Штамм "о" вируса инфекционного ларинготрахеита птиц для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Исходный вирус для получения штамма "О" выделен из гортани и трахеи курицы с признаками латентной формы заболевания в Казахстане в 1992 г. Производственный штамм "О" получен путем многократных последовательных пассажей на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ВГНКИ 05.06.2000г. под регистрационным наименованием "О 112-ДЕП". Штамм проявляет высокую биологическую, иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм культивируют в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур, причем на 3-6 сутки культивирования он достигает титра инфекционности не менее 6,2 Ig ЭИД₅₀/см³. Штамм обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью как в нативном, так и инактивированном виде и пригоден для изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцинных препаратов для окулярного и орального способов иммунизации. 6 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и производстве средств диагностики и специфической профилактики инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) птиц.

ИЛТ - острое контагиозное заболевание птиц - является причиной высокого процента смертности (обычная смертность составляет 10-20%, известны случаи высокой смертности, которая составляет 50-70%), у переболевших особей снижается суточный привес и яйценоскость. ИЛТ вызывается герпес-вирусом. В комплексе мер борьбы с ИЛТ одним из основных средств является вакцинация с помощью живых и инактивированных вакцин.

Преимущества вирус-вакцин состоят в том, что они пригодны для массового применения путем выпаивания, аэрозольного распыления и т.д., для иммунизации птиц требуется относительно малое количество иммунизирующего препарата, так как живой антиген продолжает размножаться в организме иммунизированной птицы, они являются более дешевыми в производстве и для их хранения требуется относительно мало места в холодильных установках.

В мировой практике известно более 20 штаммов вируса ИЛТ птиц, используемых для изготовления вакцинных препаратов (1-6). Известные штаммы вируса ИЛТ различаются по вирулентности для птиц и куриных эмбрионов (КЭ), тропизму, скорости выделения из клеток в тканевой культуре, устойчивости при хранении, авидности, молекулярно-структурными особенностями, отклонениями штаммов различной вирулентности в способности нейтрализоваться гипериммунными сыворотками (7-9).

Известен штамм "Г" вируса ИЛТ, используемый для изготовления вакцинных препаратов (10).

Известен штамм "ЦНИИПП" вируса ИЛТ птиц, используемый для изготовления вакцинных препаратов (3).

Известен клон "НТ" штамма "ЦНИИПП" вируса ИЛТ птиц, используемый для изготовления вакцинных препаратов (11).

Недостатки известных штаммов состоят в их низкой иммуногенной активности. Вакцины из этих штаммов формируют иммунитет, который не способен защитить 100% птицепоголовья от заражения эпизоотическим вирусом ИЛТ.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм "ВНИИБП" вируса ИЛТ птиц, используемый для изготовления вакцинных препаратов (12).

Недостатки штамма-прототипа состоят в его низкой иммуногенной активности и повышенной реактогенности.

Учитывая большую информационную емкость генома вируса ИЛТ и разнообразие его фенотипических свойств, актуальной является проблема поиска новых вакцинных штаммов данного возбудителя, обладающих высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью, как в нативном, так и в инактивированном виде, а также низкой реактогенностью.

В задачу создания настоящего изобретения входило расширение арсенала штаммов вируса ИЛТ, обладающих высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью как в нативном, так и в инактивированном виде и пригодных для изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцинных препаратов для окулярного и орального способов иммунизации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов вируса ИЛТ птиц, обладающих высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью как в нативном, так и в инактивированном виде и пригодных для изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных, безвредных и аректогенных вакцинных препаратов для окулярного и орального способов иммунизации.

Указанный технический результат достигнут получением аттенуированного штамма "О" вируса ИЛТ птиц. Штамм является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма "О" выделен из гортани и трахеи курицы с признаками латентной формы заболевания в Казахстане в 1992 году. Производственный штамм "О" получен путем многократных последовательных пассажей на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур.

Штамм "О" депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 05.06.2000 г. под регистрационным наименованием "О 112-ДЕП".

Штамм "О" обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Штамм "О" вируса ИЛТ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства Штамм "О" вируса ИЛТ относится к семейству Herpesviridae. При электронной микроскопии (инструментальное увеличение 4,5 х 10⁵ и 5 х 10⁵) в поле зрения микроскопа наблюдают хорошо различимые вирусные частицы ИЛТ со свойственной им морфологией. Вирионы имеют сферическую форму, их размеры варьируют от 200 до 250 нм (у некоторых до 330 нм). Вирионы ИЛТ состоят из сферического нуклеокапсида, окруженного суперкапсидной оболочкой сложной формы. Вирион обладает икосаэдрическим типом симметрии. Икосаэдрический капсид покрыт липопротеидной оболочкой, имеющей на своей поверхности морфологические единицы-пепломеры. Диаметр нуклеокапсида равен 113±2 нм, усредненный диаметр нуклеокапсидной оболочки около 350 нм.

Нуклеокапсиды размером 100-110 нм располагаются в вирусной частице, как правило, эксцентрично, реже - в центре частиц. Геном вируса ИЛТ имеет длину 155000 полинуклеотидов и состоит из длинной уникальной последовательности И1 (120000 полинуклеотидов) и короткой уникальной последовательности Иs (17000 полинуклеотидов). Вирус содержит гликопротеины (205, 160, 115, 90, 85, 74, 60 и 50 кД). Гликопротеин В (gB) является первым структурным белком вируса ИЛТ.

Антигенные свойства Штамм "О" вируса ИЛТ стабильно нейтрализуется гомологичной сывороткой, идентифицируется в сыворотках крови кур, содержащих антитела к данному вирусу, в РДП, РН и ИФА. В РДП идентифицируется гомологичными гипериммунными сыворотками в титре 1:8. В РН индекс нейтрализации гомологичными гипериммунными сыворотками в разведениях 1: 10 и 1:20 в среднем составляет 3.8 Ig ЭИД₅₀/см³ соответственно. В ИФА идентифицируется полевым и лабораторными гипериммунными сыворотками в титре до 1:24579. Антигенные различия штамма "О" по отношению к другим штаммам вируса ИЛТ не установлены. Гемагглютинирующими свойствами штамм не обладает.

Биотехнологические характеристики Штамм "О" проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм "О" используют для изготовления живой и инактивированной вакцины против ИЛТ птиц и диагностических препаратов. Вирус имеет выраженный тропизм к эпителиальным клеткам слизистой оболочки гортани, трахеи и клоаки птиц. Штамм культивируют в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур. Репродукция вируса происходит в ткани хориоаллантоисной оболочки (ХАО). Инфекционный титр вируса в 10-20% суспензии ХАО на 5 сутки культивирования при условии генерализованного распространения по всей оболочке составляет не менее 6,2 Ig ЭИД₅₀/см³.

Хемо- и генотаксономическая характеристика Штамм "О" является ДНК-содержащим вирусом.

Устойчивость к внешним факторам Вирус чувствителен к липолитическим агентам, теплу и различным дезинфектантам. Температура 55^oС разрушает вирус в течение 10-15 мин, а 38^oС - за 48 ч. В замороженных тушках больных и вынужденно убитых кур, хранившихся при температуре минус 10, 18 и 28^oС, вирус оставался активным более 19 месяцев, на поверхности скорлупы в условиях термостата инактивируется через 12 ч, а в зараженных птичниках сохраняется не более 9 дней. Полностью инактивируется в 1% растворе креола в течение 30 с. Он длительно сохраняет свою активность в лиофилизованном состоянии или при минус 20-60^oС. В лиофилизованном гомогенате ХАО вирус сохраняет инфекционность не менее 1,5 лет. В замороженной ткани ХАО инфекционность вируса сохраняется не менее 4 лет.

Иммуногенность штамма При вакцинации кур старше 15-дневного возраста окулярным способом в дозе 1000 ЭИД₅₀ и оральным способом (выпойкой) в дозе 4000 ЭИД₅₀ индуцирует выработку специфических антител и создает иммунитет против ИЛТ у 100% вакцинированных кур. В лиофилизованном гомогенате ХАО вирус сохраняет иммуногенность не менее 1,5 лет.

Эпизоотичность штамма При совместном содержании вакцинированных и интактных птиц передача вакцинного вируса штамма "О" по контакту не установлена.

Условия поддержания штамма Лиофилизованный материал из штамма "О" хранят при температуре 4^oС, вируссодержащие ХАО - при температуре не выше минус 40^oС. Для лиофилизации используют стабилизатор "ВНИИЗЖ". Для ресуспендирования лиофилизованного вируса используют изотонический фосфатно-буферный раствор рН 7,4-7,6.

Генетическая чистота После 20 пассажей на ХАО 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур каких-либо изменений иммунобиологических свойств штамма "О" не установлено.

Дополнительные признаки и свойства
Реактогенность отсутствует.

Патогенность отсутствует.

Вирулентность отсутствует.

Онкогенность отсутствует.

Контагиозность отсутствует.

Стабильность аттенуации отмечена при проведении 4 пассажей на чувствительных цыплятах.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "О" вируса ИЛТ по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ИЛТ.

По мнению заявителя предлагаемый штамм соответствует условиям патентноспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования.

ПРИМЕР 1.

Матровую расплодку вируса ИЛТ на эмбрионах SPF-кур получают следующим образом.

В скорлупе куриного эмбриона со стороны воздушной камеры образуют отверстие диаметром 8-10 мм. В подскорлупной оболочке и ХАО инъекционной иглой производят четыре прокола в углы мнимого квадрата с диагональю около 5 мм, после этого наносят вируссодержащий материал из штамма "О" в объеме 0,1 см³. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем. Инфицированные эмбрионы инкубируют в течение 5 суток, на 6 сутки определяют характерные для вируса ИЛТ поражения ХАО. Из пораженных ХАО готовят 15-30% суспензию, которую промораживают и освобождают от крупнодисперсных частиц низкоскоростным центрифугированием. Полученную вируссодержащую жидкость с биологической активностью не меньше 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³ используют в качестве матровой расплодки для массового заражения 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур.

ПРИМЕР 2.

Вирус-вакцину против ИЛТ птиц из аттенуированного штамма "О" готовят следующим образом.

На первом этапе готовят матровый материал из производственного штамма "О" вируса ИЛТ птиц так, как описано в примере 1. Вируссодержащую суспензию, полученную из пораженных ХАО, используют для массового заражения 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур. Заражение эмбрионов производят проколом через воздушную камеру под ХАО в аллантоисную полость на глубину 3-6 мм. Объем инокулята равен 0,2 см³ и инкубируют в течение 3-6 суток при 37,7^oС и влажности 60%. По результатам овоскопии и последующего вскрытия определяют наличие характерных для вируса ИЛТ поражений ХАО. Пораженные ХАО используют в качестве вируссодержащего материала. Из пораженных ХАО готовят 15-30% суспензию, которую промораживают и освобождают от крупнодисперсных частиц низкоскоростным центрифугированием. Вируссодержащую надосадочную жидкость осторожно сливают в стерильных условиях, а затем в нее добавляют стабилизатор, в качестве которого можно использовать (отдельно или в комбинации) обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др. Вируссодержащую жидкость и стабилизатор смешивают в соотношении, по меньшей мере, 17:3-19:1. Полученную смесь расфасовывают во флаконы, промораживают при температуре минус 60-80^oС и подвергают лиофилизации. Лиофилизованный материал закупоривают под вакуумом и подвергают исследованию на иммуногенную активность окулярным и оральным способами вакцинации по 1000 и 4000 ЭИД₅₀ соответственно и на безвредность окулярным и оральным способами инокуляции по 10000 и 40000 ЭИД₅₀ соответственно.

Полученная вакцина при титровании на 10-суточных эмбрионах SPF-кур имеет титр от 6,2 до 6,6 Ig ЭИД₅₀/см³.

Полученная вакцина представляет собой лиофилизованный гомогенат вируссодержащих ХАО эмбрионов SPF-кур, который имеет вид однородной мелкопористой структуры бежевого цвета в виде цилиндрической таблетки, растворимой в воде или специальном растворителе.

Перед применением вирус-вакцину разводят разбавителем, который представляет собой 5% раствор глицерина в фосфатно-буферном растворе, помеченный нейтральным пищевым красителем типа индигокармина, и предназначен для приготовления рабочего разведения вакцины при окулярным способе иммунизации птицы и доведения значения рН воды, близкого к нейтральному или слабощелочному, при оральном способе иммунизации.

Вакцинации подлежит клинически здоровая птица старше 15-суточного возраста. Птицу до 60-суточного возраста вакцинируют дважды с интервалом 14 суток. Иммунитет формируется через 7 дней после ревакцинации. Повторную вакцинацию проводят через каждые 6 месяцев.

ПРИМЕР 3.

Проведены испытания иммуногенной активности вирус-вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2. Определение иммуногенной активности вакцины проводили на цыплятах. Для этого предварительно приготовили разведения вакцины на разбавителе: для окулярного метода иммунизации так, чтобы 0,05 см³ (объем одной капли) содержал 1000 ЭИД₅₀, для орального - чтобы в 1 см³ содержалось 4000 ЭИД₅₀. В опыт взяли 50 цыплят и из них 20 иммунизировали окулярно (по 1 капле в глаз), 20 - орально (выпаивали по 1 см³), а 10 цыплят оставили для контроля. Через 18 суток после вакцинации подопытных и контрольных цыплят заражали вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ птиц. Вирус вводили интратрахеально в дозе 500 ЭИД₅₀ в объеме 0,5 см³. За цыплятами наблюдали в течение 10 суток. Вакцина считается иммуногенной, если она предохраняет от заболевания ИЛТ по 16 цыплят из 20 вакцинированных. В контрольной группе должно заболеть с признаками ИЛТ не менее 8 цыплят из 10 зараженных. Результаты испытаний приведены в таблице 1, которые свидетельствуют, что все три приготовленные серии вирус-вакцины против ИЛТ птиц из штамма "О" по всем испытанным параметрам соответствуют требованиям, заложенным в технические условия на препарат и практически одинаково эффективны при окулярном и оральном применении на птице. В контрольных группах цыплят заболеваемость ИЛТ была 100%, при этом летальность по 3 опытам составила 48,6%.

ПРИМЕР 4.

Инактивированную вакцину против ИЛТ готовят из штамма "О" вируса, выращенного в развивающихся эмбрионах SPF-кур так, как описано в примере 2. Полученный вирус инактивируют аминоэтилэтиленимином, сорбируют на аэросил А-300 с добавлением сапонина. Результаты исследований по определению иммуногенной активности инактивированной вакцины из штамма "О" представлены в табл. 2.

ПРИМЕР 5.

Диагностическую сыворотку готовят следующим образом. SPF-цыплятам 25-30-дневного возраста инокулируют орально или окулярно живую вакцину из штамма "О" вируса ИЛТ. Через 14 дней всем цыплятам вводят внутримышечно инактивированный антиген с масляным адъювантом, а через две недели цыплят обескровливают и получают гипериммунную активную сыворотку и определяют ее активность в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в табл. 3.

ПРИМЕР 6.

Диагностическую сыворотку готовят следующим образом. SPF-цыплятам 25-30-дневного возраста вводят орально или окулярно живую вакцину из штамма "О" вируса ИЛТ. Через 14 дней всем цыплятам инокулируют внутримышечно инактивированный антиген, используя в качестве адъюванта гидрофобный аэросил или гидрат окиси алюминия. Через две недели цыплят обескровливают, получают сыворотку и определяют ее активность в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в табл. 4.

ПРИМЕР 7.

Сухую диагностическую сыворотку готовят следующим образом. SPF-цыплятам 25-30-дневного возраста вводят орально живую вакцину из штамма "О" вируса ИЛТ. Через 21 день всем цыплятам инокулируют внутримышечно инактивированный антиген с масляным адъювантом. Через 7 дней инактивированный антиген вводят повторно и через 7 дней цыплят обескровливают, получают сыворотку и определяют ее активность. К полученной сыворотке добавляют стабилизирующие добавки и ее подвергают лиофилизации. Лиофилизованную сыворотку используют для набора ИФА. Результаты исследований сыворотки представлены в табл. 5.

ПРИМЕР 8.

Проведена сравнительная оценка иммуногенной активности вирус-вакцин против ИЛТ птиц, приготовленных из штаммов отечественного и зарубежного происхождения: вирус-вакцины "Laryngo-vac" (Голландия), вирус-вакцины из клона "НТ" штамма "ЦНИИПП", вирус-вакцины из штамма "ВНИИБП" и вирус-вакцины из штамма "О". Изучение эффективности указанных вакцин проводили на SPF-цыплятах 25-суточного возраста. Цыплятам вводили по одной дозе испытуемых вакцин орально и окулярно. Оценку эффективности вакцин проводили по результатам контрольного заражения вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 6.

Данные табл. 6 свидетельствуют о том, что при контрольном заражении вакцинированных цыплят вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ только вирус-вакцина из штамма "О" индуцировала формирование иммунитета к ИЛТ у 100% вакцинированных цыплят.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- штамм "О" вируса ИЛТ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- штамм "О" вируса ИЛТ, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригоден для изготовления диагностических и вакцинных препаратов;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение "Штамм "О" вируса ИЛТ птиц для изготовления диагностических и вакцинных препаратов".

Источники
1. Патент США 3331736; 167-78, 18.07.67 г.

2. Патент США 3444293; 167-78, 13.05.69 г.

3. Авт. свид. СССР 129791; 30h, 6; 1960 г.

4. Авт. свид. СССР 1750683, А 61 К 39/245, 30.07.92 г.

5. Патент РФ 2138290, А 61 К 39/245, 39/265, 35/78; 27.09.99 г.

6. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998, 672-683.

7. Glissen J.R. Proceedings, 1988, 137.

8. Goodwin M.A. et al. Avian Diseases, 1995, 39, 2,444.

9. Guo Peixuan et al. Virology, 1944, 202, 2, 771.

10. Бабкин В. Ф. и др. Ветеринария. Респ. мiжвiд. тематич. наук. 3б. Киев, 1975, вып. 42.14-19.

11. Дутко Ю.С., Шевченко А.А. и др. Иммунологическая эффективность вирус-вакцины против инфекционного ларинготрахеита кур. Ветеринария, 1991, 3, 32-34.

12. Малушко В.В., Соколов В.Д. и др. Опыт борьбы с инфекционным ларинготрахеитом. Птицеводство, 1983, 12, 21-23 (прототип).

Формула изобретения

Штамм вируса инфекционного ларинготрахеита птиц, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus, коллекция ВГНКИ "О 112-ДЕП" для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3