Полипептид, способный к образованию антигенсвязывающих структур со специфичностью к резус-d-антигенам, днк- последовательность, способ получения полипептида, способ селекции полипептида, полное антирезус-d-антитело (варианты) , фармкомпозиция, диагностическое средство для резус-d- типирования

 

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен полипептид, способный к образованию антигенсвязывающих структур, специфических к резус-D-антигенам. Полученный полипептид, будучи Fab-фрагментом, можно непосредственно применять в качестве активного ингредиента в фармацевтических и диагностических композициях. Fab-фрагмент и кодирующая его ДНК-последовательность могут быть использованы для получения полных рекомбинантных антирезус-D-антител, полезных в фармацевтических и диагностических композициях. 9 с. и 11 з. п. ф-лы, 10 табл., 35 ил.

Текст описания в факсимильном виде(см. чертежи) Т Т Тз

Формула изобретения

1. Полипептид, способный к образованию антигенсвязывающих структур со специфичностью к резус-D-антигенам, содержащий резус-D-специфические области CDR 1, СDR 2 и CDR 3 пар аминокислотных последовательностей V_H и V_L, с одинаковыми или разными идентификационными номерами, соответствующими определенным фигурам, как показано ниже в таблице (см. графическую часть).

2. Полипептид по п. 1, включающий резус-D-специфические области CDR 1, CDR 2 и CDR 3 пар аминокислотных последовательностей V_H и V_L, с одинаковыми идентификационными номерами, соответствующими определенным фигурам, как показано в таблице в п. 1.

3. Полипептид по п. 1, включающий области с аминокислотными последовательностями V_H и V_L и имеющие идентификационные номера, соответствующие определенным фигурам, как показано в таблице в п. 1.

4. Полипептид по п. 1, или 2, или 3, отличающийся тем, что представляет антигенсвязывающий Fab-фрагмент.

5. Полипептид по п. 1, или 2, или 3, содержащий тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина, способный к образованию полных антирезус-D-антител.

6. ДНК-последовательность, кодирующая полипептид, способный к образованию антигенсвязывающих структур со специфичностью к резус-D-антигенам, содержащая области с резус-D-специфическими сегментами CDR 1, CDR 2 и CDR 3 пар ДНК-последовательностей V_H и V_L, с одинаковыми или разными идентификационными номерами, соответствующими определенным фигурам, как показано ниже в таблице, и ее функциональные эквиваленты (см. графическую часть).

7. ДНК-последовательность по п. 6, кодирующая полипептид, способный к образованию антигенсвязывающих структур со специфичностью к резус-D-антигенам, включающая области с резус-D-специфическими сегментами CDR 1, CDR 2 и CDR 3 пар ДНК-последовательностей V_H и V_L, с одинаковыми идентификационными номерами, соответствующими определенным фигурам, как показано в таблице в п. 6.

8. ДНК-последовательность по п. 6 или 7, включающая области с ДНК-последовательностями V_H и V_L с идентификационными номерами, соответствующими определенным фигурам, как показано в таблице в п. 6.

9. ДНК-последовательность по п. 6, или 7, или 8, кодирующая полипептид, способный к образованию антигенсвязывающих Fab-фрагментов.

10. ДНК-последовательность по п. 6, или 7, или 8, кодирующая полипептид, способный к образованию полных антирезус-D-антител.

11. Способ получения полипептида, способного к образованию антигенсвязывающих структур, например Fab-фрагментов, со специфичностью к резус-D-антигенам, включающий в указанном порядке стадии: а) повторной иммунизации индивидуума, способного к образованию антирезус-D-антител, резус-D-положительными эритроцитами, b) выделения из индивидуума мононуклеарных клеток, с) выделения полной РНК из мононуклеарных клеток, d) получения кДНК посредством использования олиго(dT)-затравки и обратного транскрибирования мРНК с обратной транскриптазой М-МuLV и амплификации кДНК-набора посредством полимеразной цепной реакции с использованием семейства специфических затравок иммуноглобулиновых генов, е) создания фаговой представительной библиотеки посредством инсерции ДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепь Fab-полипептида, в фаговый вектор; ДНК для тяжелой цепи вставляют в рамку гена, кодирующего фаговый белок рIII, который допускает экспрессию слитого белка Fab-рIII на поверхности фага, f) трансформации бактериальных клеток полученными рекомбинантными плазмидами, культивирования трансформированных бактериальных клеток и коэкспрессии тяжелой и легкой цепи Fab на частицах ниточного фага, g) амплификации Fab-несущего фага в бактериях, h) отбора отдельных фаговых клонов посредством нескольких циклов пэннинга на резус-D-положительных эритроцитах, i) выделения плазмидной ДНК из отобранных клонов и вырезание срШ-гена, j) трансформации бактериальных клеток полученной плазмидой, культивирования трансформированных бактериальных клеток, экспрессирующих Fab, и выделение Fab-фрагментов.

12. Способ селекции полипептида, способного к образованию антигенсвязывающих структур со специфичностью к резус-D-антигенам и, в частности, демонстрирующего реактивность в отношении неполного резус-DVI-варианта, и без каких-либо признаков реактивности в отношении эритроцитов резус-отрицательных фенотипов, в частности, без каких-либо признаков реактивности против резус-аллелей С, с, Е и е, включающий в указанном порядке стадии: а) осуществления нескольких отрицательных абсорбций на следующих эритроцитах: фенотипе 1 (rr', Ccddee), обработанном бромелазой, фенотипе 1, необработанном бромелазой, фенотипе 2 (ryry, CCddEE), обработанном бромелазой, и фенотипе 2, необработанном бромелазой, b) осуществления положительной абсорбции на DVI+эритроцитах с или без обработки бромелазой, с) определения титра фага, связывающегося с DVI+эритроцитами, d) повторения стадий а), b) и с) до тех пор, пока титр фага, связывающегося с DVI+эритроцитами, не достигнет удовлетворительного уровня.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что полипептид, способный к образованию антигенсвязывающих структур, представляет Fab-фрагменты.

14. Полное антирезус-D-антитело с вариабельными областями тяжелой и легкой цепи, содержащее резус-d-специфические последовательности CDR 1, CDR 2 и CDR 3 пар аминокислотных последовательностей V_H и V_L, с одинаковыми или разными идентификационными номерами в соответствии с приведенной ниже таблицей (см. графическую часть).

15. Полное антирезус-D-антитело с вариабельными областями тяжелой и легкой цепи, содержащее резус-D-специфические последовательности CDR 1, CDR 2 и CDR 3 пар аминокислотных последовательностей V_H и V_L, с одинаковыми идентификационными номерами, как показано в таблице в п. 14.

16. Полное антирезус-D-антитело по п. 14 или 15, включающее пары аминокислотных последовательностей V_H и V_L, с идентификационными номерами, соответствующими определенным фигурам, как показано в таблице в п. 14.

17. Полное антирезус-D-антитело по п. 14, или 15, или 16, отличающееся тем, что иммуноглобулиновые константные области представляют, по меньшей мере, один из определенных фенотипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

18. Способ получения полного антирезус-D-антитела по любому из пп. 14-17, включающий в указанном порядке стадии: а) амплификации по отдельности членов пары из сегмента V-гена тяжелой цепи и сегмента V-гена легкой цепи, содержащей резус-D-специфические области CDR 1, CDR 2 и CDR 3, как показано на фигурах 1а-16b и 1b-16b соответственно, из кодирующей антирезус-D-Fab плазмиды посредством осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими затравками, b) получения по отдельности генов тяжелой цепи полного антирезус-D-иммуноглобулина и легкой цепи полного антирезус-D-иммуноглобулина в подходящих плазмидах, содержащих сегменты гена константной области иммуноглобулина, кодирующие любую из тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина γ1, γ2, γ3 и γ4 и легкую цепь κ или λ человеческого иммуноглобулина, и трансформации по отдельности полученных плазмид в подходящие бактерии Е. coli, и с) котрансфекции полученных плазмид в подходящие эукариотные клетки-хозяева, культивирования клеток, отделения нетрансформированных клеток, клонирования культур, селекции наилучшего продуцирующего клона, применения его в качестве производственной культуры и выделения полных антител из супернатанта клеточной культуры.

19. Фармацевтическая композиция, содержащая, по меньшей мере, один полипептид по п. 1, или 2, или 3, или, по меньшей мере, одно антирезус-D-антитело по любому из пп. 14-17 и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики гемолитической болезни новорожденных, для лечения идиопатической тромбоцитопенической пурпуры и при ошибках при переливании резус-несовместимой крови.

20. Диагностическое средство для резус-d-типирования, содержащее Fab-фрагменты по п. 4 или антирезус-D-антитела по любому из пп. 14-17.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125, Рисунок 126, Рисунок 127, Рисунок 128, Рисунок 129, Рисунок 130, Рисунок 131, Рисунок 132, Рисунок 133, Рисунок 134, Рисунок 135, Рисунок 136, Рисунок 137, Рисунок 138, Рисунок 139, Рисунок 140, Рисунок 141, Рисунок 142, Рисунок 143, Рисунок 144, Рисунок 145, Рисунок 146, Рисунок 147, Рисунок 148, Рисунок 149, Рисунок 150, Рисунок 151, Рисунок 152, Рисунок 153, Рисунок 154, Рисунок 155, Рисунок 156, Рисунок 157, Рисунок 158, Рисунок 159, Рисунок 160, Рисунок 161, Рисунок 162, Рисунок 163, Рисунок 164, Рисунок 165, Рисунок 166, Рисунок 167, Рисунок 168, Рисунок 169, Рисунок 170, Рисунок 171, Рисунок 172, Рисунок 173, Рисунок 174, Рисунок 175, Рисунок 176, Рисунок 177, Рисунок 178, Рисунок 179, Рисунок 180, Рисунок 181, Рисунок 182, Рисунок 183, Рисунок 184, Рисунок 185, Рисунок 186, Рисунок 187, Рисунок 188, Рисунок 189, Рисунок 190, Рисунок 191, Рисунок 192, Рисунок 193, Рисунок 194, Рисунок 195, Рисунок 196, Рисунок 197, Рисунок 198, Рисунок 199, Рисунок 200, Рисунок 201, Рисунок 202, Рисунок 203, Рисунок 204, Рисунок 205, Рисунок 206, Рисунок 207, Рисунок 208, Рисунок 209, Рисунок 210