Штамм № 1734 "приморский-2000" вируса ящура типа о для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Штамм 1734 "Приморский-2000" получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных культурах клеток. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ВГНКИ 22.03.2000 под регистрационным 1734 "Приморский-2000-ДЕП". Вирус штамма О₁ 1734 "Приморский-2000" репродуцируется в чувствительных культурах клеток и в течение 20-24 ч инкубирования накапливается до 7,5-8,0 Ig ТЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 ч. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в культурах клеток в течение 10 пассажей. Штамм вируса ящура типа О обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления средства специфической профилактики и диагностики ящура типа О, гомологичного эпизоотическому вирусу, циркулирующему в России, регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию. 12 табл., 2 ил.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств для специфической профилактики и диагностики ящура типа О.

Ящур - это острое высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого заболевание характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Эта болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, тем самым затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность.

Многолетний опыт показывает, что наличие эндемичного ящура снижает доходы в молочном и мясном животноводстве на 35-40%.

Вирус ящура относится к роду афтовирусов, семейству пикорнавирусов. Он включает 7 иммунологических типов и большое количество подтипов [1, 2].

Известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов. Известно, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Такие антигенные изменения могут выражаться как в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, так и в появлении совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств для серологической диагностики и специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами [2, 3].

Известны штаммы вируса ящура типа О, которые используются на территории России в течение последних 34-35 лет. К ним относятся следующие штаммы: O₁ 1618 "Чечено-Ингушский", выделенный в 1966 году в Чечено-Ингушской АССР; O₁ 194, выделенный в 1967 году в Волгоградской области и O₁ 1182/83, выделенный в 1983 году на территории Армении [4, 5].

Вакцины из этих производственных штаммов ранее обеспечивали довольно напряженный иммунитет у привитых животных в отношении гомологичных либо близких им в антигенном отношении возбудителей.

Однако в последние годы было зарегистрировано несколько вспышек ящура, которые в ряде случаев не удалось ликвидировать в первичных очагах, несмотря на энергичные ветеринарно-санитарные мероприятия общего и специального характера.

Это было обусловлено недостаточной эффективностью вакцин, применяемых в отношении эпизоотического вируса, вызывающего прорывы иммунитета даже у многократно вакцинированных животных. Поэтому назрела необходимость подготовить новый производственный штамм вируса для успешной специфической профилактики с/х животных от вновь выделенного вируса ящура типа О.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм О₁ 194 "Волгоградский", выделенный в 1967 году и используемый в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении диагностических и вакцинных препаратов, применяемых на территории России и стран-членов СНГ [6].

Штамм 194 вируса ящура О₁ имеет следующие характеристики, представленные в таблице 1.

Недостатки данного штамма состоят в его низкой биологической, антигенной и иммуногенной активности.

Об этом свидетельствует тот факт, что в 2000 году в России (Приморский край) и странах Закавказья (Грузия) были отмечены очаги заболевания ящуром типа О крупного рогатого скота и свиней, иммунизированных бивалентной вакциной АО, в состав которой входит антиген из производственного штамма О₁ 194. Однако вакцина не обеспечила удовлетворительной защиты иммунизированных животных. Лабораторными исследованиями во ВНИИЗЖ афтозного материала, выделенного от больных свиней, был установлен вирус ящура типа О, имеющий антигенные отличия от штамма О₁ 194 и O₁ 1618 в реакции связывания комплемента (РСК) и реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Это свидетельствовало о несоответствии используемых средств специфической профилактики и диагностики ящура типа О, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулирующему в 2000 году в России (Приморский край) и странах Закавказья (Грузия).

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса ящура типа О, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего изготовление диагностических и вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся в России и странах Закавказья.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении нового производственного штамма вируса ящура типа О, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодного для изготовления диагностических и вакцинных препаратов против ящура типа О, гомологичных эпизоотическому вирусу, циркулирующему в России (Приморский край) и странах Закавказья (Грузия).

Указанный технический результат достигнут получением штамма 1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О. Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000" является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма 0₁ 1734 "Приморский-2000" выделен 13.04.2000 г. от больных свиней в хозяйстве ОПХ "Степное" (с. Элитное) Уссурийского района Приморского края. Производственный штамм O₁ 1734 "Приморский-2000" получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (ВГНКИ) 22.03.2000 г. под регистрационным номером 1734 "Приморский-2000"-ДЕП.

По сравнению с прототипом штамм O₁ 1734 "Приморский-2000" обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления диагностических препаратов и инактивированной вакцины. Штамм 1734 "Приморский-2000" вируса типа О обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих производить серологическую диагностику изолятов вируса ящура типа О, вызвавшего вспышки заболевания в 2000 году в России (Приморский край) и странах Закавказья (Грузия), и противоящурной инактивированной вакцины, создающей защиту восприимчивых животных против указанного возбудителя заболевания.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на: фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность белка VP1 штамма 1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О; фиг. 2 изображена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма 1734 "Приморский-2000" с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000" вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000" относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства По своим антигенным свойствам штамм относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА и РН. При вакцинации КРС и свиней вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным вирусом индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40-1:80, в ИФА в разведении 1: 3000-1: 4000. При определении антигенного родства штамм О₁ 1734 "Приморский-2000" с производственными штаммами О₁ 194, O₁ 1618, а также с другими штаммами, выделенными в странах Закавказья и других зарубежных стран в 1997-2000 годах, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VP1.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма 1734 "Приморский-2000". Из нее была выведена первичная структура белка VP1 (фиг.1). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм 1734 "Приморский-2000" принадлежит к Паназиатской генетической линии вируса ящура типа О (фиг.2). Паназиатский вирус вызвал пандемию ящура в 1999-2000 годах в большинстве стран Азии, в том числе во Вьетнаме, Китае, Тайване, Японии, Корее, Монголии, Армении, Грузии. Опустошительная эпизоотия ящура в Великобритании в 2001 году также была вызвана Паназиатским вирусом.

Исследуемый вирус имеет наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О₁-Вьетнам-1999 и О₁-Тайвань-1999 (фиг.2).

Филогенетические взаимоотношения исследованных изолятов с ранее изученными штаммами, выделенными в разных странах мира за три последние десятилетия, указаны на дендрограмме (фиг.2). Установлено, что исследованные изоляты отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от штаммов ₁ 194 и O₁ 1618, используемых в настоящее время для изготовления средств диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Антигенное родство вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000" с соответствующими производственными и ранее выделенными штаммами на территории Армении, Тайваня, Монголии и Вьетнама изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что эпизоотический штамм O₁ 1734 отличается от производственных штаммов O₁ 194 и O₁ 1618, но в то же время близко родственен штаммам О₁-Тайвань-1999, O₁ 1704-Армения-1997, О₁-Вьетнам-1999 и О₁-Монголия-2000. Аналогичные результаты получены и в реакции ИФА.

Биологические характеристики Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000" проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для использования в качестве сырья для получения диагностических препаратов, а также изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Вирус штамма O₁ 1734 репродуцируется в монослойной первично-трипсинизированной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 20-24 часов инкубирования накапливается до 6,5-7,5 Ig ТЦД_50/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 часа.

После 3-5 пассажей инкубирования накапливается до 6,5-7,5 1д ТЦД_50/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000" является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 7•10⁶ Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой с мол. массой 2,8•10⁸ МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует. Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержатся приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Проведено определение первичной структуры участка генома вируса с помощью ПЦР и сиквенса. Результаты исследований представлены на фиг.1 и 2. Сравнительный анализ показал, что данный изолят принадлежит к новой генетической линии вируса ящура типа О. Представителей этой линии выделяли в последние годы в различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию и Дальний Восток. Исследуемый вирус ящура O₁ 1734 имел наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О₁-Вьетнам-1999 и О₁-Тайвань-1999.

В то же время его гомология с представителями других генетических линий вируса ящура типа О составляла всего лишь 80-90% (фиг.2).

Широкое географическое распространение генетической линии вируса ящура, к которой принадлежит штамм О₁ 1734, позволяет говорить о возможной панзоотии.

Физические свойства Масса вириона - 8,4•10^-18 г. Коэффициент сентиментации - 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность - 1,45 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам Вирус штамма O₁ 1734 "Приморский-2000" устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению и высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, крольчат и морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм O₁ 1734 "Приморский-2000" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа О.

Для снижения его эпизоотической опасности необходимо обеспечить своевременную лабораторную диагностику и вакцинопрофилактику вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные антительные и антигенные диагностикумы и вакцина, полученные с использованием данного штамма в качестве производственного.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1
Штамм вируса ящура 0₁ 1734 "Приморский-2000" был изолирован из полевого материала, поступившего во ВНИИЗЖ в виде эпителия афт от свиней, подозреваемых в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и дифференциации его от других везикулярных болезней. При изоляции вируса использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных [7].

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию исходного вируса к культурам первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Были использованы культуры клеток СП, ПСГК-30, IB-RS-2 и ВНК-21. Для постановки биопробы первичные и перевиваемые культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах во флаконах емкостью 50-100 мл, отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Игла с антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали хлороформом в отношении 1: 10. После 30-минутного инкубирования при 37-38^oС во флаконы вносили по 5-10 мл поддерживающей питательной среды и инкубировали при 37-38^oС до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000g в течение 15-20 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК и ИФА на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток и сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ВНИИЗЖ.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 3.

Результаты, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма O₁ 1734 к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирус был исследован в РСК с набором диагностикумов на все типы вируса ящура, везикулярной экзантемы, везикулярной болезни свиней и везикулярного стоматита с целью идентификации типовой принадлежности и контроля на чистоту. Результаты типирования вируса в РСК представлены в таблице 4.

Приведенные в таблице 4 результаты свидетельствуют о том, что выделенный вирус относится к типу О; со всеми остальными сыворотками был получен отрицательный результат.

Пример 2
Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из вируса ящура, штамм O₁ 1734 "Приморский-2000", репродуцированный в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных белков добавлением 0,05% полигуанидина. Очищенный вирус концентрируют в 100 раз с помощью ПЭГ-6000 (10% по объему) и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,01-0,05% и рН 7,8-8,0.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта вводят морским свинкам внутримышечно в дозе 1,0 см³. Через 21 день иммунизацию дважды повторяют (интервал 7 дней) и через 10 дней животных обескровливают. Индивидуальные пробы сывороток крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК согласно [7].

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двухсторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при 4^oС в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют в ампулы по 0,5-1,0 см³ и лиофилизируют.

Способом, описанным в примере 2, было приготовлено 2 серии гипериммунных сывороток, характеристики которых представлены в таблице 5.

Данные таблицы 5 свидетельствуют, что получены диагностические сыворотки, по специфической активности отвечающие требованиям [7].

Пример 3
Для получения антигена для иммунохимических реакций используют вирус ящура, штамм O₁ 1734 "Приморский-2000", адаптированный к культурам клеток перевиваемых сублиний ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10%-ной суспензии из стенок афт свиней. Адаптацию проводят в течение 4-5 последовательных пассажей. Полученную матричную расплодку вируса используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике. Полученную вируссодержащую жидкость концентрируют в 100 раз с помощью 10% ПЭГ-6000. Полученный концентрат инактивируют прогреванием при 58^oС в течение 40 минут, фасуют в ампулы по 1 см³ и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Указанным способом было приготовлено 2 серии диагностического антигена, характеристики которых приведены в таблице 6.

Результаты исследований, приведенные в таблице 6, свидетельствуют, что получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям [7].

Пример 4
Для изготовления адсорбат-вакцины вирус ящура О₁ 1784 "Приморский-2000" репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,2-7,4. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005-0,1 ТЦД₅₀ на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре 36-37^oС. Через 8-10 часов инкубирования при достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S+75S компонентов. Количество 146S+75S компонентов суспензии должно соответствовать не менее 0,5 мкг/мл. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при 36-37^oС и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до 4-8^oС. В охлажденную супензию добавляют 10% раствор полигексаметиленгуанидина (ПГМГ) до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вируссодержащего белка и 146S+75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА). Для этого в охлажденную суспензию антигена добавляют расчетный объем геля ГОА 3% концентрации.

После седиментации ГОА сливают расчетный объем надосадочной жидкости или измеряют объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62-0,488 Р<0,01 мг/мл n=10, а концентрация 146S+75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 6,0 мкг/мл. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации, по меньшей мере, 0,075%. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и подвергают контролю на стерильность по [8].

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 мл, а затем подкожно в дозе 10 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Результаты контроля иммуногенной активности полученной вакцины на КРС приведены в таблице 7. Приведенные в таблице 7 результаты показали, что все шесть голов КРС были защищены от генерализации процесса после контрольного заражения через 21 день.

Иммунный ответ КРС на введение адсорбат-вакцины из ящурного антигена O₁ 1734 проверили также на 5 головах КРС массой 200-300 кг. Результаты исследований представлены в таблице 8. Приведенные в таблице 8 данные свидетельствуют о том, что противоящурная адсорбат-вакцина из штамма О₁ 1734 индуцирует хороший иммунный ответ, начиная с 21 дня после вакцинации. Уровень вируснейтрализующих антител (ВНА) к 61 дню увеличился на 5,07 лог₂ по сравнению с 21 днем после вакцинации.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Оптимальный компонентный состав полученной адсорбат-вакцины против ящура типа О приведен в таблице 9.

Пример 5
Для изготовления эмульсионной вакцины вирус ящура типа О, штамм 1774 "Приморский-2000", репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивируют и очищают от балластных примесей и возможных контаминантов, подвергают контролю на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, иммуногенных компонентов (146S+75S) и стерильность так, как описано в примере 4. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем. Полученный концентрат антигена хранят при 4-6^oС до момента использования в вакцине. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования концентрата антигена и масляного адъюванта на коллоидных мельницах в соотношении 3:7-1:1 соответственно.

В результате получают инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа О, которая представляет собой молокоподобную жидкость, нерастворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается в месте введения, не вызывает образования абсцессов, не вызывает общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней в дозе 2 мл через 1-21 день после вакцинации, для КРС - в дозе 5 мл через 3-21 день после вакцинации и для овец - в дозе 1 мл через 3-21 день после введения. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС и овцам - подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 4 мкг 146S+75S компонентов. Оптимальный компонентный состав полученной эмульсионной вакцины против ящура типа О приведен в таблице 10.

Иммуногенная активность эмульсионной вакцины проверена на свиньях массой 35-40 кг. Результаты исследований представлены в таблицах 11 и 12. ИмД₅₀= 0,18 мл. В прививном объеме 2 мл содержится 11,2 ИмД5о для свиней. В таблице 11 показано, что вакцина из вируса ящура O₁ 194 индуцирует в организме подсвинков в 2-3 раза меньшее количество ВНА против гетерологичного штамма вируса O₁ 1784 "Приморский-2000" по сравнению с гомологичным штаммом.

Представленные в таблице 12 данные демонстрируют уровень гуморального иммунитета у подсвинков, привитых противоящурными эмульсионными вакцинами с разным содержанием иммуногенного компонента.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- штамм 1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- штамм 1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригоден для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Ререр Х. Ящур. Пер. с нем. Г.А.Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук. П.В.Малярца, М., Колос, 1971, 432с.

2. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. Под ред. А.Н.Бурдова.-М., Агропромиздат, 1990, 320с.

3. Сюрин и др. Вирусные болезни животных.-М., ВНИТИБП, 1998.-c.532-548.

4. Кругликов Б. А., Штефан М.К. и Тарасенко Т.Я. Изучение инфекционных свойств штаммов вируса ящура типа О, выделенных в разные периоды эпизоотии. - В кн.: Акт. пробл. вет. вирусол. - Владимир, 1988. -ч. 1. -с. 77-78.

5. Авт. свид. СССР 1739559, А 61 К 39/135, 10.04.2000 г.

6. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии CM CCP по продовольствию и закупкам 24.01.91 г. (прототип).

7. ГОСТ 25384-82 "Методические указания по выделению идентификации штаммов вируса ящура". М., Колос.-1974.

8. ГОСТ 28085-89.

9. Шажко Ж.А., Фомина Т.А. и др. Некоторые характеристики эпизоотических штаммов вируса ящура, изолированных в СССР. Ящур (К новой стратегии борьбы с ящуром), Владимир, 1992.-ч. 1.-с. 82-96.

Формула изобретения

Штамм вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, вид Aphtae, тип О, коллекция ВГНКИ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8