипения 39^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

ab) Эмульсия перфтордекалин:гексафторид серы
Процедуру примера 1(z) повторяли за исключением того, что перфтордекалин, насыщенный перфторбутаном, заменяли перфтордекалином, насыщенным гексафторидом серы (точка кипения -64^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

ac) Перфторпентановая эмульсия, стабилизированная Fluorad FC-170C
1 мл дисперсии Fluorad FC-170C (200 мг) в очищенной воде (20 мл) переносили в 2 мл флакон, в который добавляли 100 мкл перфтор-н-пентана. Флакон затем встряхивали в течение 75 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента, которую хранили при 0^oС до использования.

ad) Перфторпентановая эмульсия, стабилизированная Pluronic F68:Fluorad FC-170C
100 мкл 10% раствора Pluronic F68 добавляли к 200 мкл 1% Fluorad FC-170C и 700 мкл очищенной воды. Полученную смесь переносили в 2 мл флакон, в который добавляли 100 мкл перфтор-н-пентана. Флакон затем встряхивали в течение 75 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента, которую хранили при 0^oС до использования. Образец этой эмульсии переносили в пластиковый флакон с завинчивающейся крышкой (2,8 мл), который затем подвергали воздействию ультразвука в водяной бане в течение 2 минут (частота ультразвуковых импульсов 1 в секунду). Средний диаметр объема капель эмульсии, обработанной ультразвуком, составлял 0,99 мкм, по результатам измерения счетчиком Coulter.

ae) Перфторпентановая эмульсия, стабилизированная Pluronic F68:Fluorad FC-170C и приготовленная путем гомогенизации
1 мл 10% раствора Pluronic F68 добавляли к 2 мл 1% Fluorad FC-170C и 7 мл очищенной воды, после чего к полученной смеси добавляли 1 мл перфтор-н-пентана. Полученную дисперсию затем гомогенизировали посредством гомогенизации ротор/статор в течение 2 минут на скорости 23000 об./мин. Полученную эмульсию переносили в пластиковый флакон с завинчивающейся крышкой (10 мл), который затем подвергали воздействию ультразвука в водяной бане в течение 2 минут (частота ультразвуковых импульсов 1 в секунду).

af) Перфторпентановая эмульсия
Гидрированный фосфатидилсерин (250 мг) в очищенной воде (100 мл) нагревали до 80^oС в течение 5 минут и полученную дисперсию охлаждали до 0^oС в течение ночи. 1 мл дисперсии переносили в 2 мл флакон, в который добавляли 100 мкл перфтор-пентана. Флакон затем встряхивали в течение 75 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента, которую хранили при 0^oС до использования.

аg) Дисперсия лиофилизированной перфторбутановой газовой дисперсии.

Образец мелочно-белой дисперсии, полученной в примере 1(а), промывали три раза путем центрифугирования и удаления инфранатанта, после чего добавляли равный объем 10% раствора сахарозы. Полученную дисперсию лиофилизировали, а затем редиспергировали в дистиллированной воде, с получением мелочно-белой дисперсии микропузырьков со средним диаметром объема 2,6 мкм, по результатам измерения счетчиком Coulter.

ah) Перфторпропановая газовая дисперсия
Процедуру примера 1(а) повторяли за исключением того., что перфторбутановый газ заменяли перфторпропановым газом. Полученная молочно-белая дисперсия микропузырьков имела средний диаметр объема 2,6 мкм, по результатам измерения счетчиком Coulter.

ai) Перфторпентановая эмульсия
Гидрированный фосфатидилсерин (100 мг) в очищенной воде (100 мл) нагревали до 80^oС в течение 5 минут и полученную дисперсию охлаждали до 0^е С в течение ночи. 1 мл дисперсии переносили в 2 мл флакон, в который добавляли 100 мкл перфторпентана. Флакон затем встряхивали в течение 75 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента, которую хранили при 0^oС до использования.

aj) Перфторпентановая эмульсия, стабилизированная Brij 58:Fluorad FC-170C и приготовленная путем встряхивания
Brij 58 (400 мг) добавляли к раствору 0,1% Fluorad FC-170С (10 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. 1 мл полученного раствора переносили в 2 мл флакон, в который добавляли перфторпентан (100 мкл). Флакон затем встряхивали в течение 75 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента, которую хранили при 0^oС до использования.

ak) Перфторпентановая эмульсия, стабилизированная Brij 58:Fluorad FC-170C и приготовленная путем воздействия ультразвуком
Brij 58 (400 мг) добавляли к раствору 0,1% Fluorad FC-170C (10 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем добавляли перфторпентан (1 мл) и полученную смесь подвергали воздействию ультразвука в течение 2 минут, с получением эмульсии маленьких капель диффундирующего компонента. Эту эмульсию хранили при 0^oС до использования.

аl) Эмульсия перфтор-4-метилпент-2-ена
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли перфтор-4-метилпент-2-еном (точка кипения 49^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

am) Эмульсия 1Н, 1H, 2Н-гептафторпент-1-ена
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли 1H, 1H,2Н-гептафторпент-1-еном (точка кипения 30-31^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

an) Перфторциклопентеновая эмульсия
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли перфторциклопентеном (точка кипения 27^oC). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

ао) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли перфтордиметилциклобутаном (смесью 1,2- и 1,3-изомеров, точка кипения 45^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

ар) Эмульсия азеотропной смеси перфторгексан:н-пентан
4,71 г (0,014 моль) перфтор-н-гексана (точка кипения 59^oС) (Fluorochem Ltd. ) и 0,89 г (0,012 моль) н-пентана (точка кипения 36^oС) (Fluka AG) смешивали во флаконе с получением азеотропной смеси, легкокипящей при 35^oС. В другом флаконе гидрированный фосфатидилсерин (100 мг) в очищенной воде (20 мл) нагревали до 80^oС в течение 5 минут и полученную дисперсию охлаждали до комнатной температуры. 1 мл дисперсии фосфолипида переносили в 2 мл флакон, в который добавляли 100 мкл азеотропной смеси. Флакон затем встряхивали в течение 45 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента, которую хранили при комнатной температуре до использования.

аg) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли перфтордиметилциклобутаном (более 97% 1,1-изомера, равновесие между 1,2- и 1,3-изомерами). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

аr) Перфторгексановая эмульсия
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли перфторгексаном (точка кипения 57^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

as) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия, стабилизированная фторированным поверхностно-активным веществом
Процедуру примера 1(аg) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли или перфторированным дистеароилфосфатидилхолином (5 мг/мл) или смесью перфторированного дистеароилфосфатидилхолина и гидрированного фосфатидилсерина (3:1, общая концентрация липидов 5 мг/мл). Полученные таким образом эмульсии диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

at) Эмульсия 2,3,3,3-пентафторпропилметилового эфира
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли 2,2,3,3,3-пентафторпропилметиловым эфиром (точка кипения 4б^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

аu) Эмульсия 2Н,3Н-декафторпентана
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли 2Н, 3Н-декафторпентаном (точка кипения 54^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

av) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия, стабилизированная лизофосфатидилхолином
Процедуру примера 1(aq) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли лизофосфатидилхолином. Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

aw) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия, стабилизированная гидрированным фосфатидилсерином:лизофосфатидилхолином (1:1)
Процедуру примера 1(aq) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли смесью гидрированного фосфатидилсерина и лизофосфатидилхолина (1:1). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

ах) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия, стабилизированная поверхностно-активным веществом на основе полиэтиленгликоля 10 000
Процедуру примера 1(aq) повторяли за исключением того, что дисперсию гидрированного фосфатидилсерина заменяли раствором α-(16-гексадеканоилоксигексадеканоил)-ω-метоксиполиэтиленгликоля 10 000 в воде (10 мг/мл). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

аy) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия, стабилизированная поверхностно-активным веществом на основе полиэтиленгликоля 10 000
Процедуру примера 1(aq) повторяли за исключением того, что дисперсию гидрированного фосфатидилсерина заменяли раствором α-(16-гексадеканоилоксигексадеканоил)-ω-метоксиполиэтиленгликоля 10 000 в воде (20 мг/мл). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

az) Содержащие перфторбутан микропузырьки, инкапсулированные фосфатидилсерином и RGDC-Mal-полиэтиленгликоль 2000-дистеароилфосфатидилэтаноламином
К смеси фосфатидилсерина (4,5 мг) и Маl-полиэтиленгликоль 2000-дистеароилфосфатидилэтаноламина (0,5 мг) во флаконе добавляли раствор 1,4% пропиленгликоля/2,4% глицерина в воде (1 мл). Эту дисперсию нагревали до 80^oС в течение 5 минут, охлаждали до комнатной температуры, а затем продували струей перфторбутанового газа. Флакон затем встряхивали в течение 45 секунд с помощью CapMix®, а затем помещали на роликовый конвейер. После центрифугирования инфранатант обменивали с раствором RGDC в натриево-фосфатном буфере с рН 7,5, после чего флакон помещали на роликовый конвейер на несколько часов.

bа) Содержащие перфторбутан микропузырьки, инкапсулированные фосфатидилсерином и дипальмитоилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликолем 2000
Во флакон, содержащий фосфатидилсерин и дипальмитоилфос-фатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль 2000 (соотношение 10:1), добавляли раствор 2% пропиленгликоля в воде, с получением концентрации липидов 5 мг/мл. Эту дисперсию нагревали до 80^oС в течение 5 минут, а затем охлаждали до комнатной температуры, после чего пространство над жидкостью продували струей перфторбутанового газа. Флакон встряхивали в течение 45 секунд с помощью CapMix®, а затем помещали на роликовый конвейер. После промывания путем центрифугирования и удаления инфранатанта добавляли равный объем воды, содержащей 10% сахарозы. Полученную дисперсию лиофилизировали, а затем редиспергировали путем добавления воды, с получением молочно-белой дисперсии микропузырьков.

bb) Содержащие перфторбутан микропузырьки, инкапсулированные фосфатидилсерином и дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликолем 5000
Во флакон, содержащий фосфатидилсерин и дистеароилфосфа-тидилэтаноламин-полиэтиленгликоль 5000 (соотношение 10:1), добавляли раствор 2% пропиленгликоля в воде, с получением концентрации липидов 5 мг/мл. Эту дисперсию нагревали до 80^oС в течение 5 минут, а затем охлаждали до комнатной температуры, после чего пространство над жидкостью продували струей перфторбутанового газа. Флакон встряхивали в течение 45 секунд с помощью CapMix®, а затем помещали на роликовый конвейер. После промывания путем центрифугирования и удаления инфранатанта добавляли равный объем воды, содержащей 10% полиэтиленгдиколя. Полученную дисперсию лиофилизировали, а затем редиспергировали, с получением молочно-белой дисперсии микропузырьков.

bc) Содержащие перфторбутан микропузырьки, инкапсулированные фосфатидилсерином и дипальмитоилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликолем 2000
Во флакон, содержащий фосфатидилсерин и дипальмитоилфос-фатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль 2000 (соотношение 10:1), добавляли раствор 2% пропиленгликоля в воде, с получением концентрации липидов 5 мг/мл. Эту дисперсию нагревали до 80^oС в течение 5 минут, а затем охлаждали до комнатной температуры, после чего пространство над жидкостью продували струей перфторбутанового газа. Флакон встряхивали в течение 45 секунд с помощью CapMix®, а затем помещали на роликовый конвейер. После промывания путем центрифугирования и удаления инфранатанта добавляли равный объем воды, с получением молочно-белой дисперсии микропузырьков.

bd) Содержащие перфторбутан микропузырьки, инкапсулированные фосфатидилсерином и дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликолем 5000
Во флакон, содержащий фосфатидилсерин и дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль 5000 (соотношение 10:1), добавляли раствор 2% пропиленгликоля в воде, с получением концентрации липидов 5 мг/мл. Эту дисперсию нагревали до 80^oС в течение 5 минут, а затем охлаждали до комнатной температуры, после чего пространство над жидкостью продували струей перфторбутанового газа. Флакон встряхивали в течение 45 секунд с помощью CapMix®, а затем помещали на роликовый конвейер. После промывания путем центрифугирования и удаления инфранатанта добавляли равный объем воды, с получением молочно-белой дисперсии микропузырьков.

be) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия, стабилизированная фосфатидилсерином и дипальмитоилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликолем 2000
Процедуру примера 1(aq) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли смесью гидрированного фосфатидилсерина и дипальмитоилфосфатидилэтаноламин-полиэтиденгликоля 2000 (соотношение 10:1). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

bf) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия, стабилизированная фосфатидилсерином и дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликолем 5000
Процедуру примера 1(aq) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли смесью гидрированного фосфатидилсерина и дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоля 5000 (соотношение 10:1). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

bg) Лиофилизированные содержащие перфторбутан микропузырьки, редиспергированные в эмульсии
Образец молочно-белой дисперсии, приготовленной как описано в примере 1(bp), промывали три раза путем центрифугирования и удаления инфранатанта, после чего добавляли равный объем 10% раствора сахарозы. Полученную дисперсию лиофилизировали, а затем редиспергировали в эмульсии, приготовленной как описано в примере 1(aq), непосредственно перед использованием.

bh) Капли авидинилированной перфтордиметилциклобутановой эмульсии
Дистеароилфосфатидилсерин (4,5 мг) и биотиндипальмитоилфосфатидилэтаноламин (0,5 мг) взвешивали и помещали в чистый флакон, а затем добавляли 1,0 мл раствора 2% пропиленгликоля, После нагревания до 80^oС смесь охлаждали до комнатной температуры. Добавляли 100 мкл перфтордиметилциклобутана и флакон встряхивали в течение 75 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента. Разбавленный образец этой эмульсии (100 мкл эмульсии в 1 мл воды) инкубировали с избытком авидина и помещали на роликовый конвейер. Разбавленную эмульсию затем хорошо промывали водой и концентрировали центрифугированием.

bi) Эмульсия lH-тридекафторгексана
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли lH-тридекафторгексаном (точка кипения 71^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

bj) Перфторгептановая эмульсия
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли перфторгептаном (точка кипения 80-85^oС). Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

bk) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия с фосфатидил-серином и флюоресцентным стрептавидином
Дистеароилфосфатидилсерин (4,5 мг) и биотиндипальмитоилфосфатидилэтаноламин (0,5 мг) взвешивали и помещали в чистый флакон, а затем добавляли 1,0 мл раствора 2% пропиленгликоля. После нагревания до 80^oС смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 100 мкл перфтордиметилциклобутана и флакон встряхивали в течение 75 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента. Разбавленный образец этой эмульсии (100 мкл эмульсии в 1 мл воды) инкубировали с избытком флюоресцентного стрептавидина в фосфатном буфере и помещали на роликовый конвейер. Разбавленную эмульсию затем хорошо промывали водой и концентрировали центрифугированием.

bl) Дисперсия лиофилизированной перфторбутановой газовой дисперсии
Образец молочно-белой дисперсии, приготовленной как описано в примере 1(а), перемывали три раза путем центрифугирования и удаления инфранатанта, после чего добавляли равный объем 10% раствора сахарозы. Полученную дисперсию лиофилизировали, а затем редиспергировали в дистиллированной воде непосредственно перед использованием.

bm) Перфтордиметилциклобутановая эмульсия, стабилизированная стерилизованным фосфатидилсерином
Процедуру примера 1(aq) повторяли за исключением того, что гидрированный фосфатидилсерин заменяли стерилизованным раствором гидрированного фосфатидилсерина. Полученную таким образом эмульсию диффундирующего компонента хранили при 0^oС до использования.

bn) Перфторпропановая газовая дисперсия
Процедуру примера 1(1) повторяли за исключением того, что перфторпентан заменяли перфторпропановым газом.

bo) Диспергированный Echovist
Гранулят Echovist (Shering AG) (0,25 г) диспергировали в эмульсии, приготовленной как описано в примере 1(aq).

bp) Перфторбутановая газовая дисперсия
Гидрированный фосфатидилсерин (500 мг) добавляли к раствору 1,5% пропиленгликоля/5,11% глицерина в воде (100 мл) и нагревали до 80^oС в течение 5 минут, после чего оставляли охлаждаться до комнатной температуры. 1 мл порции переносили в 2 мл флаконы, пространство над каждой порцией продували струей перфторбутанового газа, и флаконы встряхивали в течение 45 секунд с помощью CapMix®, после чего флаконы помещали на роликовый конвейер.

bq) Препарат биотинилированных перфторбутановых микропузырьков
Дистеароилфосфатидилсерин (4,5 мг) и биотиндипальмитоилфосфатидилэтаноламин (0,5 мг) взвешивали и помещали в чистый флакон, а затем добавляли 1,0 мл раствора 1,4% пропиленгликоля/2,4% глицерина. После нагревания до 78^oС смесь охлаждали до комнатной температуры и пространство над смесью продували струей перфторбутанового газа. Флакон встряхивали в течение 45 секунд с помощью CapMix®, после чего флаконы помещали на роликовый конвейер на 16 часов. Полученные микропузырьки хорошо промывали деионизированной водой.

br) Аэрогели
К пиролизированным по типу "кромка шпателя" резорцинформальдегидным аэрогелевым частицам (поставляемым Dr. Pekala, Lawrence Livermore National Laboratory) добавляли 300 мкл воды, каплю рН 9 буфера и 5-10 капель 1% Pluronic F68. Аэрогелевые частицы быстро оседали, но не агрегировали.

bs) Малые пузырьки
Резиновую трубку с внутренним диаметром 8 мм и приблизительно 20 см длиной помещали в вертикальном положении на стенд при закрытой донной части и наполняли дисперсией микропузырьков, приготовленной в соответствии с примером 1(а) (за исключением того, что для приготовления дисперсии микропузырьков применяли роторно/статорный гомогенизатор Ystral®). Спустя два часа ближе к дну резиновой трубки вводили шприц, соединенный с канюлей, и собирали 1 мл фракции фракционированной по размеру дисперсии микропузырьков. Анализ с помощью счетчика Coulter показал, что средний диаметр микропузырьков полученной таким образом дисперсии составлял 1,2 мкм.

bt) Перфторбутановая газовая дисперсия, стабилизированная 5% альбумином: 5% декстрозой (1:3)
20% сыворотку крови человека разбавляли до 5% очищенной водой. 5 мл образца разбавленного альбумина далее разводили 5% глюкозой (15 мл) и полученную смесь переносили во флакон. Пространство над смесью продували струей перфторбутанового газа и флакон обрабатывали ультразвуком в течение 80 секунд, с получением молочно-белой дисперсии микропузырьков.

bu) Дисперсия BuckminsterfuIIerene С₆₀
Buckminsterfullerene Сбо добавляли к 2,5% сывороточному альбумину человека (1 мл) в 2 мл флакон, который встряхивали в течение 75 секунд с помощью CapMix®.
bv) Газовая дисперсия гексафторида серы
Были приготовлены микропузырьки, стабилизированные дистеароилфосфатидилхолином: дипальмитоилфосфатидилглицерином (10:1), как описано в примере 5 в публикации WO-A-9409829. Так, 50 мг дистеароилфосфатидилхолина, 5 мг дипальмитоилфосфатидилглицерина и 2,2 г полиэтиленгликоля 4000 растворяли в 22 мл т-бутанола при 60^oС, и этот раствор быстро охлаждали до -77^oС и лиофилизировали в течение ночи. 100 мг полученного порошка помещали во флакон, пространство над раствором удаляли, а затем наполняли его гексафторидом серы. 1 мл очищенной воды добавляли непосредственно перед использованием, с получением дисперсии микропузырьков.

bw) 2-метилбутановая эмульсия
Гидрированный фосфатидилсерин (100 мг) в очищенной воде (20 мл) нагревали до 80^oС в течение 5 минут и полученную дисперсию охлаждали до 0^oС в холодильнике в течение ночи. 1 мл дисперсии переносили в 2 мл флакон, в который добавляли 100 мкл 2-метилбутана. Флакон затем встряхивали в течение 75 секунд с помощью CapMix®, с получением эмульсии диффундирующего компонента, которую хранили при 0^oС до использования.

bx) Лиофилизированная перфторбутановая газовая дисперсия в водном растворе бикарбоната натрия
Образец молочно-белой дисперсии, полученной в примере 1(а), промывали три раза путем центрифугирования и удаления инфранатанта, после чего добавляли равный объем 10% раствора сахарозы. Полученную дисперсию лиофилизировали, а затем pедиспергировали в 0,1 М растворе бикарбоната натрия.

by) Перфторбутановая газовая дисперсия
Перфторбутановая газовая дисперсия была приготовлена, как описано в примере 1(а). Эту дисперсию промывали три раза очищенной водой путем центрифугирования и удаления инфранатанта, с получением молочно-белой дисперсии микропузырьков.

bz) Перфторбутановая газовая дисперсия с частицами оксида железа
К 1 мл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной как описано в примере 1(by), добавляли 1 мл очищенной воды. рН поднимали до 11,2 гидроксидом аммония и дисперсию нагревали до 60^oС в течение 5 минут. Добавляли частицы оксида железа без покрытия (0,3 мл, 4,8 мг Fe/мл) и дисперсию оттаивали в течение 5 мин. рН снижали до 5,9 хлористоводородной кислотой, с получением коричневой дисперсии, которая через незначительный промежуток времени отделяла поверхностный слой, содержащий коричневые частицы, от прозрачного неокрашенного инфранатанта и не давала осадка.

ca) Перфторбутановая газовая дисперсия с частицами оксида железа
К 1 мл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной как описано в примере 1(by), добавляли частицы оксида железа без покрытия (0,3 мл, 4,8 мг Fe/мл) при рН 7, с получением коричневой дисперсии, которая при отстаивании отделяла поверхностный слой, содержащий коричневые микропузырьки, от прозрачного инфранатанта и не давала осадка.

cb) (сравнительный)
К 1 мл раствора гидрированного фосфатидилсерина в очищенной воде (5 мг/мл) добавляли частицы оксида железа без покрытия (0,3 мл, 4,8 мг Fe/мл) при рН 7, с получением коричневой дисперсии, которая при отстаивании давала коричневый осадок.

cc) Перфторбутановая газовая дисперсия с частицами оксида железа, покрытыми олеиновой кислотой
1,3 ммоль FeCl₂ 4H₂O (0,259 г) и 2,6 ммоль FеСl₃ 6Н₂О (0,703 г) растворяли в 10 мл очищенной воды и добавляли 1,5 мл гидроксида аммония. Полученные частицы оксида железа промывали пять раз очищенной водой (25 мл). К частицам добавляли разбавленный гидроксид аммония и эту суспензию нагревали до 80^oС. Добавляли олеиновую кислоту (0,15 г) и эту дисперсию оставляли стоять в течение 5 минут при комнатной температуре. Добавляли очищенную воду (10 мл) и рН понижали до 5,4 хлористоводородной кислотой. Эту дисперсию обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут, после чего инфранатант удаляли и частицы суспендировали в 2-метилбутане (5 мл), с получением тонкой черной дисперсии.

25 мг дистеароилфосфатидилхолина и 2,5 мг димиристоилфосфатидилглицерина растворяли в 11 мл т-бутанола при 60^oС и добавляли 0,1 мл частиц оксида железа, полученных, как описано выше, вместе с 1,1 г полиэтиленгликоля 4000. Эту дисперсию нагревали в течение 10 минут до 60^oС, быстро охлаждали до -77^oС и лиофилизировали. 100 мг лиофилизата помещали во 2 мл флакон, пространство над ним удаляли и дважды продували перфторбутановым газом. Затем лиофилизат диспергировали в 1 мл очищенной воды и дважды промывали очищенной водой путем центрифугирования с удалением инфранатанта и осадка. После отстаивания полученная дисперсия давала светло-серый плавающий на поверхности слой.

Пример 2 - Описание роста микропузырьков in vitro по результатам микроскопии и визуального наблюдения
а) Одну каплю перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), при температуре около 4^oС разбавляли одной каплей перенасыщенной воздухом очищенной воды при температуре около 4^oС на предметном стекле микроскопа, охлажденном до температуры приблизительно 4^oС и исследовали при увеличении в 400 раз. Наблюдали варьирование размеров пузырьков от 2 до 5 мкм. Затем температуру повышали приблизительно до 40^oС, после чего наблюдали значительное увеличение размеров микропузырьков, причем самые большие микропузырьки вырастали больше других. Количество микропузырьков значительно сокращалось по истечении приблизительно 5 минут.

b) (сравнительный)
Одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(с), охлаждали в ледяной бане до температуры приблизительно 0^oС, помещали на предметное стекло микроскопа, охлажденное до температуры приблизительно 0^oС и исследовали при увеличении в 400 раз. Наблюдали варьирование размеров капель масляной фазы эмульсии от 2 до 6 мкм. Затем температуру повышали приблизительно до 40^oС. Образования микропузырьков не наблюдалось.

c) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а) (0,5 мл), разбавляли очищенной водой (50 мл) и охлаждали до 0^oС. Часть этой разбавленной дисперсии (1 мл) смешивали с частью 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(с) (100 мкл). Одну каплю полученной смеси помещали на предметное стекло микроскопа, температура которого поддерживалась на уровне 0^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением, и закрывали покровным стеклом, также с температурой 0^oС. Температуру предметного стекла постепенно повышали до 40^oС c помощью подставки с подогревом/охлаждением. Быстрый и значительный рост микропузырьков наблюдали под микроскопом и подтверждали измерениями размера и распределения с помощью аппарата Malvern Mastersizer.

d) (сравнительный) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а) (0,5 мл), разбавляли очищенной водой (50 мл) и охлаждали в ледяной бане до 0^oС. Часть этой разбавленной дисперсии (1 мл) смешивали со 100 мкл дисперсии гидрированного фосфатидилсерина в очищенной воде с концентрацией 5 мг/мл, также при 0^oС. Одну каплю полученной смеси помещали на предметное стекло микроскопа, охлажденное до 0^oС, и исследовали при увеличении в 400 раз. Наблюдали варьирование размеров микропузырьков от 2 до 5 мкм. Температуру затем повышали приблизительно до 40^oС, после чего наблюдали значительное увеличение размеров микропузырьков, хотя это увеличение было менее значительным и более медленным по сравнению с тем, которое наблюдалось в примере 2(с).

e) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), разбавляли очищенной водой (1:1) и охлаждали до 0^oС. Каплю эмульсии 2-хлор-1,1,2-трифторэтил дифторметилового эфира, полученной в примере 1(е), добавляли к разбавленной дисперсии микропузырьков на предметном стекле микроскопа, температура которого поддерживалась на уровне 0^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением, и закрывали покровным стеклом, также с температурой 0^oС. Температуру предметного стекла постепенно повышали до 40^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Под микроскопом наблюдали быстрый и значительный рост микропузырьков.

f) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), разбавляли очищенной водой (1:1) и охлаждали до 0^oС. Каплю эмульсии 2-бром-2-хлор-1,1,1-трифторэтана, полученной в примере 1(f), добавляли к разбавленной дисперсии микропузырьков на предметном стекле микроскопа, температура которого поддерживалась на уровне 0^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением, и закрывали покровным стеклом, также с температурой 0^oС. Температуру предметного стекла постепенно повышали до 40^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Под микроскопом наблюдали быстрый и значительный рост микропузырьков.

g) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), разбавляли очищенной водой (1:1) и охлаждали до 0^oС. Каплю эмульсии 1-хлор-2,2,2-трифторэтил дифторметилового эфира, полученной в примере 1(g), добавляли к разбавленной дисперсии микропузырьков на предметном стекле микроскопа, температура которого поддерживалась на уровне 0^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением, и закрывали покровным стеклом, также с температурой 0^oС. Температуру предметного стекла постепенно повышали до 40^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Под микроскопом наблюдали быстрый и значительный рост микропузырьков.

h) Одну каплю дисперсии микрочастиц из полимера/сывороточного альбумина человека, полученной в примере 1(h), и одну каплю перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(h), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 50^oС, и исследовали при увеличении в 400 раз. После смешивания капель наблюдали значительный рост микропузырьков.

i) Одну каплю дисперсии микрочастиц из полимера/сывороточного альбумина человека, полученной в примере 1(h), и одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(j), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 40^oС, и исследовали при увеличении в 400 раз. После смешивания капель наблюдали значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

j) Одну каплю дисперсии микрочастиц из полимера/желатина, полученной в примере 1(i), и одну каплю перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(k), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 50^oС, и исследовали при увеличении в 400 раз. После смешивания капель наблюдали значительный рост микропузырьков.

k) Одну каплю дисперсии микрочастиц из полимера/желатина, полученной в примере 1(i), и одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере l(j), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 40^oС, и исследовали при увеличении в 400 раз. После смешивания капель наблюдали значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

l) (сравнительный) Одну каплю перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(k), помещали на предметное стекло микроскрпа, подогретое до 50^oС, и исследовали при увеличении в 400 раз. Образования микропузырьков не наблюдалось.

m) (сравнительный) Одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(j), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 40^oС, и исследовали при увеличении в 400 раз. Образования микропузырьков не наблюдалось.

n) (сравнительный) Одну каплю дисперсии микрочастиц из полимера/сывороточного альбумина человека, полученной в примере 1(h), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 40^oС, и исследовали при увеличении в 400 раз. Значительных изменений не наблюдалось.

о) (сравнительный) Одну каплю дисперсии микрочастиц из полимера/желатина, полученной в примере 1(1), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 50^oС, и исследовали при увеличении в 400 раз. Значительных изменений не наблюдалось.

p) Одну каплю дисперсии микропузырьков воздуха, стабилизированных сывороточным альбумином человека, полученной как описано в патенте US-A-4718433, и одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(j), помещали на предметное стекло микроскопа при 20^oС и исследовали при увеличении в 400 раз. После смешивания капель наблюдали значительный рост микропузырьков.

q) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), разбавляли очищенной водой (1:1) и охлаждали до 0^oС. Каплю эмульсии перфтордекалин/перфторбутан, полученной в примере 1(z), добавляли к разбавленной дисперсии микропузырьков на предметном стекле микроскопа, температура которого поддерживалась на уровне 0^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением, и закрывали покровным стеклом, также с температурой 0^oС. Температуру предметного стекла постепенно повышали до 40^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Под микроскопом наблюдали быстрый и значительный рост микропузырьков.

r) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), разбавляли очищенной водой (1:1) и охлаждали до 0^oС. Каплю эмульсии перфтордекалин/перфторпропан/ полученной в примере 1(аа), добавляли к разбавленной дисперсии микропузырьков на предметном стекле микроскопа, температура которого поддерживалась на уровне 0^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением, и закрывали покровным стеклом, также с температурой 0^oС. Температуру предметного стекла постепенно повышали до 40^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Под микроскопом наблюдали быстрый и значительный рост микропузырьков.

s) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), разбавляли очищенной водой (1:1) и охлаждали до 0^oС. Каплю эмульсии перфтордекалин/гексафторид серы, полученной в примере 1(ab), добавляли к разбавленной дисперсии микропузырьков на предметном стекле микроскопа, температура которого поддерживалась на уровне 0^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением, и закрывали покровным стеклом, также с температурой 0^oС. Температуру предметного стекла постепенно повышали до 40^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением, после чего через 4-5 минут наблюдали увеличение размеров микропузырьков, хотя это увеличение было менее бурным и менее быстрым, по сравнению с увеличением, которое наблюдалось в примерах 2(q) и 2(r).

t) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), разбавляли очищенной водой (1:1) и охлаждали до 0^oС. Каплю перфторпентановой эмульсии, стабилизированной Pluronic F68, полученной в примере 1(ad), добавляли к разбавленной дисперсии микропузырьков на предметном стекле микроскопа, температура которого поддерживалась на уровне 0^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением, и закрывали покровным стеклом, также с температурой 0^oС. Температуру предметного стекла постепенно повышали до 40^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Под микроскопом наблюдали быстрый и значительный рост микропузырьков.

u) Одну каплю перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), и одну каплю перфторпентановой эмульсии, стабилизированной Brij58: Fluorad FC-170C, полученной в примере 1(aj), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 40^oС и исследовали под микроскопом при увеличении в 400 раз. Спустя незначительное время наблюдали медленный рост микропузырьков.

v) Одну каплю перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), и одну каплю перфторпентановой эмульсии, стабилизированной Brij58:Fluorad FC-170C, полученной в примере 1(ak), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 40^oС и исследовали под микроскопом при увеличении в 400 раз. Спустя незначительное время наблюдали рост микропузырьков.

w) Одну каплю перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), и одну каплю эмульсии перфтор-4-метилпент-2-ена, полученной в примере 1(а1), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 40^oС и исследовали под микроскопом при увеличения в 400 раз. Спустя незначительное время наблюдали медленный рост микропузырьков.

х) Одну каплю перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), и одну каплю эмульсии 1Н,1Н,2Н-гептафторпент-1-ена, полученной в примере 1(am), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 40^oС и исследовали под микроскопом при увеличении в 400 раз. После смешивания капель наблюдали значительный и быстрый рост микропузырьков.

y) Одну каплю перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а), и одну каплю перфторциклопентеновой эмульсии, полученной в примере 1(an), помещали на предметное стекло микроскопа, подогретое до 40^oС и исследовали под микроскопом при увеличении в 400 раз. После смешивания капель наблюдали значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

z) 400 мкл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(b), переносили в 2 мл флакон при комнатной температуре и добавляли 100 мкл азеотропной эмульсии, полученной в примере 1(ар). Одну каплю смеси микропузырьков и эмульсии помещали на предметное стекло микроскопа, температура которого поддерживалась на уровне 20^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Температуру предметного стекла быстро повышали до 37^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Под микроскопом наблюдали значительный, спонтанный и быстрый рост микропузырьков.

aa) Одну каплю биотинилированных микропузырьков, полученных в примере 1(bq), добавляли к одной капле эмульсии, приготовленной как описано в примере 1(bh), на предметном стекле микроскопа, подогретом до 60^oС и исследовали под микроскопом при увеличении в 400 раз. Наблюдали значительный рост микропузырьков и аккумуляцию микропузырьков на агрегированных каплях эмульсии.

ab) Микропузырьки, приготовленные как описано в примере 1(bq), могут быть исследованы с помощью проточной цитометрии, например, с применением флюоресцентной эмульсии стрептавидина, приготовленной как описано в примере 1(bk), для определения присоединения стрептавидина к биотинилированным микропузырькам.

ac) Одну каплю дисперсии Echovist, полученной в примере 1(bo), помещали на предметное стекло для исследования под микроскопом, и поддерживали температуру 37^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Образец закрывали покровным стеклом и помещали под микроскоп. Наблюдали значительный рост пузырьков.

ad) Одну каплю аэрогелевой дисперсии, полученной в примере 1(br), помещали на предметное стекло для исследования под микроскопом, и поддерживали температуру 37^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Образец закрывали покровным стеклом и помещали под микроскоп. Каплю 2-метилбутановой эмульсии (из примера 1(с), выше, за исключением того, что вместо 200 мкл 2-метилбутана использовали 100 мкл) добавляли на край покровного стекла таким образом, чтобы эмульсия проникала внутрь аэрогелевой дисперсии. После повышения температуры до приблизительно 60^oС из аэрогелевых частиц появлялись микропузырьки.

ae) (сравнительный) Одну каплю аэрогелевой дисперсии, полученной в примере 1(br), помещали на предметное стекло для исследования под микроскопом, и поддерживали температуру 20^oС с помощью подставки с подогревом/охлаждением. Образец закрывали покровным стеклом и помещали под микроскоп, а температуру повышали до 60^oС. Роста микропузырьков не наблюдалось.

af) Одну каплю дисперсии микропузырьков, полученной в примере 1(bs), помещали на предметное стекло для исследования под микроскопом. Образец закрывали покровным стеклом и помещали под микроскоп, соединенный с подставкой с подогревом/охлаждением, с помощью которой поддерживали температуру образца 20^oС. Одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(с), выше, добавляли на край покровного стекла таким образом, чтобы эмульсия проникала внутрь дисперсии микропузырьков. На стадии смешивания роста микропузырьков не наблюдалось. После повышения температуры до 40^oС наблюдался значительный рост микропузырьков.

аg) (сравнительный) Одну каплю дисперсии микропузырьков, полученной в примере 1(bs), помещали на предметное стекло для исследования под микроскопом. Образец закрывали покровным стеклом и помещали под микроскоп, соединенный с подставкой с подогревом/охлаждением, с помощью которой поддерживали температуру образца 20^oС. После повышения температуры до 40^oС роста микропузырьков не наблюдалось.

ah) К грануляту Echovist (Shering AG) на предметном стекле микроскопа добавляли одну каплю растворителя для гранулята Echovist при комнатной температуре. Добавляли одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной из примера 1(bw), и исследовали под микроскопом при увеличении в 100 раз. После смешивания капель наблюдался значительный рост микропузырьков.

ai) Одну каплю Levovist®, приготовленную для инъекции, и одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной из примера 1(bw), помещали на предметное стекло при комнатной температуре и исследовали под микроскопом при увеличении в 400 раз. После смешивания капель наблюдался значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

aj) Одну каплю перфторбутановой газовой дисперсии, полученной из примера 1(br), и одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной из примера 1(bw), помещали на предметное стекло при комнатной температуре и исследовали под микроскопом при увеличении в 400 раз. После смешивания капель наблюдался значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

ak) Одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной из примера 1(by), добавляли к одной капле дисперсии Buckminster-fullerene Сео, полученной из примера 1(bu), на предметном стекле микроскопа при температуре 40^oС. После смешивания капель наблюдался значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

аl) Одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной из примера 1(bw), добавляли к одной капле газовой дисперсии гексафторида серы, полученной из примера 1(bv), на предметном стекле микроскопа при температуре 40^oС. После смешивания капель наблюдался значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

am) Одну каплю 0,5 М хлористоводородной кислоты добавляли к одной капле перфторбутановой газовой дисперсии в водном растворе бикарбоната натрия, полученной из примера 1(bx), на предметном стекле микроскопа при комнатной температуре. После смешивания капель наблюдался быстрый и бурный рост микропузырьков с короткой продолжительностью существования.

an) Одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной из примера 1(bw), добавляли к одной капле перфторбутановой газовой дисперсии с частицами оксида железа, полученной из примера 1(bz), на предметном стекле микроскопа при комнатной температуре. После смешивания капель наблюдался значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

ао) Одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной из примера 1(bw), добавляли к одной капле перфторбутановой газовой дисперсии с частицами оксида железа, полученной из примера 1(са), на предметном стекле микроскопа при комнатной температуре. После смешивания капель наблюдался значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

ар) (сравнительный) Одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной из примера 1(bw), добавляли к одной капле дисперсии частиц оксида железа, полученной из примера 1(cb), на предметном стекле микроскопа при комнатной температуре. Образования микропузырьков не наблюдалось.

аq) Одну каплю 2-метилбутановой эмульсии, полученной из примера 1(bw), добавляли к одной капле перфторбутановой газовой дисперсии с частицами оксида железа с покрытием из олеиновой кислоты, полученной из примера 1(сс), на предметном стекле микроскопа при комнатной температуре. После смешивания капель наблюдался значительный, быстрый и бурный рост микропузырьков.

аr) 1 мл дисперсии микропузырьков, полученной из примера 1(bp), разбавляли 50 мл воды. Одну каплю разбавленной дисперсии добавляли к одной капле воды, насыщенной углекислым газом, на предметном стекле микроскопа при комнатной температуре. После смешивания капель наблюдался спонтанный рост микропузырьков.

as) 0,4 мкл дисперсии биотинилированных микропузырьков, полученной в соответствии с примером 1(bq), и 0,02 мл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной как описано в примере 1(bh), последовательно добавляли в химический стакан, содержавший 200 мл Isoton при 37^oС при постоянном перемешивании. Эту смесь инкубировали в течение 20 секунд. Луч импульсного ультразвука (10 кГц повторная частота, 100 мкДж в каждом импульсе) на частоте 2,5 МГц направляли через раствор, который наблюдали в резком боковом свете на черном фоне. Яркая полоса более крупных пузырьков немедленно наблюдалась в пятне луча.

at) Одну каплю дисперсии микропузырьков, полученной в примере 1(bl), помещали на предметное стекло для исследования под микроскопом. Образец закрывали покровным стеклом и помещали под микроскоп, соединенный с подставкой с подогревом/охлаждением, с помощью которой поддерживали температуру 20^oС. Одну каплю перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной в примере 1(as), добавляли на край покровного стекла таким образом, чтобы эмульсия могла проникать внутрь дисперсии микропузырьков. При повышении температуры приблизительно до 60^oС наблюдался значительный рост микропузырьков.

Призер 3 - Описание размеров и распределения микропузырьков in vitro
а) Измерения с помощью аппарата Malvern Mastersizer
Рост микропузырьков и изменение их распределения по размерам после смешивания с диффундирующим компонентом анализировали с помощью аппарата Malvern Mastersizer 1002, снабженного 45 мм линзой и имеющего диапазон измерения 0,1-80 мкм. Ячейка для образцов содержала Isoton II (150 мл) и была соединена с баней-термостатом с диапазоном действия в пределах температур от 9 до 37^oС. Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(а) (110 мкл), добавляли в ячейку для образцов и после уравновешивания добавляли часть 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(с) (500 мкл). Раствор Isoton II прокачивали через Mastersizer и баню-термостат таким образом, чтобы образец проходил через измерительную ячейку каждые 30 секунд. Повторные измерения осуществляли каждые 30 секунд в течение 3 минут. Температуру раствора Isoton II постепенно повышали и производили дальнейшие измерения. Перфторбутановую газовую дисперсию и 2-метилбутановую эмульсию также анализировали по отдельности при тех же условиях.

Анализ отдельно перфторбутановой газовой дисперсии показал, что при 9^oС 82% микропузырьков имели размер менее 9,9 мкм; эта доля сокращалась до 31% при повышении температуры до 37^oС. Это изменение температуры сопровождалось соответствующим увеличением доли микропузырьков с размером 15-80 мкм, с 8% до 42%.

После смешивания перфторбутановой газовой дисперсии и 2-метилбутановой эмульсии при 9^oС наблюдалось незначительное увеличение размеров микропузырьков. Повышение температуры до 25^oС приводило к выраженному росту микропузырьков; при этом около 81% микропузырьков имели размеры в пределах 15-80 мкм. Дальнейшее повышение температуры приводило к росту микропузырьков до размеров, превышавших пределы измерения.

Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии и 2-метилбутановой эмульсии при 37^oС приводило к быстрому росту микропузырьков; после одного 30-секундного цикла измерения 97% микропузырьков имели размеры в пределах 15-80 мкм.

b) Измерения с помощью аппарата Coulter Multisizer
Рост микропузырьков и изменение их распределения по размерам после смешивания с диффундирующим компонентом анализировали с помощью аппарата Coulter Multisizer II, снабженного 50 мкм отверстием и имеющего диапазон измерения 1-30 мкм. Два компонента каждого образца добавляли в ячейку для образцов, которая содержала 200 мл Isoton II, предварительного нагретого до 37^oС, при этой температуре производились измерения. Распределение смеси по размерам измерялось немедленно и через 1,5 минуты после введения образцов в аппарат. После этого ячейку для образцов подвергали воздействию ультразвука в течение 1 минуты с помощью преобразователя с частотой 2,25 МГц, соединенного с импульсным генератором; уровень энергии составлял 100 мкДж.

b)(i) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(1), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла с 3% до приблизительно 16%.

b)(ii) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и перфторбутановой эмульсии, полученной в примере 1(m), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков. Общая объемная концентрация возросла с 1% до приблизительно 6%.

b) (iii) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(р), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла приблизительно с 1% до приблизительно 4%.

b)(iv) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(af), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла приблизительно с 2% до приблизительно 8%.

b)(v) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примера 1(ag), и эмульсии перфторпентан/перфтор-4-метилпент-2-ен, полученной в примере 1(q), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла с 2% до приблизительно 4%.

b)(vi) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и эмульсии перфторпентан/1H,1Н,2Н-гепатфторпент-1-ен, полученной в примере 1(г), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков. Общая объемная концентрация возросла с 2% до приблизительно 4,5%.

b)(vii) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(аg), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(s), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла с 2% до приблизительно 13%.

b)(viii) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(аg), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(t), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла с 2% до приблизительно 13%.

b)(ix) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(аg), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(u), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла с 3% до приблизительно 15%.

b)(x) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(v), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла с 3% до приблизительно 22%.

b)(xi) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(ai), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла приблизительно с 3% до приблизительно 8%.

b)(xii) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и эмульсии перфторпентан:перфтор-4-метилпент-2-ен, полученной в примере 1(х), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла с 2% до приблизительно 7,5%.

b)(xiii) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и эмульсии перфторпентан:перфтор-4-метилпент-2-ен, полученной в примере 1(у), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла с 2,5% до приблизительно 7%.

b)(xiv) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(ас), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков. Увеличение размеров микропузырьков было более выраженным и быстрым по сравнению с увеличением, которое наблюдалось в примере 3(b)(xv). Общая объемная концентрация возросла с 3,5% до приблизительно 53%.

b)(xv) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(ае), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков. Общая объемная концентрация возросла с 7% до приблизительно 19%. После воздействия ультразвука происходил дальнейший рост микропузырьков, который выразился в увеличении общей объемной концентрации приблизительно до 54,5%.

b)(xvi) Смешивание перфторпропановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ah), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(1), приводило к быстрому росту микропузырьков, хотя и не настолько выраженному, как в примере 3(b)(i). Общая объемная концентрация возросла с 3% до приблизительно 4,5%.

b)(xvii) Смешивание перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в примере 1(ag), и перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(о), приводило к быстрому и значительному росту микропузырьков после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация возросла с приблизительно 1% до приблизительно 8%.

b)(xviii) Образец перфторгексановой эмульсии, полученной как описано в примере 1(аг), имел общую концентрацию капель 8,6 об.%, а размер капель составлял 2,6 мкм.

b)(xix) Образец эмульсии 2,2,3,3,3-пентафторпропилметилового эфира, полученной как описано в примере 1(at), имел общую концентрацию капель 4,3 об.%, а размер капель составлял 1,5 мкм.

b)(хх) Образец эмульсии 2Н,3Н-декафторпентана, полученной как описано в примере 1(au), имел общую концентрацию капель 5,6 об.%, а размер капель составлял 1,9 мкм.

b)(xxi) Образец перфторгептановой эмульсии, полученной как описано в примере 1(bj), имел общую концентрацию капель 8,5 об.%, а размер капель составлял 2,2 мкм.

c) Измерение с помощью аппарата Coulter Multisizer (отверстие 140 мкм).

Рост микропузырьков и изменение их распределения по размерам после смешивания с эмульсиями диффундирующего компонента анализировали с помощью аппарата Coulter Multisizer II, снабженного 140 мкм отверстием. Диапазон измерения составлял 10-80 мкм. Дисперсию пузырьков и капли эмульсии добавляли в ячейку для образцов, которая содержала 200 мл предварительно нагретого Isoton II. Измерения производились при 37^oС. Распределение смеси по размерам измерялось немедленно и через 3 минуты после смешивания. После этого образец раствора подвергали воздействию ультразвука в течение 1 минуты с помощью преобразователя с частотой 2,25 МГц, соединенного с импульсным генератором. Уровень энергии составлял 100 мкДж. Распределение смеси по размерам измерялось через 1 и 3 минуты после воздействию ультразвука.

с(i) После добавления 182 мкл эмульсии гептафторпент-1-ена, полученной как описано в примере 1(аm), к 400 мкл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной как описано в примере 1(bl), микропузырьки немедленно увеличивались в размерах и общая объемная концентрация в диапазоне размеров 10-80 мкм возрастала от незначительной до приблизительно 60 об.% в течение 1 минуты.

с(ii) После добавления 70 мкл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной, как описано в примере 1(av), к 330 мкл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной как, описано в примере 1(bl), микропузырьки значительно увеличивались в размерах после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация в диапазоне размеров 10-80 мкм возрастала от незначительной до приблизительно 14 об.% в течение 3 минут.

с)(iii) После добавления 71 мкл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной, как описано в примере 1(aw), к 330 мкл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной, как описано в примере 1(bl), микропузырьки значительно увеличивались в размерах после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация в диапазоне размеров 10-80 мкм возрастала от незначительной до приблизительно 8,6 об.% в течение 3 минут.

с)(iv) После добавления 105 мкл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной, как описано в примере 1(ах), к 300 мкл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной, как описано в примере 1(bl), микропузырьки значительно увеличивались в размерах после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация в диапазоне размеров 10-80 мкм возрастала с 3,2 об.% до приблизительно 4,8 об.% в течение 3 минут.

с)(v) После добавления 105 мкл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной, как описано в примере 1(ay), к 300 мкл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной, как описано в примере 1(bl), микропузырьки значительно увеличивались в размерах после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация в диапазоне размеров 10-80 мкм возрастала с 1,5 об.% до приблизительно 2,2 об.% в течение 3 минут.

с)(vi) После редиспергирования лиофилизированных перфторбутановых микропузырьков в перфтордиметилциклобутановой эмульсии, как описано в примере 1(bg), наблюдалось немедленное увеличение размеров микропузырьков. Общая объемная концентрация в диапазоне размеров 10-80 мкм возрастала от незначительной до приблизительно 60 об.% в течение 1 минуты.

с)(vii) После добавления 76 мкл эмульсии 1Н-тридекафторгексана, полученной как описано в примере 1(bi), к 400 мкл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной, как описано в примере 1(bl), микропузырьки немедленно увеличивались в размерах, а общая объемная концентрация в диапазоне размеров 10-80 мкм возрастала от незначительной до приблизительно 20 об.% в течение 3 минут.

с)(viii) После добавления 63 мкл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной, как описано в примере 1(bm), к 741 мкл перфторбутановой газовой дисперсии, полученной как описано в примере 1(bl), микропузырьки немедленно увеличивались в размерах, а общая объемная концентрация в диапазоне размеров 10-80 мкм возрастала от незначительной до приблизительно 2 об.% в течение 3 минут.

с)(ix) После добавления 67 мкл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной, как описано в примере 1(aq), к 56 мкл перфторпропановой газовой дисперсии, полученной, как описано в примере 1(bn), микропузырьки увеличивались в размерах после воздействия ультразвука. Общая объемная концентрация в диапазоне размеров 10-80 мкм возрастала от незначительной до приблизительно 2,7 об.% в течение 1 минуты.

Пример 4 - Измерения акустического затухания in vitro
а) Образец перфторбутановой газовой дисперсии, полученной как описано в примере 1(а) (1 мкл), суспендировали в Isoton II (55 мл) при 37^oС и измеряли акустическое затухание как функцию от времени с помощью двух преобразователей широкого диапазона частот с центральными частотами 3,5 МГц и 5,0 МГц в режиме импульс-эхо. Через 20 секунд к суспензии добавляли диффундирующий компонент и измерения продолжали еще 120 секунд.

a)(i) После добавления 100 мкл 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(с), затухание немедленно возрастало более чем в 4 раза; точное количественное определение было невозможно, поскольку затухание превышало максимальную величину, поддающуюся измерению данной системой. Этот эффект продолжался 50 секунд и сопровождался полным изменением формы спектров затухания, что указывало на выраженное увеличение размера микропузырьков.

a)(ii) Добавление 20 мкл 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(с), приводило к постепенному возрастанию затухания, которое достигало максимума в три-четыре раза по сравнению с исходной величиной через 40 секунд, а затем быстро уменьшалось. И вновь, полное изменение формы спектров затухания указывало на выраженное увеличение размера микропузырьков.

a)(iii) Добавление 5 мкл 2-метилбутановой эмульсии, полученной в примере 1(с), приводило к постепенному возрастанию затухания, которое достигало максимума приблизительно в 50% от исходной величины через 30 секунд, а затем медленно уменьшалось до исходной величины. Сдвиг в сторону более низких резонансных частот в спектрах затухания указывал на умеренное увеличение размера микропузырьков.

a)(iv) Добавление 500 мкл эмульсии 2-хлор-1,1,2-трифторэтил дифторметилового эфира, полученной в примере 1(е), приводило к постепенному возрастанию затухания, которое достигало максимума приблизительно в 50% от исходной величины через 20 секунд, а затем медленно уменьшалось до исходной величины. Сдвиг в сторону более низких резонансных частот в спектрах затухания указывал на умеренное увеличение размера микропузырьков.

a)(v) Добавление 500 мкл перфторпентановой эмульсии, полученной в примере 1(d), приводило к незначительному возрастанию затухания. Сдвиг в сторону более низких резонансных частот в спектрах затухания указывал на незначительное увеличение размера микропузырьков.

Добавленные для контроля 500 мкл воды не вызвали различимого изменения затухания.

b) Образец 2-метилбутановой эмульсии, полученной как описано в примере 1(с) (100 мкл), добавляли в Isoton II (55 мл) при 37^oС и измеряли акустическое затухание как описано в (а), выше. Через 20 секунд к суспензии добавляли перфторбутановую газовую дисперсию, полученную в примере 1(а) (1 мкл) и измерения продолжали еще 120 секунд. Затухание быстро возрастало после добавления газовой дисперсии, достигая максимального уровня измерения системы через 20 секунд, и начиная уменьшаться через 50 секунд. Спектры затухания указывали на наличие микропузырьков больших размеров.

Когда с целью контроля вместо 2-метилбутановой эмульсии использовали 100 мкл воды, затухание быстро возрастало после добавления газовой дисперсии; спустя 40 секунд оно достигало стабильного уровня в четверть того, которое измерялось с 2-метилбутановой эмульсией. Затухание оставалось на этом уровне все оставшиеся 120 секунд периода измерения. Спектры затухания указывали на наличие микропузырьков малых размеров.

Пример 5 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии (сравнительный пример)
Был приготовлен инъекционный шприц, содержащий количество перфторбутановой газовой дисперсии, полученной из примера 1(b), которое соответствовало 2 мкл газового содержимого, и его содержимое было введено через открытую грудную клетку собаке весом 20 кг с помощью катетера, помещенного в вену передней конечности. Изображение сердца получали с помощью сканера Vingmed, CFM-750, используя срединную проекцию короткой оси. Сканер был настроен для получения импульсов один раз в конце каждой систолы путем синхронизации с ЭКГ животного. Яркий контраст был виден в правом желудочке через несколько секунд после инъекции, а контраст аналогичной яркости появлялся в левом желудочке 4-5 секундами позже, однако, со значительным затуханием, временно скрывающим задние участки сердца. Цифровой анализ интенсивности рассеяния выполнялся вне работы прибора на основе данных киносъемки, записанной сканером. Краткий, преходящий пик контрастного усиления, который продолжался около 10 секунд, начинаясь через 3 секунды после начала контрактного усиления в левом желудочке, наблюдался в типичном участке передней стенки миокарда левого желудочка сердца.

Пример 6 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью 2 -метилбутановой эмульсии (сравнительный пример)
Был приготовлен инъекционный шприц, содержащий 1 мл 2-метилбутановсй эмульсии, полученной из примера 1(с), и его содержимое было введено животному, как описано в примере 5. Изображение сердца получали, как описано в примере 5. Контрастных эффектов не наблюдалось.

Пример 7 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и 2-метилбутановой эмульсии
Были приготовлены 2 инъекционных шприца, как описано в примерах 5 и 6, и содержимое обоих шприцев было введено собаке одновременно через Y-образный переходник и катетер, описанный в примере 5. Изображение сердца получали, как описано в примере 5. Усиление эхо-сигнала желудочков было таким же, которое наблюдалось в примере 5. В миокарде левого желудочка наблюдался монотонный подъем интенсивности эхо-сигнала через 30 секунд после достижения контрастным болюсом коронарной сосудистой системы. Контрастные эффекты в миокарде полностью исчезали спустя 5 минут.

Пример 8 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторпентановой эмульсии (сравнительный пример)
Был приготовлен инъекционный шприц, содержащий 0,5 мл перфторпентановой эмульсии, полученной из примера 1(d), и его содержимое было введено животному как описано в примере 5. Изображение сердца получали, как описано в примере 5. Признаков усиления эхо-сигнала ни в одном участке изображения не наблюдалось.

Пример 9 - Получение изображения сердца собаки in vivo низкой интенсивности с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфторпентановой эмульсии
Были приготовлены инъекционные шприцы, как описано в примерах 5 и 8, и содержимое обоих шприцев было введено одновременно через открытую грудную клетку беспородной собаке весом 20 кг через Y-образный переходник и катетер, помещенный в вену передней конечности. Изображение сердца получали с помощью сканера Vingmed CFM-750, используя срединную проекцию короткой оси. Сканер был настроен для минимизации акустического выхода путем понижения испускаемой энергии до величины 1(по шкале от 0 до 7), и для получения импульсов один раз в конце каждой систолы путем синхронизации с ЭКГ животного. Наблюдавшееся контрастное усиление было таким, как описано в примере 5, однако продолжительность его в миокарде была несколько больше.

Пример 10 - Получение изображения сердца собаки in vivo высокой интенсивности с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфторпентановой эмульсии
Эксперимент примера 9 повторили, за исключением того, что выход сканера был настроен для максимизации акустического ультразвукового воздействия на ткань участка, изображение которого получали. Это было осуществлено путем использования комбинации продолжительной высокочастотной рамочной визуализации и наивысшей энергии выхода 7 (по шкале от 0 до 7). После инъекции наблюдалось интенсивное и яркое контрастное усиление в обоих желудочках сердца. Стойкий подъем контрастного усиления наблюдался во всех участках миокарда, вплоть до такой интенсивности усиления, которая приближалась к максимальному белому уровню экрана. Продолжительность контрастирования тканей составляла приблизительно 30 минут, в то время как контрастные эффекты в крови снижались почти до исходных величин через 5 минут после инъекции, что делало изображение практически независимым от затухания, обусловливаемого кровью, и обеспечивало полное и чрезвычайно яркое круговое контрастное усиление миокарда. Контрастный эффект в миокарде близко к преобразователю не спадал, несмотря на продолжительное воздействие ультразвука высокой интенсивности.

Пример 11 - Получение изображения сердца собаки in vivo высокой интенсивности с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфторпентановой эмульсии
Процедуру примера 10 повторили, за исключением того, что использовавшуюся перфторбутановую эмульсию получали путем охлаждения раствора полиэтиленгликоль 10000 метилового эфира 16-гексадеканоилоксигексадеканоата (200 мг, приготовленной, как описано в примере 2(k) в публикации WO-A-9607434) в очищенной воде (20 мл), переноса 1 мл порции этого раствора в 2 мл флакон, добавления перфторпентана (200 мкл), встряхивания флакона в течение 45 секунд с помощью CapMix® и хранения эмульсии при 0^oС до использования. Наблюдавшееся контрастное усиление крови и ткани миокарда было таким же, как в примере 5.

Пример 12 - Получение изображения почки собаки in vivo
Использовались те же вещества и та же процедура инъекции, что и в примере 9. Получали изображение левой почки собаки через интактную брюшную стенку с помощью тех методик высокого выхода, что и в примере 10. В изображение были включены центральные структуры почки, содержащие приносящие артерии. Через 20 секунд после инъекции наблюдалось начало стойкого подъема контрастного усиления паренхимы почки, которое достигало плато интенсивности чрезвычайной яркости спустя 1-2 минуты. Преобразователь передвигали, чтобы получить изображение правой почки через 4 минуты после инъекции. Сначала эта почка имела нормальный вид, без усиления. Однако это приложение ультразвука высокой интенсивности вызывало небольшое повышение эхо-интенсивности спустя несколько минут, хотя и не до такого уровня как в левой почке.

Пример 13 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и уменьшенного количества перфторпентановой эмульсии
Процедуру примера 10 повторили за исключением того, что дозу перфторбутановой эмульсии сокращали до одной трети. Пиковая интенсивность усиления контрастности миокарда было сравнимо с той, которая наблюдалась в примере 10, но продолжительность контрастирования тканей сократилась с 30 минут до менее чем 10 минут.

Пример 14 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфторпентановой эмульсии при интактной грудной клетке
Процедуру примера 10 повторили за исключением того, что эксперимент проводили при интактной грудной клетке. Контрастное усиление миокарда было сравнимо с тем, которое наблюдалось в примере 10.

Пример 15 - Получение цветного допплеровского изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфторпентановой эмульсии
Процедуру примера 10 повторили за исключением того, что сканер (в цветном допплеровском режиме) был приложен к левому желудочку сердца в течение первой минуты после инъекции, чтобы инициировать рост микропузырьков. После этого контрастное усиление миокарда было более интенсивным по сравнению с тем, которое наблюдалось в примере 10.

Пример 16 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и эмульсии перфтор-4-метилпент-2-ена
0,5 мл изотонически разведенной перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в соответствии с примером 1(аg), и 66 мкл эмульсии перфтор-4-метилпент-2-ена, полученной в примере 1(а1), инъецировали как описано в примере 10. Полученное контрастное усиление миокарда было сравнимо по интенсивности с тем, которое наблюдалось в примере 10, но продолжительность его составляла 6-8 минут.

Пример 17 - Получение изображения гиперемированного участка сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфторпентановой эмульсии
Ветвь огибающей коронарной артерии собаки временно лигировали на 2 минуты, после чего инъецировали контрастный агент, как описано в примере 10. Контрастное усиление гиперемированного миокарда было значительно более интенсивным по сравнению с окружающими нормальными тканями.

Пример 18 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфтордиметилциклобутановой эмульсии
0,5 мл изотонически разведенной перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в соответствии с примером 1(ag), и 66 мкл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной в примере 1(ао), инъецировали, как описано в примере 10. Полученное интенсивное контрастное усиление миокарда было сравнимо с тем, которое наблюдалось в примере 16.

Пример 19 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфтордиметилциклобутановой эмульсии
0,5 мл изотонически разведенной перфторбутановой газовой дисперсии, полученной в соответствии с примером 1(bl), и 66 мкл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной в примере 1(aq), инъецировали, как описано в примере 10. Полученное интенсивное контрастное усиление миокарда было сравнимо с тем, которое наблюдалось в примере 16.

Пример 20 - Нацеливание "частица на частицу" in vivo
0,02 мкл/кг авидинилированных перфторбутановых микропузырьков, полученных в соответствии с примером 1(bq), и 0,02 мкл/кг перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной в примере 1(bh), одновременно внутривенно инъецировали беспородной собаке весом 20 кг, находящейся под наркозом, одновременно получая изображение ее сердца с помощью ультразвука, как описано в примере 10. Эхо-усиление миокарда было сравнимо с тем, которое наблюдалось в примере 10, за исключением того, что пик затухания в крови левого желудочка был значительно меньше выражен.

Пример 21 - Получение изображения сердца кролика in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфтордиметилциклобутановой эмульсии.

Был приготовлен инъекционный шприц, содержавший количество дисперсии перфторбутановых микропузырьков, полученной в примере 1(bl) (средний объемный диаметр 3,0 мкм), соответствующее 1 мкл газового содержимого, и еще один инъекционный шприц, содержавший 105 мкл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной в примере 1(aq). Содержимое обоих шприцев одновременно инъецировали кролику весом 5 кг с помощью катетера, помещенного в вену уха. Получение изображения сердца в режиме В выполняли с помощью сканера ATL HDI-3000 с датчиком Р5-3, с проекцией по парастернальной короткой оси при открытой грудной клетке. Результаты были сравнимы с теми, которые наблюдались в примере 18.

Пример 22 - Индуцированная ультразвуком доставка лекарственного средства.

Черному новозеландскому кролику весом 3 кг, находящемуся под наркозом, внутривенно инъецировали 0,04 мл перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной в примере 1(aq), одновременно с 0,12 мл перфторбутановой газовой суспензии, полученной как описано в примере 1(bl); при этом получали изображение левой почки с помощью сканера ATL HDI-3000 с датчиком Р5-3, установленного на максимальную энергию выхода. Наблюдался значительный рост пузырьков и их накопление в паренхиме почки. Затем 160 мг FITS-декстрана (мол. масса 2 000 000) растворяли в 5 мл воды и инъецировали внутривенно, и продолжали получать ультразвуковое изображение того же участка в течение еще 5 минут, включая теперь сканер в мощный допплеровский режим для максимизации акустического выхода. Животное затем умерщвляли и удаляли обе почки, которые исследовали в ультрафиолетовом свете. Увеличенное количество флюоресцентного вещества наблюдалось в виде пятен величиной 50-100 мкм в интерстиции в пределах участков левой почки, подвергавшихся воздействию ультразвука в присутствии микропузырьков. С каждым таким пятном был связан нефрон, не имеющий внутрисосудистой флюоресценции.

Пример 23 - Albunex® как газовая дисперсия
0,3 мл/кг Albunex® и 1,5 мкл/кг перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной в примере 1(aq), внутривенно инъецировали беспородной собаке мужского пола весом 20 кг, находившейся под наркозом, и получали ультразвуковое изображение, как описано в примере 10. Усиление миокарда было таким же, как описано в примере 10.

Пример 24 - Нацеленные микропуэырьки при получении изображения сердца кролика
0,1 мкл/кг микропузырьков, полученных как описано в примере 1(az), внутривенно инъецировали кролику, одновременно получая ультразвуковое изображение сердца кролика с помощью сканера ATL HDI-3000 с датчиком Р5-3. Наблюдалось слабое, но продолжительное усиление эхо-сигнала миокарда. Спустя три минуты инъецировали 1,5 мкл/кг перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной в примере 1(aq). Наблюдалось незначительное повышение интенсивности эхо-сигнала миокарда, подвергавшегося воздействию ультразвука.

Пример 25 - Получение изображения сердца крысы in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфтордиметилциклобутановой эмульсии.

Эксперимент, описанный в примере 19, осуществляли на крысе с получением сравнимых результатов.

Пример 26 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфторгексановой эмульсии
0,1 мкл/кг перфторгексановой эмульсии, полученной, как описано в примере 1(аг), и 0,2 мкл/кг суспензии перфторбутановых микропузырьков, полученной как описано в примере 1(bl), инъецировали одновременно собаке, как описано в примере 10. Контрастный эффект в отношении миокарда был сравним с эффектом, наблюдавшимся в примере 10.

Пример 27 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и эмульсии гептафторпент-1-ена
0,3 мкл/кг суспензии перфторбутановых микропузырьков, полученной, как описано в примере 1(bl), и 0,15 мл эмульсии гептафторпент-1-ена, полученной как описано в примере 1(am), инъецировали одновременно собаке, как описано в примере 10. Наблюдался относительно слабый контрастный эффект в отношении миокарда, который, однако, был более интенсивным и более продолжительным по сравнению с эффектом, наблюдавшимся в примере 5.

Пример 28 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфтордиметилциклобутановой эмульсии, стабилизированной стерилизованным фосфолипидом
0,3 мкл/кг суспензии перфторбутановых микропузырьков, полученной как описано в примере 1(bl), и 0,3 мкл/кг перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной, как описано в примере 1(bm), инъецировали одновременно собаке, как описано в примере 19. Наблюдался контрастный эффект в отношении миокарда, который был сравним с эффектом, наблюдавшимся в примере 19.

Пример 29 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторпропановой газовой дисперсии и перфтордиметилциклобутановой эмульсии
0,17 мкл/кг суспензии перфторпропановых микропузырьков, полученной как описано в примере 1(bn), и 0,3 мкл/кг перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной, как описано в примере 1(aq), инъецировали одновременно собаке, как описано в примере 19. Наблюдался контрастный эффект в отношении миокарда, который был сравним с эффектом, наблюдавшимся в примере 19.

Пример 30 - Получение изображения желудочно-кишечного тракта собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфтордиметилциклобутановой эмульсии
20 мл эмульсии перфтордиметилциклобутана, полученной, как описано в примере 1(aq), давали через желудочный зонд собаке, находившейся под наркозом. После этого внутривенно инъецировали малое количество (диапазон доз 0,1-0,2 мкл газа/кг) дисперсии перфторбутановых микропузырьков, полученной в примере 1(а). Ультразвуковой преобразователь изображения прикладывали к брюшной стенке и локализовали рост микропузырьков в капиллярной системе стенки желудка, что обеспечивало усиление контраста с улучшенным очерчиванием контуров слизистой оболочки.

Пример 31 - Получение изображения желудочно-кишечного тракта собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфтордиметилциклобутановой эмульсии
Дисперсию перфторбутановых микропузырьков, полученную в примере 1(а), давали через желудочный зонд собаке, находившейся под наркозом. Дисперсии позволяли равномерно распределиться внутри желудка, что подтверждалось ультразвуковым изображением. После этого внутривенно инъецировали малое количество эмульсии перфтордиметилциклобутана, полученной как описано в примере 1(aq) (диапазон доз 0,2-1 мкл перфторированного углеводорода/кг). Ультразвуковой преобразователь удерживали в области, представлявшей интерес; рост микропузырьков в слоях желудочного сока, проксимальных по отношению к поверхностям слизистой оболочки, обеспечивал усиление контраста с улучшенным очерчиванием контуров слизистой оболочки.

Пример 32 - Получение изображения сердца собаки in vivo с помощью перфторбутановой газовой дисперсии и перфтордиметилциклобутановой эмульсии и совместно вводимого аденозина.

Пережимающую петлю помещали вокруг главной ветви левой передней нисходящей коронарной артерии при открытой грудной клетке собаки весом 22 кг и непосредственно ниже по потоку относительно перекрывающего приспособления помещали ультразвуковой транзитный временной расходомер, который затем настраивали таким образом, чтобы получать стойкое 25% сокращение потока приблизительно од 14 до 10 мл/мин. Содержимое трех шприцев, соответственно содержавших (1) количество дисперсии перфторбутановых микропузырьков, полученной из примера 1(bl), соответствовавшее 4,4 мкл газового содержимого, (2) количество перфтордиметилциклобутановой эмульсии, полученной из примера 1(aq), соответствовавшее 33 мкл диспергированной перфтордиметилциклобутановой фазы, и (3) 3,0 мг аденозина, растворенного в 0,9% солевом растворе, были затем инъецированы внутривенно в виде одновременного болюса; спустя 10 секунд еще 3,0 мг аденозина, растворенного в 0,9% солевом растворе, были медленно инъецированы в течение 20 секунд. Изображение левого желудочка сердца получали с помощью сканера ATL HDI-3000 с датчиком Р5-3; продолжительное воздействие ультразвуком осуществляли при максимальной энергии в течение 1 минуты для индуцирования роста микропузырьков, после чего миокард исследовали в ультразвуковом В-режиме. Можно было видеть отчетливую очевидную разницу по уровням серой шкалы между стенозированными участками (более яркое изображение по сравнению с исходным) и нормальными участками (намного более яркое изображение по сравнению с исходным).

Формула изобретения

1. Комбинированный препарат для одновременного, раздельного или последовательного использования в качестве контрастного агента для получения ультразвукового изображения, который включает i) водную среду для инъекции, содержащую диспергированный газ, и ii) композицию, включающую диффундирующий компонент, который включает как минимум одно вещество которое имеет или способно генерировать давление газа или пара, достаточное для активизации контролируемого увеличения указанного диспергированного газа in vivo, посредством диффузии внутрь него молекул газа или пара, произведенных из указанного вещества, так, чтобы, по меньшей мере, временно увеличивать размеры указанного диспергированного газа in vivo.

2. Комбинированный препарат по п. 1, в котором диспергированный газ включает воздух, азот, кислород, двуокись углерода, водород, инертный газ, фторид серы, гексафторид селена, необязательно галогенированный силан, низкомолекулярный углеводород, кетон, сложный эфир, галогенированный низкомолекулярный углеводород или смесь любых из вышеупомянутых веществ.

3. Комбинированный препарат по п. 2, в котором указанный газ включает перфторированный кетон, перфторированный эфир или перфторированный углеводород.

4. Комбинированный препарат по п. 3, в котором перфторированный углеводород включает перфторалкан, перфторалкен или иперфторциклоалкан.

5. Комбинированный препарат по п. 2, в котором указанный газ включает гексофторид серы или перфторпропан, перфторбутан или перфторпентан.

6. Комбинированный препарат по любому из предыдущих пунктов, в котором указанный диспергированный газ стабилизирован устойчивой к коалесценции поверхностной мембраной, пленкообразующим белком, полимерным материалом, неполимерным и неполимеризующимся материалом, образующим оболочку, или поверхностно-активным веществом.

7. Комбинированный препарат по п. 6, в котором указанное поверхностно-активное вещество включает, по меньшей мере, один фосфолипид.

8. Комбинированный препарат по п. 7, в котором, по меньшей мере, 75% указанного поверхностно-активного вещества включает молекулы фосфолипида, индивидуально несущие общий чистый заряд.

9. Комбинированный препарат по п. 8, в котором, по меньшей мере, 75% пленкообразующего поверхностно-активного вещества включает один или более фосфолипидов, выбранных из фосфатидилсеринов, фосфатидилглицеринов, фосфатидилинозитолов, фосфатидных кислот и кардиолипинов.

10. Комбинированный препарат по любому из предыдущих пунктов, в котором композиция, включающая диффундирующий компонент, приготовлена для подкожного, внутримышечного, внутривенного или ингаляционного введения.

11. Комбинированный препарат по любому из предыдущих пунктов, в котором композиция, включающая диффундирующий компонент, дополнительно содержит жидкий носитель.

12. Комбинированный препарат по п. 11, в котором диффундирующий компонент диспергирован в водном жидком носителе в форме эмульсии или микроэмульсии типа "масло в воде".

13. Комбинированный препарат по п. 12, в котором диффундирующий компонент включает алифатический эфир, полициклическое масло, полициклический спирт, гетероциклическое соединение, алифатический углеводород, циклоалифатический углеводород или галогенированный низкомолекулярный углеводород.

14. Комбинированный препарат по п. 13, в котором диффундирующий компонент включает перфторированный углеводород.

15. Комбинированный препарат по любому из пп. 12-14, в котором указанную эмульсию стабилизируют фосфолипидным поверхностно-активным веществом.

16. Комбинированный препарат по п. 15, в котором перфторированный углеводород включает перфторалкан, перфторалкен, перфторциклоалкан или перфторциклоалкен.

17. Комбинированный препарат по п. 16, в котором диффундирующий компонент включает перфторпентан, перфторгексан, перфтордиметилцикло-бутан или перфторметилциклопентан.

18. Комбинированный препарат по п. 15, в котором перфторированный углеводород включает перфторированный спирт.

19. Комбинированный препарата по п. 9, в котором, по меньшей мере, 80% указанного фосфолипида включает фосфатидилсерины.

20. Комбинированный препарат по любому из пп. 1-9, в котором композиция, включающая диффундирующий компонент, приготовлена для чрескожного применения.

21. Комбинированный препарат по п. 15, в котором, по меньшей мере, 75% указанного фосфолипидного поверхностно-активного вещества включает молекулы, индивидуально несущие общий чистый заряд.

22. Комбинированный препарат по п. 21, в котором, по меньшей мере, 75% указанного фосфолипидного поверхностно-активного вещества выбирают из фосфатидилсеринов, фосфатидилглицеринов, фосфатидилинозитолов, фосфатидных кислот и кардиолипинов.

23. Комбинированный препарат по п. 22, в котором, по меньшей мере, 80% указанного фосфолипидного поверхностно-активного вещества включает фосфатидилсерины.

24. Комбинированный препарат по любому из предыдущих пунктов, который дополнительно включает вазодилатирующее лекарственное вещество.

25. Комбинированный препарат по п. 24, в котором указанным вазодилатирующим лекарственным веществом является аденозин.

26. Комбинированный препарат по любому из пп. 1-17, который дополнительно включает терапевтический агент.

27. Комбинированный препарат по любому из пп. 1-23, который дополнительно включает усиливающее контрастность составляющие для способов получения изображения, не являющихся ультразвуковыми.

28. Способ получения усиленных изображений у объекта - человека или животного, который включает следующие стадии: 1) инъецирование физиологически приемлемой водной среды, включающей диспергированный в ней газ, в кровеносную систему указанного объекта; ii) до, во время или после инъекции указанной водной среды, введение указанному объекту композиции, включающей диффундирующий компонент, способный in vivo диффундировать в указанный диспергированный газ, так, чтобы, по меньшей мере, временно увеличивать его размеры, и iii) получение ультразвукового изображения по меньшей мере части указанного объекта.

29. Способ по п. 28, в котором композицию, включающую диффундирующий компонент, вводят подкожно, внутримышечно, внутривенно или посредством ингаляции.

30. Способ по п. 28, в котором композицию, включающую диффундирующий компонент, вводят чрескожным путем.

31. Способ по любому из пп. 28-30, в котором одновременно объекту вводят вазодилатирущее лекарственное средство.

32. Способ по п. 31, в котором указанным вазодилатирующим лекарственным средством является аденозин.

Приоритет по пунктам:
21.10.1996 - по пп. 1-17, 28 и 29;
23.04.1997 - по пп. 18 и 26;
21.10.1997 - по пп. 19-25, 27 и 30-32.