Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками

 

Изобретение относится к способу получения предшественника инсулинов или инсулиновых производных с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества, отличающемуся тем, что следующие стадии проводят друг за другом: (а) смешивание водной суспензии предшественника инсулинов или инсулиновых производных с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое дает до 15 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника, (б) внесение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при значении рН 8 - 11,5 и температуре 15 - 55^oС, выдерживание полученной смеси в течение 10-60 мин при этой температуре и (в) внесение смеси при значении рН 8 - 11,5 и температуре 5 - 30^oС в количество воды, которое дает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества на 0,2-1,0 М. Способ обеспечивает высокий выход правильно уложенных предшественников инсулина или инсулиновых производных и низкое время реакции для процесса укладки. 12 з.п. ф-лы.

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества.

Человеческий инсулин представляет собой белок с двумя аминокислотными цепями, содержащими в общей сложности 51 аминокислотный остаток. В обеих аминокислотных цепях встречается шесть цистеиновых остатков, причем каждые два цистеиновых остатка соединены друг с другом дисульфидным мостиком (= дисульфидной мостиковой связью). В биологически активном человеческом инсулине цепи А и В соединены друг с другом двумя цистиновыми мостиками, и другой цистиновый мостик существует в цепи А. Таким образом, внутри молекулы человеческого инсулина имеется, с точки зрения статистики, 15 возможностей для образования дисульфидных мостиков. В биологически активном человеческом инсулине реализована лишь одна из 15 возможностей. Соединены друг с другом следующие цистеиновые остатки: А6-А11, А7-В7, А20-В19.

Буквы А и В обозначают соответствующую аминокислотную цепь инсулина, число обозначает положение аминокислотного остатка, занимаемое им в соответствующей аминокислотной цепи, считая в направлении от аминного к карбоксильному концу. Дисульфидные мостики могут быть образованы также между двумя молекулами человеческого инсулина, так что легко может образоваться необозримо большое количество различных дисульфидных мостиков.

Известный способ получения человеческого инсулина основан на применении человеческого проинсулина. Человеческий проинсулин является белком с линейной аминокислотной цепью, состоящей из 86 аминокислотных остатков, причем цепи А и В человеческого инсулина соединены друг с другом через С-пептид с 35 аминокислотными остатками. Образование встречающихся в человеческом инсулине дисульфидных мостиков происходит через промежуточный продукт, причем цистеиновые остатки человеческого инсулина содержат серозащитную группу, например, 3-сульфонатную группу (-S-SО₃) (см. Европейский патент ЕР 0037255). Далее, известен способ получения проинсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками (Biochemistry, 60, (1968), стр.622-629), который исходит из проинсулина, полученного из поджелудочной железы свиньи, в котором цистеиновые остатки присутствуют в виде тиольных остатков (-SH). Под понятием "правильно соединенные цистиновые мостики" подразумевают дисульфидные мостики, которые существуют в биологически активном инсулине из млекопитающих.

Генно-инженерные способы позволяют получать предшественники инсулина и инсулиновые производные, в частности, человеческий проинсулин или проинсулин, имеющий аминокислотную последовательность и/или длину аминокислотной цепи, отличные от таковых человеческого инсулина, в микроорганизмах. Проинсулины, произведенные клетками Escherichia coli, модифицированными с помощью генной инженерии, не имеют правильно соединенных цистиновых мостиков. Способ получения человеческого инсулина с помощью Е. coli (EP 0055945) основывается на стадиях ферментации микроорганизмов - растворение клетки - выделение слитого белка - галогенциановое расщепление слитого белка - выделение продукта расщепления с проинсулиновой последовательностью - защита цистеиновых остатков проинсулина с помощью S-сульфонатных групп - хроматографическая очистка S-сульфоната - образование правильно соединенных цистиновых мостиков - обессоливание проинсулина - хроматографическая очистка проинсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками - концентрирование раствора проинсулина - хроматографическая очистка концентрированного раствора проинсулина - ферментативное расщепление проинсулина для получения человеческого инсулина - хроматографическая очистка полученного человеческого инсулина.

Недостатками этого способа являются большое число стадий и потери на стадиях очистки, которые приводят к невысокому выходу инсулина. Из-за многостадийности способа приходится мириться со значительными потерями. Начиная со стадии выделения слитого белка и далее на стадиях галогенцианового расщепления, сульфитолиза и очистки проинсулина потери проинсулина составляют до 40% (EP 0055945). Такие же высокие потери могут происходить в ходе последующих стадий очистки вплоть до получения конечного продукта.

Повышение выхода продукта при генно-инженерном получении человеческого инсулина или инсулиновых производных может быть достигнуто в том случае, если количество необходимых стадий процесса будет существенно уменьшено.

Из Европейского патента ЕР 0600372 А1 (соответственно из патента США US 5473049) и Европейского патента ЕР 0668292 А2 известен усовершенствованный соответствующим образом способ получения инсулинов или инсулиновых производных, в котором инсулиновый предшественник или предшественник инсулинового производного, имеющий неправильно соединенные цистиновые мостики, подвергают взаимодействию в присутствии меркаптана, например цистеина, и по меньшей мере одного хаотропного вспомогательного вещества, например мочевины или гуанидингидрохлорида, с получением инсулинового предшественника, соответственно предшественника инсулинового производного, с правильно соединенными цистиновыми мостиками. В известном способе эти белки вначале растворяют в водных растворах хаотропного вспомогательного вещества или смесей различных хаотропных вспомогательных веществ в очень низкой концентрации. Затем смесь белков смешивают с водным раствором меркаптана.

Неожиданно было установлено, что выход правильно уложенных предшественников инсулина или инсулиновых производных может быть повышен, и время реакции для процесса укладки может быть сокращено тем, что предшественник растворяют с помощью хаотропного вспомогательного вещества не на первой стадии, но, что прежде всего в водную суспензию предшественника вводят меркаптан, а именно цистеин или цистеингидрохлорид, и лишь на следующей стадии растворяют предшественник, внося его в водный раствор хаотропного вспомогательного вещества, и, наконец, осуществляют правильную укладку предшественника путем разбавления смеси до предпочтительной концентрации цистеина, соответственно цистеингидрохлорида, внося смесь в соответствующее количество воды.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу получения предшественника инсулинов или инсулиновых производных с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества, отличающемуся тем, что следующие стадии проводят друг за другом: (а) смешивание водной суспензии предшественника инсулинов или инсулиновых производных с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое дает до 15 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника, (б) внесение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН от 8 до 11,5 и температуре от 15 до 55^oС, выдерживание полученной смеси в течение 10-60 мин при этой температуре и (в) внесение смеси при рН от 8 до 11,5 и температуре от 5 до 30^oС в количество воды, которое обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества на 0,2-1,0 М.

Предпочтительно способ отличается тем, что на стадии (а) количество цистеина или цистеингидрохлорида соответствует количеству, которое дает 1-6 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника, на стадии (б) цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащую суспензию предшественника вносят в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН от 8 до 11 и температуре от 30 до 45^oС, полученную смесь выдерживают при этой температуре в течение 20-40 мин и на стадии (в) смесь вносят при рН от 8 до 11 и температуре от 15 до 20^oС в количество воды, которое дает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до 1-5 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,2-1,0 М.

Хаотропные вспомогательные вещества представляют собой соединения, которые в водном растворе разрушают водородные мостиковые связи, например, сульфат аммония, гуанидин-гидрохлорид, этиленкарбонат, тиоцианат, диметилсульфоксид и мочевина.

В способе согласно изобретению в качестве хаотропного вспомогательного вещества предпочтительно применяется гуанидин, гуанидингидрохлорид или, особенно предпочтительно, мочевина.

В способе согласно изобретению концентрация хаотропного вспомогательного вещества составляет на стадии (б) предпочтительно от 7,0 до 9 М, температура на стадии (б) равна предпочтительно 40^oС и рН на стадии (б) предпочтительно находится в пределах 10-11.

В способе согласно изобретению рН на стадии (в) предпочтительно находится в пределах 10-11. Количество воды, в которое вносят смесь, на стадии (в) способа согласно настоящему изобретению предпочтительно выбирают так, чтобы оно давало разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до приблизительно 2,5-3 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,5 М.

Особенно предпочтительно способ согласно изобретению отличается тем, что концентрация хаотропного вспомогательного вещества составляет на стадии (б) 8 М, температура на стадии (б) равна 40^oС и рН на стадии (б) равен 10,6, рН на стадии (в) равен 10,6 и количество воды на стадии (в) обеспечивает разбавление концентрации цистеина и цистеингидрохлорида в смеси до 2-3 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,5 М.

Результатом способа согласно настоящему изобретению является предшественник инсулинов или инсулиновых производных, в частности, проинсулин, цистиновые мостики которого соединены правильно.

Инсулиновые производные представляют собой производные встречающихся в природе инсулинов, а именно человеческого инсулина (см. Последовательность SEQ ID NO 1=A цепь человеческих инсулинов; см. Последовательность SEQ ID NO 2= B цепь человеческих инсулинов, протокол последовательностей) или животных инсулинов, которые отличаются от соответствующих, в остальном таких же встречающихся в природе инсулинов, замещением по меньшей мере одного встречающегося в природе аминокислотного остатка и/или присоединением по меньшей мере одного аминокислотного остатка и/или органического остатка.

Из полученного по способу согласно настоящему изобретению предшественника инсулинов, соответственно инсулиновых производных с правильно соединенными цистиновыми мостиками в конечном итоге согласно способу, описанному в ЕР 0600372 А1 (соответственно US 5473049), путем ферментативного расщепления с помощью трипсина или аналогичного трипсину фермента и, при необходимости, дополнительно с помощью карбоксипептидазы В с последующей очисткой на адсорбирующей смоле, могут быть получены инсулин или инсулиновое производное с правильно соединенными цистиновыми мостиками.

Инсулин или инсулиновое производное, получаемые из предшественника, могут быть описаны предпочтительно формулой I:
где обозначают:
Y - генетически кодируемый аминокислотный остаток,
Z а) аминокислотный остаток из группы His, Arg или Lys,
б) пептид с 2 или 3 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток Arg или Lys на карбоксильном конце пептида,
в) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистадиновых остатков, или
г) ОН,
R¹ - фенилаланиновый остаток (Phe) или ковалентную связь,
R³ - генетически кодируемый аминокислотный остаток,
причем не указанные в целях упрощения формулы I остатки А2-А20 соответствуют аминокислотной последовательности цепи А человеческого инсулина, животного инсулина или инсулинового производного и не указанные в целях упрощения формулы I остатки В2-В29 соответствуют аминокислотной последовательности цепи В человеческого инсулина, животного инсулина или инсулинового производного.

Аминокислотная последовательность пептидов и белков обозначается, начиная от N-терминального конца аминокислотной цепи. Сделанные в формуле I указания в скобках, например, А6, А20, B1, B7 или В19, соответствуют положению аминокислотных остатков в цепях А или В.

Понятие "генетически кодируемый аминокислотный остаток" включает в себя аминокислоты Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro и селеноцистеин.

Под понятиями "остатки А2-А20" и "остатки В2-В29" животного инсулина подразумеваются, например, аминокислотные последовательности инсулина из крупного рогатого скота, свиней или кур. Понятие "остатки А2-А20" и "В2-В29" инсулиновых производных охватывают соответствующие аминокислотные последовательности человеческого инсулина, которые образуются путем обмена аминокислот с другими генетически кодируемыми аминокислотами.

Цепь А человеческого инсулина имеет, например, следующую последовательность (SEQ ID NO: 1):
Cly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
Glu Asn Tyr Cys Asn.

Цепь В человеческого инсулина имеет, например, следующую последовательность (SEQ ID NO: 2):
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
Leu Val Cys Gly Glu Arg Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr.

При этом в формуле I R³ обозначает аспарагин (Asn), R¹ - фенилаланин (Phe), Y - треонин (Thr) и Z - ОН.

В соответствии с вышеизложенным способ согласно настоящему изобретению особенно пригоден для получения предшественника инсулинов или инсулиновых производных общей формулы II, цистиновые мостики которого (в формуле I не показаны) уложены правильно,
R²-R¹-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R³ (II),
где обозначают:
R² а) атом водорода,
б) аминокислотный остаток из группы лизин (Lys) или аргинин (Аrg) или
в) пептид с 2-45 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Аrg) на карбоксильном конце пептида,
R¹ - фенилаланиновый остаток (Phe) или ковалентную связь,
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина, животного инсулина или необязательно модифицированного в одном или нескольких из этих положений инсулинового производного,
Y - генетически кодируемый аминокислотный остаток,
Х а) аминокислотный остаток из группы лизин (Lys) или аргинин (Arg),
б) пептид с 2-35 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Arg) на N-терминальном и на карбоксильном конце пептида,
в) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистидиновых остатков,
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи A человеческого инсулина, животного инсулина или необязательно модифицированного в одном или нескольких из этих положений инсулинового производного и
R³ - генетически кодируемый аминокислотный остаток.

1. Предпочтительно в формуле II обозначают:
R² а) атом водорода или
б) пептид с 2-25 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток аргинин (Arg) на карбоксильном конце пептида,
R¹ - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина,
Y - аминокислотный остаток из группы аланин (Ala), треонин (Thr) или серии (Ser),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Arg) или пептид с аминокислотной последовательностью цепи С человеческого инсулина,
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи А человеческого инсулина и
R³ - аминокислотный остаток из группы аспарагин (Asn), серин (Sеr) или глицин (Gly).

Цепь С человеческого инсулина имеет следующую последовательность (SEQ ID NO: 3):
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
Gln Lys Arg.

2. Предпочтительно в формуле II обозначают:
R² а) атом водорода или
б) пептид с 2-15 аминокислотными остатками, на карбоксильном конце которого находится аргининовый остаток (Arg);
R¹ - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина,
Y - треониновый остаток (Thr),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Arg) или пептид с 2-35 аминокислотными остатками, причем в начале и в конце пептида стоят два основных аминокислотных остатка, в частности, аргинин (Arg) и/или лизин (Lys),
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи В человеческого инсулина и
R³ - аминокислотный остаток аспарагин (Asn) или глицин (Gly).

Остаток Z инсулина или инсулинового производного формулы I является, как правило, частью аминокислотной последовательности Х предшественника формулы II и образуется в результате деятельности протеаз, таких как трипсин, трипсиноподобный фермент или карбоксипептидаза В.

Остаток R³ является аминокислотным остатком, который находится в положении А21 цепи А инсулина. Остаток Y является аминокислотным остатком, который находится в положении В30 цепи В инсулина.

Трипсин или трипсиноподобные ферменты являются протеазами, которые расщепляют аминокислотные цепи аргининового или лизинового остатков.

Карбоксипептидаза В является экзопротеазой, которая отщепляет основные аминокислотные остатки, такие как Аrg или Lys, находящиеся на карбокситерминальном конце аминокислотных цепей (Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246, стр.6786-6791).

Из названного в параграфе 1 предшественника может быть, например, получен инсулин, соответственно инсулиновое производное формулы I с правильно соединенными цистиновыми мостиками, причем Y, R¹, R², R³, A2-A20 и В2-В29 имеют указанное в параграфе 1 значение и Z обозначает аргининовый остаток (Аrg), пептидный остаток Аrg-Аrg или -ОН.

Из названного в параграфе 2 предшественника может быть, например, получен инсулин, соответственно инсулиновое производное формулы I с правильно соединенными цистиновыми мостиками, причем Y, R¹, R², R³, A2-A20 и В2-В29 имеют указанное в параграфе 2 значение и Z обозначает аргининовый остаток (Аrg), пептидный остаток Аrg-Аrg или Lys-Lys или -ОН.

Предшественник формулы II может быть образован с помощью множества генно-инженерных конструкций в микроорганизмах (ЕР 0489780, ЕР 0347781, ЕР 0453969). Генно-инженерные конструкции подвергают экспрессии в микроорганизмах, таких как Escherechia coli или Streptomyceten во время ферментации. Образовавшиеся белки откладывают внутри микроорганизмов (ЕР 0489780) или выделяют в ферментационный раствор.

Для способа согласно изобретению могут применяться предшественники инсулина или инсулиновых производных формулы II, которые непосредственно после растворения клетки еще загрязнены большим количеством примесей белков, попавших в них из ферментационного раствора или из микроорганизмов. Однако предшественники формулы II могут быть применены также, например, и в предварительно очищенной форме после осаждения или хроматографической очистки.

Пример 1 (Сравнительный пример, уровень техники)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherechia coli (EP 0489780) получают слитой белок со следующей аминокислотной последовательностью.

Последовательность 1 проинсулина (SEQ ID NO: 4):
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
Последовательность I проинсулина соответствует формуле II, при этом обозначают:
Х - С-пептид человеческого инсулина (SEQ ID NO: 3):
Y - Тhr(В3О),
R¹ - Phe (B1),
R² - пептид с 10 аминокислотными остатками;
R³ - Asn (A21) и
A2-A20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).

В клетках Е. coli накапливается экспрессированный слитой белок с проинсулиновой последовательностью 1 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.

20 кг выделенных телец-включений слитого белка (в пересчете на сухую массу после сушки вымораживанием; долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД); эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 1 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,6. После отделения небольших количеств взвешенных веществ с помощью центрифугирования прозрачный раствор (необязательно) замешивают в 9000 л водного раствора цистеина (5 кг гидрата цистеингидрохлорида) при рН 10,6 и температуре 4^oС. По окончании реакции укладывания приблизительно через 24 ч определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 1 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 3,0 кг, что соответствует степени конверсии 30%.

рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. НС1 на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 3 г трипсина. Образуется 1,25 кг инсулина с 2 карбокситермальными аргининовыми остатками согласно анализу, произведенному с помощью ЖХВД. После расщепления карбоксипептидазой В образуется человеческий инсулин, который подвергается дальнейшей очистке хроматографическими методами.

Человеческий инсулин соответствует формуле I, при этом обозначают:
Y - Thr (B30),
Z - ОН,
R¹ - Phe (B1),
R³ - Asn (A21) и
А2-А20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).

Человеческий инсулин 2 состоит из SEQ ID NO: 1 и 2, связанных друг с другом правильно соединенными цистиновыми мостиками.

Раствор концентрируют, как описано в ЕР 0668292, с помощью адсорбирующей смолы и очищают. Элюат, содержащий инсулин 2, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.

Анализ с помощью ЖХВД
0,5 г белка растворяют в 40 мл раствора, состоящего из 6 М гуанидингидрохлорида, 50 мМ Tris, pH 8,5, 5 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), 1% 2-меркаптоэтанола, 10 мМ дитиотреитола при 95^oС в течение 2 мин и затем центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин. 0,02 мл прозрачной надосадочной жидкости помещают в хроматографическую колонку высокого давления.

Колонка: ®Nucleogel RP 300-5/46 (Macherey & Nagel, Аахен, Германия).

Градиент: буфер А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота (ТФУ); буфер Б: 0,09%-ная ТФУ в ацетонитриле.

Температура: 55^oС.

Общее время процесса: 40 мин.

Градиент характеризуется следующими количествами буфера В после соответствующих времен процесса:
10 мин 25%, 12 мин 60%, 13 мин 90%, 15 мин 100%.

Поток: 1 мл/мин.

Детектирование: 215 нм.

Время удержания инсулина: около 19 мин.

Пример 2 (Способ согласно настоящему изобретению)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherichia coli (EP 0489780) получают слитой протеин с показанной в примере 1 аминокислотной последовательностью (проинсулиновая последовательность 1 SEQ ID NO: 4). В клетках Е. coli накапливается экспрессированный белок с проинсулиновой последовательностью 1 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.

К водной суспензии слитого белка, содержащей 40 кг слитого белка (определение производилось путем сушки вымораживанием аликвота), добавляют 5 кг гидрата цистеингидрохлорида.

Суспензию (долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью ЖХВД; эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 1 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,2 и 40^oС. Прозрачный раствор замешивают в 9000 л воды при рН 10,6 и температуре 15^oС. По окончании реакции укладывания приблизительно через 24 ч определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 1 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 10,0 кг, что соответствует степени конверсии 50%.

рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. НС1 на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 10 г трипсина. Образуется 4 кг инсулина с 2 карбокситермальными аргининовыми остатками. После расщепления карбоксипептидазой В образуется человеческий инсулин (SEQ ID NO: 1 и 2 с правильно соединенными цистиновыми мостиками).

Раствор концентрируют с помощью адсорбирующей смолы и очищают.

Элюат, содержащий человеческий инсулин, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.

Пример 3 (Сравнительный пример, уровень техники)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherechia coli (EP 0489780) получают слитой белок со следующей аминокислотной последовательностью.

Последовательность 2 проинсулина (SEQ ID NO: 5):
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
Последовательность 2 проинсулина соответствует формуле II, при этом обозначают:
Х - С-пептид человеческого инсулина (SEQ ID NO: 3):
Y - Thr(B30),
R¹ - Phe (B1),
R² - пептид с 10 аминокислотными остатками,
R³ - Gly (A21) и
А2-А20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).

В клетках Е. coli накапливается экспрессированный слитой белок с проинсулиновой последовательностью 2 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.

20 кг выделенных телец-включений слитого белка (в пересчете на сухую массу после сушки вымораживанием; долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью ЖХВД. Эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 2 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,6 и 20^oС. Прозрачный раствор замешивают в 9000 л водного раствора цистеина (5 кг гидрата цистеингидрохлорида) при рН 10,6 и температуре 4^oC. По окончании реакции укладывания приблизительно через 24 ч определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 2 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 3,0 кг, что соответствует степени конверсии 30%.

рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. НС1 на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 3 г трипсина. Образуется 0,98 кг инсулинового производного с 2 карбокситермальными аргининовыми остатками согласно анализу, произведенному с помощью ЖХВД. Это инсулиновое производное соответствует формуле I, причем обозначают:
Y - Thr (B30),
Z - Аrg-Аrg,
R¹ - Phe(B1),
R³ - Gly (A21) и
А2-А20 - аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 - аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29),
и состоит из SEQ ID NO: 6 и 7, связанных друг с другом правильно соединенными цистиновыми мостиками.

Раствор концентрируют с помощью адсорбирующей смолы и очищают.

Элюат, содержащий инсулиновое производное, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.

Пример 4 (Способ согласно настоящему изобретению)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherichia coli (EP 0489780) получают слитой протеин с аминокислотной последовательностью согласно примеру 1 (SEQ ID NO: 5).

В клетках Е. coli накапливается экспрессированный слитой белок с проинсулиновой последовательностью 2 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.

К водной суспензии слитого белка, содержащей 40 кг слитого белка (определение производилось путем сушки вымораживанием аликвоты), добавляют 5 кг гидрата цистеингидрохлорида.

Суспензию (долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью ЖХВД; эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 2 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,2 и 40^oС. Прозрачный раствор замешивают в 9000 л воды при рН 10,6 и температуре 15^oС. По окончании реакции укладывания приблизительно через 5 ч определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 1 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 10,0 кг, что соответствует степени конверсии 50%.

рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. НС1 на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 10 г трипсина. Образуется 2,8 кг инсулинового производного (анализ с помощью ЖХВД), состоящего из последовательностей SEQ ID NO: 6 и 7, связанных между собой правильно соединенными цистиновыми мостиками.

Раствор концентрируют с помощью поглощающей смолы и очищают.

Элюат, содержащий инсулиновое производное, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.

Формула изобретения

1. Способ получения предшественника инсулинов или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества, отличающийся тем, что проводят следующие друг за другом стадии: (а) смешивание водной суспензии предшественника инсулинов или производных инсулина с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое дает 1-15 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника, (б) внесение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН = 8 - 11,5 и температуре 15 - 55^oС, выдерживание полученной смеси в течение 10-60 мин при этой температуре, (в) внесение смеси при рН = 8 - 11,5 и температуре 5 - 30^oС в количество воды, которое обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества на 0,2 -1,0 М.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (а) количество цистеина или цистеингидрохлорида соответствует количеству, которое дает 1- 6 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника, на стадии (б) цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащую суспензию предшественника вносят в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН = 8 - 11 и температуре 30 - 45^oС, полученную смесь выдерживают при этой температуре в течение 20-40 мин, на стадии (в) внесение смеси осуществляют при рН = 8 - 11 и температуре 15 - 20^oС в количество воды, которое обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,2 - 1,0 М.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что хаотропным вспомогательным веществом является гуанидин или гуанидингидрохлорид.

4. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что хаотропным вспомогательным веществом является мочевина.

5. Способ по одному из нескольких пп.1-4, отличающийся тем, что концентрация хаотропного вспомогательного вещества на стадии (б) составляет 7,0 - 9 М.

6. Способ по одному из нескольких пп.1-5, отличающийся тем, что температура на стадии (б) составляет 40^oС.

7. Способ по одному из нескольких пп.1-6, отличающийся тем, что рН на стадии (б) составляет 10-11.

8. Способ по одному из нескольких пп.1-7, отличающийся тем, что рН на стадии (в) составляет 10-11.

9. Способ по одному из нескольких пп.1-8, отличающийся тем, что на стадии (в) количество воды обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 2,5-3 мМ и концентрации хаотропного вспомогательного вещества на 0,5 М.

10. Способ по одному из нескольких пп.2-9, отличающийся тем, что концентрация хаотропного вспомогательного вещества на стадии (б) составляет 8 М, температура на стадии (б) 40^oС, рН на стадии (б) 10,6, рН на стадии (в) 10,6 и количество воды на стадии (в) обеспечивает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 2,5-3 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,5 М.

11. Способ по одному из нескольких пп. 1-10, отличающийся тем, что предшественник инсулинов или производных инсулина имеет последовательность согласно общей формуле II
R²-R¹-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R³, (ll)
где R² - пептид с 2-45 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Аrg) на карбоксильном конце пептида;
R¹ - фенилаланиновый остаток (Phe);
(В2-В29) аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или, в случае необходимости, модифицированного в одном или нескольких из этих положений производного инсулина;
Y - генетически кодируемый аминокислотный остаток;
Х - пептид с 2-35 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Аrg) на N-терминальном и на карбоксильном конце пептида;
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или, в случае необходимости, модифицированного в одном или нескольких из этих положений производного инсулина;
R³ - генетически кодируемый аминокислотный остаток.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в формуле II обозначают:
R² - пептид с 2-25 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток аргинин (Arg) на карбоксильном конце пептида,
R¹ - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина,
Y - аминокислотный остаток из группы аланин (Аla), треонин (Thr) или серин (Ser),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Аrg) или пептид с аминокислотной последовательностью С-цепи человеческого инсулина,
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина,
R³ - аминокислотный остаток из группы аспарагин (Asn), серин (Ser) или глицин (Glу).

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что в формуле II обозначают:
R² - пептид с 2-15 аминокислотными остатками, на карбоксильном конце которого находится аргининовый остаток (Arg),
R¹ - фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) - аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина,
Y - треониновый остаток (Thr),
Х - аминокислотный остаток аргинин (Аrg) или пептид с 2-35 аминокислотными остатками, причем в начале и в конце пептида стоят два основных аминокислотных остатка, в частности аргинин (Аrg) и/или лизин (Lys),
(А2-А20) - аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина,
R³ - аминокислотный остаток аспарагин (Asn) или глицин (Glу).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6