Днк-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса, вакцина против вируса клещевого энцефалита, способ предотвращения инфицирования млекопитающего вирусом клещевого энцефалита

 

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса, содержащий структурные гены, кодирующие протеины preM и Е вируса Langat, протеин С вируса Langat или москитного вируса и неструктурные гены москитного флавивируса. ДНК-конструкт используется в составе вакцины против вируса клещевого энцефалита. Вакцина против вируса клещевого энцефалита применяется в способе предотвращения инфицирования человека вирусом клещевого энцефалита. Вакцина обеспечивает стойкую защиту от последующего заражения вирусом клещевого энцефалита. 3 с. и 12 з.п. ф-лы, 7 табл., 7 ил.

Область изобретения Настоящее изобретение относится к химерической вирусной вакцине против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и других его вирулентных сородичей. Конкретнее, изобретение относится к химерическому вирусу, содержащему гены структурных протеинов рrеМ и Е вируса Langat (LGT), связанные с генами неструктурного протеина москитного флавивируса.

Уровень техники Семейство Flaviviridae охватывает, в рамках рода переносимых членистоногими флавивирусов, более шестидесяти антигенно-связанных вирусов, содержащих положительно закрученную РНК, многие из которых являются важными патогенами человека (Monath et al., Flavivimses, in Virology, B.N. Fields et al. , (Eds.), Raven Press New York, 961-1035, 1996). Среди них вирус москитной желтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирусы денге (ДЕН) и вирусы клещевого энцефалита (ВКЭ), причем последние являются эндемичными в большинстве европейских стран, России, Индии и северном Китае. ВКЭ передается исключительно клещами и может быть подразделен на два серологически различимых подтипа: восточный подтип (прототипический штамм Sofjin), преобладающий в Сибири и дальневосточных районах России, и западный подтип (прототипический штамм Neudoerfl), распространенный в восточной и центральной Европe. ВКЭ вызывает серьезное энцефалитное заболевание с коэффициентом смертности от 1 до 30%.

У всех флавивирусов одинаковая организация генома: 5'-С-preM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3', где первые три гена кодируют протеины капсида (С), премембраны (рrеМ) и оболочки (Е), а остальные гены кодируют неструктурные протеины. Гомологичность между москитными и клещевыми флавивирусами относительно низка. (Chambers et al., Annu. Rev. Microbiol. 44:649-688, 1990; Pletnev et al. . Virology 174:250-263, 1990). Однако гомологичность среди москитных флавивирусов и клещевых флавивирусов относительно высока (lacoco-Connors et al.. Virology 188:875-880, 1992).

Известны четыре серотипа вируса денге (тип 1 - тип 4), различаемые путем нейтрализации восстановления бляшки с помощью серотипно-специфических моноклональных антител и путем менее специфических тестов с помощью поликлональных сывороток (Bancroft et al.. Pan Am. Hith. Org. Sci. Publ. 375:175-178, 1979; Henchal et al.. Am. J. Trop. Med. Hyg. 31:548-555, 1982). Эти четыре серотипа вируса денге имеют одинаковую геномную организацию. Полные нуклеотидные последовательности определены для вируса денге типов 3 и 4 и нескольких штаммов вируса типа 2, в том числе для нейровирулентного для мышей Новогвинейского мутанта С (Mackow et al.. Virology 159:217-228, 1987; Zhao et al., Virology 155:77-88, 1986; Osatomi et al., Virology 176:643-647, 1990; Irie et al.. Gene 75:197-211, 1989; Mason et al., Virology 161:262-267, 1987; Hahn et al., 162:167-180, 1988).

Несмотря на значительное эволюционное расстояние между ДЕН и ВКЭ, был создан жизнеспособный химерный флавивирус, содержащий гены С-рrеМ-Е или рrеМ-Е структурного протеина вирулентного дальневосточного русского ВКЭ с остальными генами неструктурных протеинов и 5'- и 3'-некодирующими последовательностями, производными от ДЕН4 [ВКЭ(СМЕ)/ДЕН4 и ВКЭ(МЕ)/ДЕН4 соответственно] (Pletnev et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10532-10536, 1992).

ВКЭ(МЕ)/ДЕН4 сохраняет нейровирулентность для мышей своего ВКЭ-предка, от которого выведены его гены рrеМ и Е, но у него нет периферийной нейровирулентности ВКЭ, т.е. способности распространяться из периферийного положения в центральную нервную систему (ЦНС) и вызывать фатальный энцефалит. Однако мыши, ранее инокулированные химерным вирусом периферическим путем, имели полную сопротивляемость последующему внутрибрюшинному введению летальной дозы в высшей степени вирулентного ВКЭ. Нейровирулентность этой химеры была значительно снижена введением в ее рrеМ, Е или неструктурный вирусный протеин 1 (NS1) единственной мутации (Pletnev et al., J. Virol. 67:4956-4963, 1993). Эти аминокислотные замещения вызывали также ограничение вирусной репликации в тканевых культурах клеток как обезьян, так и москитов. Тем не менее парентеральная инокуляция этих дополнительно ослабленных химерных мутантов вызывала у мышей полную сопротивляемость фатальному энцефалиту, вызванному интрацеребральной инокуляцией нейровирулентной химеры ВКЭ(МЕ)/ДЕН4.

Вирус Langat (LGT) является наименее вирулентным из всех флавивирусов ВКЭ-комплекса, но тесно антигенно связан с сильно вирулентным дальневосточным ВКЭ (Calisher et al., J. Gen. Virol. 70:37-43, 1989; DeMadrid et al., J. Gen. Virol. 23:91-96, 1974; lacoco-Connors et al.. Virus Res. 43:125-136, 1996) и имеет высокий уровень гомологичности последовательности с ним (lacoco-Connors et al., Virology 188:875-880, 1992; Mandl et al.. Virology 185:891-895, 1991; Shamanin et al., J. Gen. Virol. 71:1505-1515, 1990). Вирус LGT тестировался в виде экспериментальной живой вакцины против ВКЭ в начале 70-х (Ilenko et al.. Bull. Wid. Hith. Org. 39:425-431, 1968; Mayer et al. , Acta. Virol. 19:229-236, 1975; Price et al.. Bull. Wid. Hith. Org. 42: 89-94, 1970). Несколько штаммов LGT, которые были ослаблены для мышей и обезьян, были выделены и протестированы на 800000 взрослых; однако клинические эксперименты были прерваны, когда вакцинация одной из наиболее ослабленных вакцин-кандидатов, вирусом Еланцева, была связана с очень низкой частотностью энцефалита, то есть один случай на 20000 вакцинаций (Mandl et al., выше).

В настоящее время доступна экспериментальная вакцина, вырабатываемая путем инактивации ВКЭ формалином; однако эта вакцина имеет несколько ограничений. К примеру, эта вакцина не является сильно иммуногенной, поэтому для вырабатывания защитной иммунной реакции тебуются повторные вакцинации. Даже, когда реакции антитела на вакцину присутствуют, вакцина не способна обеспечить защитные реакции на вирус у 20% населения. Поэтому остается необходимость в надежной, более эффективной вакцине против ВКЭ. Настоящее изобретение обеспечивает такую вакцину.

Раскрытие изобретения Одним из выполнении настоящего изобретения является жизнеспособный химерный рекомбинантный флавивирус, содержащий первый участок нуклеиновой кислоты, оперативно кодирующий структурные протеины рrеМ и Е вируса Langat, оперативно связанный со вторым участком нуклеиновой кислоты, оперативно кодирующим неструктурные протеины москитного флавивируса. Предпочтительно вирусом Langat является штамм ТР21 некультивированного вируса Langat или его более ослабленный мутант, штамм Е5 Langat. Предпочтительно москитным флавивирусом является вирус денге. В одном из аспектов этого предпочтительного выполнения вирусом денге является тип 4. Альтернативно москитным флавивирусом является вирус желтой лихорадки. В соответствии с другим аспектом этого предпочтительного выполнения первый участок нуклеиновой кислоты также оперативно кодирует протеин капсида москитного флавивируса или вируса Langat. В еще одном аспекте этого предпочтительного выполнения рекомбинантный флавивирус дополнительно содержит по меньшей мере одну мутацию. Предпочтительно рекомбинантный флавивирус вставляется в вектор экспрессии. Преимущественно вектор экспрессии является плазмидом.

Настоящее изобретение также обеспечивает клетку хозяина, стабильно трансформируемую рекомбинантным флавивирусом, описанным выше способом, обеспечивающим экспрессию упомянутого конструкта ДНК. Предпочтительно клетка хозяина является прокариотической. В другом аспекте этого предпочтительного выполнения вирус клещевого энцефалита выбирается из группы, состоящей из вирусов восточного подтипа, западного подтипа, омской геморрагической лихорядки, louping ill, кьязанурской лесной болезни, Negishi или Powassan.

Еще одно выполнение настоящего изобретения является вакциной против вируса клещевого энцефалита, содержащей химерический рекомбинантный флавивирус, описанный выше, в фармацевтически приемлемом носителе. Еще одним выполнением является вакцинация молокопроизводящих млекопитающих против инфицирования вирусом клещевого энцефалита. Еще одно выполнение настоящего изобретения охватывает иммуногенный состав, содержащий описанный выше химерический рекомбинантный флавивирус в фармацевтически приемлемом носителе.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ предотвращения ВКЭ-инфекции у млекопитающего, содержащий шаг введения млекопитающему эффективного предотвращающего ВКЭ количества химерического рекомбинантного флавивируса, причем этот химерический флавивирус содержит первый участок нуклеиновой кислоты, оперативно кодирующий структурные протеины С, рrеМ и Е вируса Langat или протеин С москитного флавивируса, и структурные протеины ргеМ и Е вируса Langat, оперативно связанный со вторым участком нуклеиновой кислоты, оперативно кодирующим неструктурные протеины москитного флавивируса, в фармацевтически приемлемом носителе. Предпочтительно млекопитающим является человек. Преимущественно шаг введения является интраназальным, чрескожным, подкожным, внутримышечным или внутривенным. В одном из аспектов этого предпочтительного выполнения эффективное предотвращающее ВКЭ количество составляет от приблизительно 1 г до приблизительно 1000 г. Способ может дополнительно содержать введение одной или нескольких усилительных инъекций химерического флавивируса.

Настоящее изобретение также предполагает способ стимулирования иммунной реакции, направленной против обсуждавшихся выше химерических рекомбинантных флавивирусов, у млеопитающих, содержащий шаг введения млекопитающему эффективного предотвращающего ВКЭ количества химерического рекомбинантного флавивируса, причем химерический флавивирус содержит первый участок нуклеиновой кислоты, оперативно кодирующий структурные протеины С, рrеМ и Е вируса Langat или протеин С москитного флавивируса, и структурные протеины рrеМ и Е вируса Langat, оперативно связанный со вторым участком нуклеиновой кислоты, оперативно кодирующим неструктурные протеины москитного флавивируса, в фармацевтически приемлемом носителе.

Краткое описание чертежей Фиг.1 показывает сравнение вирусов ВКЭ/ДЕН4 и ЛГТ/ДЕН4.

Фиг. 1А показывает расположение 5'-концевых последовательностей некодирующего участка (НКУ) ослабленного клещевого флавивируса LGT, штамм ТР21 (посл. 1), его более ослабленного производного LGT штамм Е5 (поcл. 2) и вирулентных ВКЭ-штаммов Sofjin (ВКЭС; посл. 3) и Neudoerfl (ВКЭН; посл. 4) и вирулентного североамериканского штамма Powassan (ПОВ; посл. 5). Нуклеотиды, идентичные последовательности штамма Е5 LGT, обозначены точками, а вводимые для совмещения разрывы показаны черточками. Номера последовательностей приводятся справа. Кодоны инициации и остановки подчеркнуты.

Фиг.1В показывает расположение 3'-концевых НКУ-последовательностей ослабленного клещевого флавивируса LGT, штамм ТР21 (поcл. 1), его более ослабленного производного LGT штамм Е5 (поcл. 2) и вирулентных ВКЭ-штаммов Sofjin (ВКЭС; поcл. 3) и Neudoerfl (ВКЭН; поcл. 4) и вирулентного североамериканского штамма Powassan (ПОВ; поcл. 5). Нуклеотиды, идентичные последовательности штамма Е5 LGT, обозначены точками, а вводимые для совмещения разрывы показаны черточками. Номера последовательностей приводятся справа. Кодоны инициации и остановки подчеркнуты.

Фиг. 2А-2С иллюстрируют рост родительских и химерических флавивирусов в клетках LLCMK2 человекообразных обезьян (фиг.2А), клетках Vero человекообразных обезьян (фиг.2В) и клетках москитов (фиг.2С). Инокуляты химерического вируса росли в клетках москитов. Инокуляты родительских вирусов LGT TP21 и Е5 росли в клетках Vero человекообразных обезьян. Инокуляты родительского вируса ДЕН4 для клеток москитов и клеток человекообразных обезьян росли соответственно в клетках москитов и клетках Vero человекообразных обезьян. Клетки LLCMK₂ или Vero человекообразных обезьян инфицировались: (i) вирусом ДЕН4, TP21 или Е5 при кратности инфекции (КИ), равной 0,01, или (ii) химерическим вирусом ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4 при КИ, равном 0,5. Клетки С6/36 москита инфицировались: (i) вирусом ДЕН4, ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4 при КИ, равной 0,01, или (ii) вирусом TP21 или Е5/ при КИ, равной 1000. Клетки были собраны в указанный день после инфицирования, и вирусный титр определялся анализом бляшки на тех же клетках, которые были использованы для изучения репликации вируса. Бляшки подсчитывались на седьмой или восьмой день после инфицирования. Уменьшение размера бляшки показывает, что вирусы проявляют ограниченный в росте фенотип.

Подробное описание предпочтительных выполнений Настоящее изобретение содержит наблюдение того факта, что химерические вирусы LGТ/ДЕН4, содержащие структурные протеины рrеМ и Е штаммов TP21 или Е5 LGT, обнаруживают ограничение в росте и образовании бляшек при инокуляции в клеточные культуры человекообразных обезьян. Е5 является более ослабленным производным TP21 (Thind et al., Amer. J. Epidemiol. 84:198-213, 1966), который отличается от него 24 нуклеотидами, вырабатывающими 11 изменений кодирования, четыре из которых - в протеине Е (Таблица 2). Эти химеры LGТ/ДЕН4 были по меньшей мере в 5000 раз менее нейровирулентными, чем родительские вирусы LGT в новорожденной мыши (Таблица 3). У этих химер также отсутствовала обнаруживаемая видимость нейроинвазионности после внутрибрюшинной инокуляции 10⁵ бляшкообразующих единиц (БОЕ) швейцарской мыши или 10⁷ БОЕ мыши SCID. Напротив, ТР21 или Е5 имели значения СД₅₀ у мыши SCID, равные 0,004 и 0,06 БОЕ соответственно. Несмотря на то что у химер отсутствовала обнаруживаемая нейроинвазионность, даже у мыши SCID внутрибрюшинная инокуляция 10 или 10³ БОЕ какого-либо из вирусов возбуждала LGT-нейтрализующие антитела и сопротивляемость фатальному энцефалиту, вызванные введением LGT TP2L Таким образом, конструкт LGТ/ДЕН4 полезен в качестве вакцины от любого штамма ВКЭ, в том числе восточного и западного подтипов, все из которых тесно антигенно связаны. Хотя для получения химерической вакцины использовался ДЕН4 как москитный вирус, подразумевается также использование других штаммов вируса денге (то есть типов 1, 2 и 3) из-за высокого уровня гомологичности последовательности и тесной антигенной связи этих других типов и типа 4. Дополнительно, использование химерической вакцины, содержащей кДНК неструктурного протеина любого москитного флавивируса (в том числе вируса желтой лихорадки), опционно содержащей протеин С москитного флавивируса или вируса Langat, в комбинации с кДНК LGT, кодирующей протеины рrеМ и Е, также соответствует объему изобретения. Эти химерические конструкты содержат мутации, вставки, исключения и замещения в любом из вирусных генов, который не понижает способность конструкта обеспечивать защитный иммунитет к введению вирулентного родительского вируса ВКЭ.

Полная нуклеотидная последовательность была определена для генома некультивированного LGT-вируса (штамм ТР21) и его более ослабленного производного Е5, полученного путем нескольких переносов в ткань эмбриона цыпленка. кДНК ДЕН4 полной длины использовалась для построения химерных конструктов вектора экспрессии LGТ/ДЕН4 путем замещения генами структурных или неструктурных протеинов LGT TP21 или LGT E5 соответствующих генов ДЕН4 с помощью общеизвестных из уровня техники в молекулярной биологии способов, описанных в таких источниках, как Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 1989). Только два из 16 протестированных химерических конструктов (показаны в Таблице 1А) оказались жизнеспособными, что определялось по их способности расти и вырабатывать в культуре вирусные частицы (Таблица 1Б). Эти два химерических вируса содержали гены рrеМ и Е штамма ТР21 или штамма E5 вируса LGT и все остальные последовательности вируса ДЕН4. Эти химеры отличались в своих производных от LGT последовательностях только четырьмя аминокислотными позициями в протеине Е (Таблица 2). Химерические вирусы ТР21/ДЕН4 и Е5/ДЕН4 анализировались с точки зрения эффективности их роста в клеточной культуре, нейровирулентности и нейроинвазионности (периферийной нейроинвазионности) для мышей, иммуногенности и эффективности защиты. Эти свойства сравнивались с такими же свойствами их родительских LGT, а также свойствами, ранее описанными для в высшей степени вирулентного, тесно связанного с ними ВКЭ.

Химеризация LGT TP21 или LGT E5 москитным ДЕН4 значительно уменьшает репликативную способность результирующего вируса в клетках человекообразных обезьян по сравнению с каким-либо из родительских вирусов. Также наблюдалось значительное снижение нейровирулентности при химеризации ТР21 или Е5 с помощью ДЕН4, с предположением, что это, возможно, является общим феноменом для вирусов группы клещевых флавивирусов. Таким образом, химерические вирусы проявляли сохранение очень низкой нейровирулентности своего родительского москитного ДЕН4, а не более высокую нейровирулентность для мышей своего родительского клещевого LGT-вируса.

Настоящее изобретение относится также к рекомбинантному химерическому ДНК-конструкту, содержащему фрагмент ДНК, кодирующий протеины рrеМ и Е LGT-вируса и неструктурные протеины вируса денге, и вектор. Этот фрагмент может кодировать некультивированные протеины или мутантные протеины, содержащие точечные мутации, вставки, исключения и тому подобное, которые не снижают надежности и эффективности вакцины, полученной из этого химерического конструкта. Надежность и эффективность любого такого химерического вируса могут быть определены с помощью описанных здесь способов без лишних экспериментов.

В еще одном выполнении настоящее изобретение относится к химерической вакцине против ВКЭ для людей, содержащей ДНК, кодирующую протеины рrеМ и Е некультивированных ТР21 и Е5 LGT и неструктурные протеины вируса денге. Эти химерические вакцины оцениваются на приматах (не людях) по: (1) репликативной эффективности, измеряемой степенью и продолжительностью виремии; (2) вирулентности, измеряемой нейрологическими симптомами после прямой интраназальной или интрацеребральной инокуляции, либо периферийной инокуляции; (3) иммуногенности, обозначаемой типом и величиной антительной реакции, следующей за вирусным инфицированием, удовлетворяющей иммуногенности и защитной эффективности; и (4) защитной эффективности, измеряемой сопротивляемостью заражению вирулентным вирусом клещевого энцефалита после иммунизации. Химерические вакцины, показывающие заметно сниженную вирулентность, но сохраняющие достаточную иммуногенность у обезьян, оценивались в ходе клинических тестов на людях.

Для использования в качестве вакцины химерические флавивирусы по изобретению составляют формулу с фармацевтически приемлемым наполнителем и парентерально вводятся в млекопитающее, предпочтительно в человека. "Фармацевтически приемлемый" означает, что агент должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами формулы, а также в смысле безопасности для пациента. Такими носителями являются фосфатно-буферный солевой (ФБС) раствор и лактатный раствор Рингера. Подразумеваемые режимы введения вакцины содержат внутрикожный, внутривенный, подкожный и любой другой маршрут, обеспечивающий введение вакцины в тело в периферической точке, то есть в кожу, мышцу, подкожную ткань и т.д. Количество вакцинного препарата, вводимого млекопитающему, обычно находится в пределах приблизительно от 1 до 1000 г, предпочтительно приблизительно от 50 г до 500 г. Способ может дополнительно содержать введение одной или нескольких усиливающих инъекций химерического флавивируса в количестве от приблизительно 1 г до приблизительно 1000 г. Несмотря на то что точное количество рекомбинантного вируса может варьироваться в зависимости от индивида, это количество может быть оптимизировано с помощью обычных экспериментов типа доза-реакция, хорошо известных специалистам.

Флавивирусы LGT и ДЕН4 были получены, химеризованы и оценены на нейровирулентность и защитную эффективность против заражения родительским LGT-вирусом, как описано в приводимых ниже примерах.

Пример 1 Источники вируса и выделение вирусов Штамм ТР21 некультивированного LGT был изначально выделен из клещей в Малайе в 1956 году (Gordon-Smith, Nature 178:581-582, 1956). Затем он был 11 раз перенесен в мозг мыши и два раза в клетки Vero человекообразных обезьян. LGT TP 21, используемый здесь, был получен от д-ра R. Shope (Yale University, New Haven, CT) из Собрания Рокфеллеровского центра. Ослабленный штамм Е5 LGT был получен из штамма ТР21 путем 42 переносов в семидневный эмбрион цыпленка и имел дополнительный перенос в клетки Vero человекообразных обезьян. (Thind et al., Amer. J. Epidemiol. 84:198-213, 1966; Thind et al., Amer. J. Epidemiol. 84:214-224, 1966). Этот вирус был получен от д-ра J. Huggins (USAMRIID, Frederick, MD). Вирусы Langat очищались от бляшки три раза на клетках Vero под мягким агаром до приготовления вирусного сырья, которое титровало •10⁹ бляшкообразующих единиц БОЕ/мл для вируса ТР21 и 1,2•10⁹ БОЕ/мл для вируса Е5. Клетки Vero выращивались при 37^oС в минимальной обязательной среде (МОС) Игла плюс 10% фетальная телячья сыворотка (ФТС) и инкубировались в атмосфере 5% СО₂. Вирус ДЕН4 (клон 2А), извлеченный из ДНК-конструкта полной длины генома штамма 814669 вируса денге типа 4, использовался в качестве родительского вируса ДЕН4 (Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A/ 88:5139-5143, 1991). Все эти вирусы общедоступны в научно-исследовательском сообществе.

Пример 2 Геномные последовательности вирусов Langat Очистка LGT и выделение его РНК проводились так, как было ранее описано для ВКЭ (Pletnev et al.. Virology 174:250-263, 1990). Первая нить кДНК была синтезирована с помощью системы Superscript^ТМ очистки обратной транскриптазы (GibcoBRL, Life Tecnologies) и синтетического нуклеотидного праймера, комплементарного к сохраненным 22 3'-концевым нуклеотидам штаммов ВКЭ (Mandl et al. , J. Virol. 65:4070-4077, 1991; Wallner et al.. Virology 213:169-178, 1995) или той же самой 3'-концевой последовательности генома вируса Powassan (Mandl et al.. Virology 194:173-184, 1993). Цепная реакция полимеразы (ЦРП) использовалась для усиления трех перекрывающихся фрагментов кДНК генома LGT TP21 или LGT E5. Последовательности праймеров ЦРП были выведены из опубликованного участка кодирования LGT TP21 (lacoco-Connors et al.. Virology 188: 875-880, 1992; Mandl et al.. Virology 185:891-895, 1991). Фрагмент ЦРП, соответствующий 5'-некодирующему участку, вырабатывался с помощью праймера, содержавшего первые 21 сохраненные 5'-концевые нуклеотиды генома ВКЭ (Dobrikova et al. , Bioorg. Chem. 21:528-534, 1995; Mandl et al., Virology 166:197-205, 1988; Mandl et al., J. Virol. 65:4070-4077, 1991). Все восходящие праймеры содержали сайт дробления Pvul. Каждый продукт ЦРП был клонирован в Е. coli BD1528 с помощью p5'-2(NotI, Xhol, HindIII) вектора (Cahour et al. , Virology 207:68-76, 1995). Полная нуклеотидная последовательность геномов TP21 и E5 определялась построением последовательностей трех перекрывающихся клонов кДНК на обеих нитях ДНК с помощью способа терминации дидезоксинулеотидной цепи (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467, 1977). Были построены последовательности для нескольких независимых клонов каждой трети генома.

Анализ последовательности показал, что геном ТР21 или Е5 составлял в длину 10940 или 10941 нуклеотид соответственно и содержал один открытый фрейм считывания, кодирующий полипротеин из 3414 аминокислот. Данные последовательности были ипользованы для обеспечения связи вируса LGT TP21 или Е5 с другими членами рода флавивирусов. Общая гомологичность протеиновых последовательностей LGT и дальневосточного подтипа ВКЭ (штамм Sofjin) составляла 84,2%. Напротив, общая гомологичность последовательностей LGT и ДЕН4, москитного флавивируса, составляла лишь 39,4%. Среди клещевых флавивирусов LGT и ВКЭ структурные протеины С, рrеМ и Е являются наименее схожими (74, 75 и 88% гомологичности соответственно), в то время как неструктурные протеины проявляют большую схожесть последовательности (90-95%).

Фиг. 1А-1В показывают последовательности 5'- и 3'-некодирующего участка (НКУ) вирусов LGT E5 и TP21 по сравнению с ранее опубликованными последовательностями вируса Powassan, вирусов ВКЭ европейского подтипа (прототипический штамм Neudoerfl) и дальневосточного подтипа (штамм Sofjin). 5'НКУ LGT E5 составляет в длину 130 нуклеотидов и отличается от 5'НКУ вируса TP21 исключением нуклеотида G в позиции 61 и наличием нуклеотида С вместо G в позиции 35. Совмещение 5'НКУ геномов сложного вируса КЭ показывает, что два домена между нуклеотидами 1-30 и 82-129 сохраняются в соответствующих участках ВКЭ, вируса LGT и вируса Powassan (ПОВ). Последовательность между этими доменами является гипервариативной, и геномы ПОВ и LGT претерпевают в этом участке исключение по сравнению со штаммами ВКЭ. Среди клещевых флавивирусов 3'-некодирующая последовательность значительно варьируется по длине: LGT E5 или ТР21 содержит 566 нуклеотидов, ПОВ содержит 480 нуклеотидов, а штаммы ВКЭ содержат 350-370 нуклеотидов.

Совмещение 3'НКУ (фиг.1В) показало, что последние 95 3'-концевых нуклеотидов являются очень схожими у последовательностей всех флавивирусов. Только четыре нуклеотида на данном участке отличают вирус LGT E5 или ТР21 от дальневосточного штамма ВКЭ. Различие в длине 3'НКУ клещевых флавивирусов наблюдалось прежде всего между стоп-кодоном и последними 325 3'-концевыми нуклеотидами, причем последние являются участком, который проявляет высокую степень схожести последовательности. Геном LGT содержит: (i) вставку из 172 или 80 нуклеотидов на этом участке по сравнению с дальневосточным штаммом ВКЭ или ПОВ и (ii) исключение 182 нуклеотидов по сравнению с штаммом европейского подтипа ВКЭ. 3'НКУ штамма E5 LGT отличается от своего родителя LGT TP21 вставкой динуклеотида (АС) между позициями 10515 и 10516 и исключением С и U в позициях 10599 и 10633 соответственно.

Полная последовательность родителя LGT TP21 сравнивалась с последовательностью его более ослабленного производного LGT E5 с попыткой идентифицировать потенциальные генетические детерминанты нейроинвазионности и нейровирулентности. Этот анализ вскрыл 24 нуклеотидных отличия, одиннадцать из которых вызывали аминокислотное замещение в соответствующем полипротеине (Таблица 2). Аминокислотные изменения были локализованы в протеинах С, Е, NS1, NS2A и NS3. Анализ последовательности отдельных клонов кДНК TP21, кодирующих протеин Е, показал, что C₁₄₃₆>U было представлено в трех из четырех клонов. Интересно, что мутация Asn₆₆₈>Asp в протеине Е штамма Е5 соответствует замещению, рассматривавшемуся ранее в протеине Е частично ослабленного мутанта ВКЭ (Holzmann et al., J. Virol. 64:5156-5159, 1990; Mandl et al., J. Virol. 63:564-571, 1989). Для идентификации относительной важности 11 аминокислотных отличий для вирулентности штаммов ТР21 и Е5 LGT в геном кДНК ДЕН4 вводились различные комбинации генов вируса LGT путем замены соответствующих генов ДЕН4, как описано в Таблицах 1А, 1Б.

Пример 3
Построение химер LGT/ДEH4 и определение жизнеспособности
Химерические вирусы LGТ/ДЕН4 строились для анализа генетической основы пониженной нейровирулентности, тканевого тропизма и периферийной инвазионности вируса Langat и для разработки надежной и эффективной вакцины из живого ослабленного вируса против антигенно родственного ВКЭ. кДНК ДЕН4 полной длины использовалась для построения химерических конструктов, содержащих гены C-preM-E, preM-E, NS1-NS2A, NS1-NS2A-NS2B-dNS3 или NS2B-NS3 LGT, с остальными последовательностями, производными от ДЕН4 (Таблица 1А). В каждом примере концевые последовательности соответствующих фрагментов кДНК LGT TP21 и LGT E5, использовавшиеся для конструирования химер, были идентичны.

Плазмид ДЕН4 p2A (Xhol) (Bray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10342-10346, 1991) и рВКЭ(МЕ)/ДЕН4 (Pletnev et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:10532-10536, 1992) использовались для замещения двумя или более генами LGT соответствующих генов ДЕН4. Олигонуклеотидно-направленный мутагенез выполнялся для введения сайта Clal вместо уникального сайта Asp718 в 3' конце последовательности денге p2A(XhoI). Для упрощения построения химерической кДНК LGT ТР21(СМЕ)/ДЕН4 или LGT Е5(СМЕ)/ДЕН4 (Таблица 1А) участок кДНК, кодирующий гены С, ргеМ и Е ДЕН4, идущие от BglII (нуклеотид 88) до сайта Xhol (нуклеотид 2342), замещался соответствующей последовательностью вируса ТР21 или Е5. Для построения химерической кДНК LGТ(МЕ)/ДЕН4, содержащей гены рrеМ и Е штамма ТР21 некультивированного вируса Langat или его более ослабленного производного Е5, были созданы четыре различных соединения между геном С ДЕН4 и геном рrеМ LGT в химерических ДНК-плазмидах (Таблица 1А). К примеру, конструкт номер 3 рLGТ(МЕ)/ДЕН4 приготавливался следующим образом. Фрагмент ЦРП, содержащий гены рrеМ-Е между введенным сайтом PstI TP21 (нуклеотид 422) или Е5 (нуклеотид 423) и сайтом Xhol (TP21 нуклеотид 3279 или Е5 нуклеотид 2380) рядом с 3' концом гена Е, вставлялся в вектор ДЕН4, заменяющий соответствующую последовательность ДЕН4, вырабатывая химеру, подобную той, которая содержит гены рrеМ и Е ВКЭ, описанной ранее (Pletnev et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10532-10536, 1992). Последовательности у соединений между генами LGT и ДЕН4 в каждом химерическом плазмиде верифицировались путем построения последовательностей по участкам. Функциональная целостность химерических вирусов была продемонстрирована их способностью направлять синтез протеина с помощью лизата ретикулоцита кролика или в системе временной экспрессии вируса Т7-коровьей оспы (EIroy-Stein et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 86:6126-6130, 1989).

Пример 4
Рост химер в клеточной культуре
Транскрипты РНК полной длины, сделанные с шаблонов химерической кДНК, описанных выше, были протестированы на инфекционность путем трансфекции клеток LLCMK₂ человекообразных обезьян, клеток Vero человекообразных обезьян и клеток С6/36 москитов в присутствии DOTAP (Pletnev et al., выше). Через девять дней после трансфекции клетки в тарелке с 24 углублениями были перенесены в тарелку с 6 углублениями и предметное стекло. На 12 день, а потом снова на 16, 20, 24, 28, 32, 36 и 40 дни клетки были разделены и перенесены. Вдобавок клетки в каждый из этих дней проверялись с помощью иммунофлюоресцентного анализа (ИФА) на наличие антигенов ДЕН4 и LGT с помощью раствора 1: 300 ДЕН4- или LGT-специфичной гипериммунной мышиной асцитической жидкости (ГМАЖ). Инфекционный вирус был воспроизведен только из двух из 16 конструктов (8 LGT ТР21/ДЕН4 и 8 LGT Е5/ДЕН4), показанных в Таблице 1Б, и только в клетках москитов. Эти химерические вирусы обозначены: (i) ТР21/ДЕН4 для химеры штамм ТР21 некультивированного LGТ/ДЕН4, содержащей гены рrеМ и Е LGT TP21; и (ii) Е5/ДЕН4 для химеры ослабленный штамм Е5 LGТ/ДЕН4, содержащей гены рrеМ и Е LGT E5. Когда ИФА показывал, что 70-100% клеток были инфицированы, клетки в тарелке с 6 углублениями смешивались с вдвое большим количеством неинфицированных клеток, и полученная смесь инокулировалась в бутыль 75 см², которая проходила инкубацию в течение 7 дней. Инфицированные клетки собирались вместе со средой, смешивались с равным объемом фетальной бычьей сыворотки (ФБС), замораживались при -70^oС и использовались позднее в качестве посевного материала для приготовления суспензий вируса-отпрыска. Титр таких вирусных суспензий определялся путем анализа бляшки на клетках С6/36 москитов.

Химеры ТР21/ДЕН4 и Е5/ДЕН4 были усилены один раз в клетках С6/36 в бутыли 75 см². Вирусная РНК затем была выделена и обратно транскрибирована с помощью oligo 2634, который комплементарен к последовательности ДЕН4 между нуклеотидами 5090-5110 (поcл. 11). Однонитевая кДНК использовалась в качестве шаблона ЦРП, используемого с парами праймеров oligo 239 (поcл. 12) oligo 444 (поcл. 13). Продукты ЦРП были расщеплены с помощью HindIII и BamHI и клонированы в вектор pGEM3. Последовательность сайтов соединения LGТ/ДЕН4 была подтверждена прямым анализом клонированных вставок ДНК.

В ходе начальной характеризации химер ТР21/ДЕН4 и Е5/ДЕН4 анализ последовательности подтвердил последовательности соединения между генами ДЕН4 и preM LGT или генами Е LGT и NS1 ДЕН4. Важно, что химеры различаются в своих произошедших от LGT последовательностях только в четырех аминокислотных позициях в протеине Е (Таблица 2). Вдобавок, иммунопреципитация вирусных протеинов из инфицированной клеточной культуры москита показала, что обе эти химеры вырабатывали ожидаемые протеины. LGT-протеин preM ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4 был чувствителен к расщеплению эндогликозидазой F или Н, в то время как протеин Е сопротивлялся расщеплению этими ферментами. Это показывает, что LGT-протеин Е, экспрессированный в клетках москита любой из этих химер, не был гликозилирован, несмотря на присутствие потенциального сайта гликозилирования в Е-последовательности.

Химеры LGT TP21 и Е5/ДЕН4 сравнивались друг с другом и со своими родительскими вирусами с учетом модели репликации и максимального воспроизводства в клетках человекообразных обезьян и москитов (фиг.2). При инокуляции с кратностью инфекции (КИ), равной 0,01, химеры вырастали до умеренного титра в клетках москитов, а именно от 10^4,8 до 10^6,0 БОЕ/мл. Напротив, рост их родительского вируса LGT TP21 или Е5 в клетках москитов был полностью ограничен, когда сборы клеточной культуры анализировались с помощью анализа бляшки на клетках москитов. Это ограничение наблюдалось даже тогда, когда использовалась КИ, равная 1000. Вирусная репликация также не обнаруживалась, если для инокуляции клеток москитов использовалось меньше родительского вируса LGT (в пределах КИ от 0,01 до 100). Вдобавок, с помощью ИФА не удалось обнаружить наблюдаемой вирусной репликации в любом из этих примеров. Титр, достигаемый химерами в клетках москитов на пятый день, был меньше по сравнению с ДЕН4 в 10-100 раз. В отличие от ДЕН4 эти две химеры возбуждали хроническую нецитопатическую инфекцию клеток москитов. Также по сравнению с ДЕН4 эти две химеры вырабатывали меньше бляшек. Размер бляшки равнялся в среднем 5,0 мм для ТР21/ДЕН4, 2,0 мм для Е5/ДЕН4 и 11,5 мм для ДЕН4.

При анализе клеток человекообразных обезьян в качестве клеточных субстратов наблюдалась различная иерархия вирусной репликации. Химеризация LGT TP21 или Е5 с ДЕН4 значительно снижала эффективность вирусной репликации в клетках человекообразных обезьян по сравнению с родительским вирусом LGT TP21 или Е5, а также по сравнению с ДЕН4. Следовательно, химерические вирусы LGТ/ДЕН4, росшие в клетках москитов, были неспособны к бляшкообразованию в клетках человекообразных обезьян. Вдобавок, эти химеры не реплицировали так эффективно в клетках человекообразных обезьян, как было показано путем анализа бляшки в клетках москитов.

Напротив, родительский LGT ТР21 или Е5 в клетках человекообразных обезьян был способен образовывать бляшку с высокой эффективностью и дорастал до высокого титра, то есть приблизительно от 10⁸ до 10⁹ БОЕ/мл, уровня большего, чем уровень, достигаемый ДЕН4.

Клетки человекообразных обезьян не были полностью устойчивы к химерическим вирусам из-за того, что вирус, размножившийся в пермиссивной москитной клеточной культуре, инициировал медленную и частично ограниченную вирусную репликацию в клетках LLCMK₂ или Vero человекообразных обезьян, инокулированных с КИ, равной 0,5. Вдобавок, распространение вируса в этих клеточных культурах отличалось от распространения в родительском вирусе LGT ТР21 или Е5, которое было цитопатическим и достигало высокого титра к пятому дню при инокуляции с КИ 0,01. Напротив, инфицирование клеток человекообразных обезьян любой из этих химер при КИ 0,5 не производило цитопатических эффектов и прогрессировало очень медленно, как отслеживалось с помощью ИФА. Для инфицирования 80-100% клеток человекообразных обезьян требовался инкубационный период в 24-48 дней. В это время установилась хроническая инфекция без цитопатических эффектов, и такие хронически инфицированные клетки могли поддерживаться в процессе инкубации и субкультуры в течение 10 месяцев без явного видимого эффекта. Воспроизводство вируса из этих клеток человекообразных обезьян во время максимальной инфекции измерялось с помощью анализа бляшки на клетках москитов, и было обнаружено, что оно уменьшено на 90% по сравнению с уровнем, достигнутым при росте любого из химерических вирусов в клетках москитов. Воспроизведение любого из химерических вирусов из инфицированных клеток LLCMK₂ человекообразных обезьян не образовывало бляшек на этих клетках. Такая же ситуация наблюдалась для химеры LGT Е5/ДЕН4, росшей в клетках Vero человекообразных обезьян. Напротив, уменьшенное количество очень маленьких слабых бляшек вырабатывалось химерой LGT ТР21/ДЕН4 в этих клетках, что соотносится с ограниченной репликацией этой химеры в клетках человекообразных обезьян. В то время как химерический вирус ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4, собранный с клеток человекообразных обезьян, хронически инфицированных в течение 8 месяцев, был перенесен в москитную клеточную культуру и достиг высокого титра, воспроизводство вируса в клетках человекообразных обезьян поддерживало свою ограниченность роста и бляшкообразования.

Эти результаты показывают, что химеризация LGT TP21 или LGT E5 с помощью ДЕН4 значительно уменьшает репликационную способность этих химер в клетках человекообразных обезьян по сравнению с любым из родительских вирусов. Это представляет собой противоположность предыдущим результатам, показывающим, что химера ВКЭ(МЕ)/ДЕН4 реплицировалась в 1000 раз более эффективно, чем ДЕН4 в клетках человекообразных обезьян (Pletnev et al., выше).

Нейровирулентность и нейроинвазионность химерического вируса TP21, E5 или LGТ/ДЕН4 исследовалась на живой модели-мыши, как описано в Примерах 5 и 6 ниже.

Пример 5
Исследования нейровирулентности
Нейровирулентность вирусов LGT TP21, LGT E5, ДЕН4 и химерических ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4 оценивалась на аутбредных швейцарских мышах трехдневного возраста. Группы из 10-14 мышей инокулировались внутрицеребрально (ВЦ) десятичными растворами вируса в диапазоне от 10² до 10⁷ БОЕ в 20 л модифицированной среды Игла (МСИ), содержащей 0,25% человеческого сывороточного альбумина. Мыши наблюдались в течение 28 дней на предмет фатального или нефатального энцефалита.

Некультивированный LGT TP21 был сильно вирулентным, как показано с помощью его СД₅₀, равной 0,4 БОЕ у новорожденной мыши, то есть одна БОЕ была смертельна для новорожденной мыши (Таблица 3). Нейровирулентность более ослабленного штамма Е5 LGT была в той же ситуации в 50 раз ниже. ДЕН4 был еще менее нейровирулентен, поскольку заболевание или смерть наблюдались только тогда, когда новорожденная мышь инокулировалась большой дозой. Внутрицеребральная СД₅₀ ДЕН4 была оценена равной 8000 БОЕ. Химерический ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4 проявил значительное снижение нейровирулентности по сравнению со своим LGT-родителем при тестировании путем прямой инокуляции в мозг новорожденной мыши. Таким образом, внутрицеребральная СД₅₀ ТР21/ДЕН4 равнялась 2500 БОЕ, что приблизительно в 6250 меньше, чем у его родительского LGT TP21 (0,4 БОЕ). Е5/ДЕН4 был еще более ослабленным, имеющим ВЦ СД₅₀>10⁵ БОЕ. Вдобавок, Е5/ДЕН4 был в 44 раза менее нейровирулентен, чем ТР21/ДЕН4. Таким образом, химерический вирус ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4 сохранял для мышей низкую нейровирулентность своего родительского ДЕН4, а не высокую нейровирулентность своего родительского вируса Langat. Аналогично, химеры LGТ/ДЕН4 были по меньшей мере в 6250 раз менее нейровирулентными для мышей, чем их родительские LGT TP21 или Е5. Это существенное снижение нейровирулентности, как представляется, кореллирует с ограниченным ростом этих химер в клетках человекообразных обезьян.

Неожиданностью стало огромное снижение нейровирулентности химер LGT ТР21(МЕ)/ДЕН4 и LGT Е5(МЕ)/ДЕН4 по сравнению с ВКЭ(МЕ)/ДЕН4 (Таблица 3). Химеры ТР21/ДЕН4 и Е5/ДЕН4 были соответственно в 125 и 5500 раз менее нейровирулентны, чем ВКЭ-химера.

Пример 6
Исследования нейроинвазионности
Нейроинвазионность (периферическая нейровирулентность) родительских или химерических вирусов оценивалась на самках швейцарской мыши трехнедельного возраста, которые были инокулированы внутрибрюшинно (ВБ) в группах по десять особей с помощью: (i) 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ или 10⁷ БОЕ вируса LGT TP21 или LGT E5; или (ii) 10⁵ БОЕ вируса ТР21/ДЕН4, Е5/ДЕН4 или ДЕН4. Мыши наблюдались в течение 21 дня, и у выживших мышей бралась кровь для оценивания антительной реакции. Выжившие мыши на следующий день получали ВБ 100 или 1000 ВБ СД₅₀ родительского вируса TP21 и наблюдались дополнительно четыре недели.

LGT TP21 был также умеренно вирулентен для мыши трехнедельного возраста при инокуляции периферическим маршрутом. ВБ СД₅₀ составляла приблизительно 5•10³ БОЕ. Напротив, химерический ТР21/ДЕН4 проявлял более низкую периферическую нейроинвазионность для взрослых мышей при ВБ СД₅₀>10⁵ БОЕ. Ослабленный штамм E5 LGT проявлял гораздо более низкую периферическую вирулентность, чем его родительский LGT TP21. Только у 10-20% взрослых мышей, инокулированных ВБ с помощью 10⁷ БОЕ LGT E5, проявились симптомы энцефалита, что затруднило обнаружение воздействия химеризации на нейроинвазионность. Однако данные, относящиеся к LGT ТР21/ДЕН4, показывают, что химеризация LGT TP21 с помощью ДЕН4 уменьшает или устраняет нейроинвазионность LGT для мышей.

Более чувствительный анализ нейроинвазионности содержал инокуляцию иммунонедостаточных (SCID) мышей. Хотя у SCID-мышей нехватка зрелых В и Т лимфоцитов, они имеют нормальные врожденные иммунные функции, в том числе функциональные макрофаги, нормальные или повышенные функции NK-клеток и повышенную активность гемолитического комплемента. В этом анализе самки мышей СВ-17 ICR/scid/scid трехнедельного возраста (Bosma et al., Nature 301:527-530, 1983) группами по 5 особей инокулировались ВБ: (i) 10⁵ или 10⁷ БОЕ вируса ДЕН4, ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4 или (ii) десятичными растворами LGT TP21 или LGT E5 от 10⁴ до 10⁷ БОЕ. Затем эти мыши наблюдались на предмет смертности в течение 6 недель.

Способность иммунонедостаточных SCID-мышей обнаруживать нейроинвазионность TP21 или E5 была приблизительно в 10^6.3-10^8.8 раз больше, чем наблюдалось для иммунокомпетентных швейцарских мышей (Таблица 3). Заметно увеличенная подверженность фатальному заболеванию была отмечена, когда SCID-мыши инокулировались ВБ любым из родительских LGT-вирусов. СД₅₀ LGT TP21 для иммунонедостаточных мышей при ВБ-маршруте была равна 0,004 БОЕ (Таблица 3). Вдобавок, LGT E5 был также сильно вирулентным для SCID-мышей при ВБ маршруте, с СД₅₀, равной 0,06 БОЕ. Инкубационный период до наступления энцефалита составлял 12 дней, а смерть наступала в течение следующих пяти дней. Как и родительский вирус ДЕН4, оба химерических LGT-вируса не проявляли обнаруживаемой нейроинвазионности для SCID-мышей. Мыши, инокулированные ВБ с помощью 10 БОЕ, оставались здоровыми в течение 6-недельного послеинокуляционного периода наблюдений. Эти открытия показывают, что химерический ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4 полностью потеряли нейроинвазионность своего LGT-родителя для SCID-мышей.

Сам родительский вирус TP21 или его ослабленный производный штамм E5 может не подходить для людей в качестве живой ослабленной вакцины против комплекса ВКЭ-вирусов. Возникновение связанного с вакциной энцефалита, хотя и с очень низкой частотой (10^-4.3), которая наблюдалась в ходе широкомасштабного клинического эксперимента с наиболее ослабленной вакциной-кандидатом (вирусом Еланцева) против ВКЭ, поддерживают эту точку зрения (lacoco-Connors et al., Virology 188:875-880, 1992; Smorodincev et al., in Tick-borne Encephalitis and its Vaccine Prophylaxis, Leningrad, 1986). Живые ослабленные энцефалитные флавивирусы по возможности не должны иметь такого очень низкого уровня вирулентности. В противоположность родительским LGT вирусам оценивание химерических вирусов ТР21/ДЕН4 и Е5/ДЕН4 на модели SCID-мыши показало, что эти две химеры были полностью авирулентны и не проявляли никакой нейроинвазионности в этой очень чувствительной системе анализа, поскольку большая доза (10⁷ БОЕ) любого из этих химерических вирусов не смогла оказать воздействия на ЦНС и вызвать энцефалит или смерть после инокуляции в периферической точке. Это предполагает, что для распространения какого-либо LGT вируса из периферической точки в мозг и обусловливания энцефалита необходимы протеины, кодируемые участками генома LGT, отличными от генов рrеМ и Е.

Нейроинвазионность следует отличать от нейровирулентности. Так, LGT E5 проявил умеренную нейровирулентность при инокуляции вируса непосредственно в мозг новорожденной мыши (СД₅₀ равна 20 БОЕ), в то время как его СД₅₀ при инокуляции ВБ составляла >10⁷ БОЕ. Ясно, что нейровирулентность требуется LGT для вызывания энцефалита при инокуляции периферическим маршрутом, как при ВБ инокуляции. Однако для достижения вирусом мозга требуются другие свойства этих флавивирусов.

Пример 7
Иммуногенность и защитная эффективность химерических вирусов LGT/AEH4 против заражения вирусом Langat
Для определения иммуногенности и защитной эффективности химер LGТ/ДЕН4 использовались мыши. Мыши инокулировались ВБ с помощью 10² БОЕ ТР21 или Е5 или 10⁵ БОЕ ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4, при этом развивалась сильная антительная реакция на вирионы TP21, как было измерено путем ферментносвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA; Таблица 4). Вдобавок, эти мыши вырабатывали высокий уровень нейтрализующих антител к LGT TP21, как было измерено с помощью редукции бляшки. Напротив, мыши, инокулированные ВБ с помощью 10⁵ БОЕ ДЕН4, не смогли выработать нейтрализующие антитела к TP21 или Е5, фиксируемые с помощью ELISA.

Через двадцать три дня после инокуляции ТР21/ДЕН4, Е5/ДЕН4, TP21 или Е5 мыши заражались ВБ с помощью 100 или 1000 ВБ СД₅₀ TP21 (Таблица 5). Все мыши, которые были ранее иммунизированы с помощью ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4, выработали высокий титр нейтрализующих антител и были полностью защищены от ВБ заражения TP21. Напротив, мыши, иммунизированные ВБ с помощью ДЕН4, были защищены только частично: три из десяти мышей умерли при заражении 100 ВБ СД₅₀ LGT TP21. Все 30 неиммунизированных контрольных особей заболели энцефалитом и 25 из них затем умерли. Как было рассмотрено ранее, эти результаты показывают, что иммунная реакция на неструктурные протеины ДЕН4 была неспособна обеспечить полную защиту от LGT TP21 для мышей.

При последующем исследовании (Таблица 6) каждая из 5 мышей, инокулированных 10⁵ БОЕ ДЕН4, не могла сопротивляться заражению с помощью 1000 ВБ СД₅₀ LGT TP21, в то время как каждая из пяти мышей, иммунизированных ВБ с помощью 10⁵ БОЕ химерического ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4, пережили то же самое заражение LGT TP21. Таким образом, представляется, что протеины рrеМ и Е LGT представляют собой главные защитные антигены химер, отвечающие за полную сопротивляемость летальному заражению LGT.

Возможно, иммуногенность и защитная эффективность родительских вирусов LGT и их ДЕН4-химер возникала в результате иммунизации с помощью ранее сформированных антигенов, присутствующих в вирусных препаратах, инокулированных ВБ, а не с помощью антигенов, выработанных реплицированным in vivo вирусом. Это предположение возникло путем оценивания антительных реакций и защитной эффективности вирусных препаратов, содержащих лишь 10 БОЕ. Вдобавок, химеры оценивались на двух уровнях инфекционности, а именно 10³ или 10⁵ БОЕ (Таблица 6). При каждой из трех оцененных доз вирус тестировался без модифицирования или после полной дезактивации с помощью УФ-облучения. Перед выполнением данного исследования время, необходимое для полной дезактивации инфекционности с помощью УФ, определялось равным 60 минутам с помощью кинетического анализа.

Мыши наблюдались в течение 21 дня, и у выживших на 22 день после инокуляции бралась кровь для оценивания антительной реакции, измеряемой с помощью ELISA или теста нейтрализации редукции бляшки. Выжившие мыши на 24 день ВБ заражались 1000 ВБ СД₅₀ (5•10⁷ БОЕ) LGT TP21 и обследовались в течение последующих четырех недель.

Такое малое количество, как 10 БОЕ любой химеры, регулярно возбуждало нейтрализующие и ELISA-антитела с титром 1:50 или выше (Таблица 6), в то время как только 1 из 10 мышей, получивших УФ-дезактивированные 10⁵ БОЕ химеры, выработала низкий уровень ELISA-антител, и ни одна из мышей не выработала сколь-нибудь заметных нейтрализующих антител. Реакция этих мышей, зараженных TP21 (1000 ВБ СД₅₀), согласовывалась с иммунологической реакцией. Только одна из 10 мышей, ВБ инокулированных с помощью 10 БОЕ химеры, не смогла сопротивляться заражению, в то время как 7 из 10 мышей, получивших УФ-дезактивированные 10⁵ БОЕ, умерли после заражения. Представляется, что успешная иммунизация этими двумя химерами прежде всего отражается на действии вирусной репликации, а не на действии большой массы ранее сформированных вирусных антигенов.

Пример 8
Иммуногенность и защитная эффективность химерических вирусов LGT/ДEH4 против заражения ВКЭ
Для определения иммуногенности и защитной эффективности химер LGТ/ДЕН4 использовались мыши. Через двадцать три дня после инокуляции ТР21/ДЕН4, Е5/ДЕН4 или ДЕН4 мыши заражались 10³ или 10⁵ БОЕ ВКЭ или одного из его сильновирулентных родственных клещевых флавивирусов, таких как вирус омской геморрагической лихорадки, вирус лесной болезни Кьясамура, вирус Negishi, вирус Powassan или вирус центральноевропейского клещевого энцефалита. Все ранее иммунизированные с помощью ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4 мыши вырабатывают высокий титр нейтрализующих антител и полностью защищены от ВБ заражения ВКЭ. Напротив, мыши, иммунизированные ВБ с помощью ДЕН4, только частично защищены либо не защищены вовсе. Все неиммунизированные контрольные мыши заболели энцефалитом и умерли. Эти результаты показывают, что иммунная реакция на неструктурные протеины ДЕН4 не способна обеспечить полную защиту для мышей против ВКЭ или его сильновирулентных родственников.

В дополнительном исследовании ни одна из группы мышей, инокулированных 10⁵ БОЕ ДЕН4, не смогла оказать сопротивления заражению ВКЭ, в то время как каждая из группы мышей, иммунизированных ВБ с помощью 10⁵ БОЕ химерического ТР21/ДЕН4 или Е5/ДЕН4, пережила такое же заражение ВКЭ. Таким образом, представляется, что протеины рrеМ и Е LGT представляют главные защитные антигены химер, ответственные за полную сопротивляемость летальному заражению ВКЭ.

Возможно, иммуногенность и защитная эффективность родительских вирусов LGT и их ДЕН4-химер возникает из иммунизации с помощью ранее сформированных антигенов, присутствующих в вирусных препаратах, инокулированных ВБ, а не из антигенов, выработанных реплицируемым in vivo вирусом. Это предположение возникло путем оценивания антительных реакций и защитной эффективности вирусных препаратов, содержащих лишь ограниченное количество вируса. Вдобавок, химеры оценивались на двух уровнях инфекционности, а именно 10³ или 10⁵ БОЕ. При каждой из трех оцененных доз вирусы тестировались без модифицирования или после полной дезактивации с помощью УФ-облучения. Перед выполнением данного исследования время, необходимое для полной дезактивации инфекционности с помощью УФ, определялось равным 60 минутам с помощью кинетического анализа.

Мыши наблюдались в течение 21 дня, и у выживших на 22 день после инокуляции бралась кровь для оценивания антительной реакции, измеряемой с помощью ELISA или теста нейтрализации редукции бляшки. Выжившие мыши на 24 день ВБ заражались 1000 ВБ СД₅₀ ВКЭ и обследовались в течение последующих четырех недель.

Такое малое количество, как 10 БОЕ любой химеры, регулярно возбуждало нейтрализующие и ELISA-антитела с титром 1:50 или выше (Таблица 6), в то время как только малый процент мышей, получивших УФ-дезактивированные 10⁵ БОЕ химеры, выработала низкий уровень ELISA-антител, и ни одна из мышей не выработала сколь-нибудь заметных нейтрализующих антител. Реакция этих мышей, зараженных ТР21 (1000 ВБ СД₅₀), согласовывалась с иммунологической реакцией. Только малый процент мышей, ВБ инокулированных с помощью 10 БОЕ химеры, не смогла сопротивляться заражению, в то время как большинство мышей, получивших УФ-дезактивированные 10⁵ БОЕ, умерли после заражения. Представляется, что успешная иммунизация этими двумя химерами прежде всего отражается на действии вирусной репликации, а не на действии большой массы ранее сформированных вирусных антигенов.

Пример 9
Тестирование химерических флавивирусных вакцин на приматах
Интраназальное инфицирование обезьян представляло экспериментальную систему инфицирования в естественных условиях, для тестирования и предсказания эффективности ВКЭ-вакцины для использования на людях. Hambleton, P., et al.. Infect. Immun., 40:995-1003 (1983). Этот отчет показал, что реакция резус-макак на интраназальную ВКЭ-инфекцию подобна реакции людей, за тем исключением, что не наблюдалось лихорадки. Объектами настоящего исследования, связанного с вакцинацией обезьян против инфекции ВКЭ, являются: (1) оценка иммуногенности различных химерических рекомбинантных флавивирусных вакцин-кандидатов; и (2) оценка защитной эффективности вышеупомянутых вакцин против заражения вирулентными штаммами ВКЭ или тесно связанных с ним вирусов.

Для исследования использовалась группа взрослых макак-резусов (Масаса mulatta) обоих полов, весивших от 1,8 до 5,1 кг. Животные были помещены в клетки и им давалось питание в соответствии со стандартными протоколами, известными и принятыми из уровня техники. Для инфицирования и всех процедур взятия образцов животным делалась анестезия путем внутримышечной инъекции с помощью такого общеизвестного из уровня техники подходящего агента, как гидрохлорид кетамина (Vetalar; Parke, Davis & Co.).

Штаммы вируса, использовавшиеся для инфицирования тестовых животных, являлись клинически важным членом комплекса клещевого энцефалита. К примеру, вирусы русского весенне-летнего энцефалита (дальневосточный), центральноевропейского энцефалита (западный), омской геморрагичсеской лихорадки, louping ill, лесной болезни Кьясанура, Negishi или Powassan могут быть использованы для тестирования эффективности вакцин по настоящему изобретению.

Группа обезьян, выбранная для исследования, была разделена случайным образом на экспериментальную группу и контрольную группу. Экспериментальная группа обезьян вакцинировалась эффективной дозой химерической флавивирусной вакциной по настоящему изобретению, в то время как контрольная группа обезьян была оставлена необработанной. Все обезьяны инфицировались с помощью от 3•10⁸ до 5•10⁸ БОЕ стандартного заражающего препарата выбранного ВКЭ. Животные инфицировались интраназально, чтобы дать результаты, подобные результатам, наблюдаемым у людей, инфицированных ВКЭ в естественных условиях.

Кровь (10 мл) бралась у тестируемых обезьян для тестирования с интервалами после инфицирования с помощью общеизвестных из уровня техники стандартных методов. Эти образцы крови разделялись на компонентные части, и фильтрованные образцы сыворотки хранились при -20^oС в соответствии с приемлемыми процедурами, известными из уровня техники. Спинномозговая жидкость (СМЖ) бралась у обезьян путем цистернальной пункции или другими приемлемыми способами перед инфицированием и через 9-11 дней после инфицирования. Эти образцы фильтровались и хранились при -20^oС в соответствии с приемлемыми процедурами, известными из уровня техники. Части нефильтрованной СМЖ исследовались под микроскопом на присутствие лейкоцитов.

Обезьяны умерщвлялись с интервалами от 4 дней до 14 недель после инфицирования и в последний момент путем внутривенной инъекции пентобарбитала натрия. Некропсия выполнялась немедленно. Мозг и спинной мозг удалялись, а части ткани из каждой области собрались с целью выделения вируса. Остаток центральной нервной системы (ЦНС) фиксировался в буферизованном 10% нейтральном формалине, как и части печени, селезенки, легких, почки и тонкой кишки. После обработки стандартными способами и заключения в парафиновый воск части всех этих тканей разрезались и окрашивались гематоксилином и эозином. Выбранные части ЦНС также окрашивались гемотоксилином фосфовольфрамовой кислоты, люксолевым прочным синим - крезиловым фиолетовым и модификацией Глиса и Марсланда метода Бельшовского для нейронов.

У большинства контрольных обезьян, инфицированных интраназально ВКЭ, клинические неврологические симптомы появлялись между 10 и 15 днями. Эти симптомы состояли в дрожании рук, вращении шеи, некоординированности, заднем парезе и, иногда, конвульсиях. Эти симптомы прогрессировали до комы или смерти в течение 12-24 часов после появления.

Клиническое химическое исследование крови и СМЖ показывает, что изменения в тестируемых животных являются результатом заражения ВКЭ, а также обеспечивают средство сравнения животных и человеческих данных. В отношении крови: изменения в активности некоторых компонентов крови, таких как определенные ферменты сыворотки, стали очевидны приблизительно через 10 дней после инфицирования. Могла увеличиваться активность аспаратата аминотрансферазы (АСАТ). Могли также увеличиваться активности дигидрогеназы и креатин киназы. Напротив, активность алкалин фосфатазы могла уменьшаться прогрессивно по отношению к доинфекционным уровням. В отношении СМЖ: активность АСАТ после инфицирования могла значительно повышаться, однако увеличения количества лейкоцитов в результате инфекции могло не происходить.

Также наблюдались другие эффекты заражения вирусом. Поражения обнаруживались у тех зараженных животных, которые проявляли клинические симптомы заболевания. Эти поражения присутствовали принципиально в мозжечке, заднем отделе ствола мозга и вервикальном спинном мозге, но более слабые поражения могли присутствовать в коре мозга и среднем мозге. Вирус может также временно появляться в крови зараженных животных. Антительная реакция животных, зараженных ВКЭ интраназально, наблюдается не обязательно.

В противоположность контрольной группе, экспериментальная группа обезьян оставалась практически неподверженной симптомам заболевания, вызванного заражением ВКЭ. Защита, обеспеченная химерической флавивирусной вакциной экспериментальной группе обезьян, демонстрирует надежность и эффективность химерических флавивирусов по настоящему изобретению.

Пример 10
Случайный эксперимент с химерической вирусной вакциной LGT/AEH4
Химерическая вирусная вакцина LGТ/ДЕН4, произведенная, как описано в вышеупомянутых Примерах, используется для тестирования надежности и эффективности таких вакцин при использовании на людях. Данный Пример основан на исследовании, о котором пишет Harabacz, I., et al. Vaccine, 10(3): 145-150 (1992). Одна доза вируса в вакцине содержит 1,0, 1,5 и 2,0 мкг частиц рекомбинантного вируса. Испытание разработано в виде ожидаемого многоцентрового управляемого исследования "вслепую". Случайная выборка участников выполнялась с учетом дозы и расписания вакцинации. Случайным образом предписывались три дозировки в соотношении 1:1:1. Случайное отнесение к общепринятому или сокращенному расписанию проводится в соотношении 2:1. Центры исследования могут быть расположены в различных европейских странах, где известны случаи КЭ, таких как Германия, Югославия, Чехословакия и Швейцария.

Исследованием была охвачена группа здоровых взрослых независимо от пола. Возраст и пол сбалансированно случайно распределялись между группами. Всем добровольцам перед экспериментом требуется дать свое согласие; исследование утверждалось соответствующими этическими комитетами в центрах, где проводились исследования.

В отношении расписаний вакцинации и наблюдения: "общепринятое" расписание иммунизации состоит из вакцинаций в 0, 28 и 300 дни. Образцы крови для антительного анализа берутся в 0, 28, 42, 56, 300, 314 и 328 дни. "Сокращенное" расписание иммунизации состоит из вакцинаций в 0, 7 и 21 дни. Образцы крови собираются в 0, 21, 28, 35, 49 и 321 дни. Тестируемая вакцина вводится путем внутримышечной инъекции в дельтовидную мышцу. За каждым субъектом в течение 28 дней после иммунизации велось наблюдение для отслеживания побочных эффектов вакцины.

Антительные анализы выполнялись с помощью таких стандартных иммунологических методов, как ферментносвязанный иммуносорбентный анализ (ELISA), тест ингибирования гемагглютинации (ТИГ) и тест нейтрализации (ТН). Эти анализы выполняются в соответствии с общеизвестными из уровня техники способами, например, ТИГ может выполняться в соответствии со способом Кларка и Кэзалса, Am. J. Trop. Med. Hyg., 7:561-573 (1958), ELISA - в соответствии с Heinz et al., Virology 126:525-538 (1983), а ТН - как описано в Кlockmann, et al., J. Biol. Stand, 17:331-342 (1989). В ТН ND₅₀ на 0,1 мл может определяться с помощью дозы вируса в 100 ТСID₅₀ на 0,1 мл. Нижние пределы сероконверсии могут определяться как 8 в ТИГ, 2 в ТН и 160 в ELISА.

Результаты исследования показывают, что химерические флавивирусные вакцины по настоящему изобретению являются надежными для использования на людях. Они также показывают, что иммунизированные индивиды производят сероконверсию и вырабатывают антитела к химерическим флавивирусным вакцинам. Эти антитела дают результаты ТИГ и ТН, показывающие, что иммунная реакция, достигаемая вакцинами, является защищающей от заражения ВКЭ. Также данное исследование показало, что побочные эффекты, связанные с вакцинацией, малы по сравнению с толеранными реакциями большинства иммунизированных в ходе исследования субъектов.

Вышеприведенное описание изобретения дано исключительно для поддержки понимания изобретения. Следует понимать, что варианты изобретения, в том числе все эквиваленты, известные сейчас или разработанные позднее, должны рассматриваться как входящие в объем изобретения, ограниченный лишь последующей формулой изобретения.

Формула изобретения

1. ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса, представляющий организацию генома 5'-С-рrеМ-Е-NS1-NS2А-NS3-NS4А-NS4В-NS5-3' и содержащий: первый участок нуклеиновой кислоты, кодирующей структурные протеины рrеМ, Е вируса Langat и протеин С вируса Langat или москитного вируса, оперативно связанный со вторым участком нуклеиновой кислоты, кодирующей неструктурные протеины москитного флавивируса.

2. ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса по п.1, в котором упомянутым вирусом Langat является штамм ТР21 вируса Langat или штамм Е5 вируса Langat.

3. ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса по п.1, в котором упомянутым москитным флавивирусом является вирус денге.

4. ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса по п.3, в котором упомянутый вирус денге является типом 4.

5. ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса по п. 1, в котором упомянутым москитным флавивирусом является вирус желтой лихорадки.

6. ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса по п.1, в котором упомянутый первый участок нуклеиновой кислоты также кодирует протеин капсида упомянутого москитного флавивируса.

7. ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса по п.1, вставленный в вектор экспрессии.

8. ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса по п.7, в котором упомянутым вектором является плазмид.

9. Вакцина против вируса клещевого энцефалита, содержащая ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса по п.1 в фармацевтически приемлемом носителе.

10. Вакцина по п.9, в которой упомянутый вирус клещевого энцефалита является вирусом восточного или западного подтипа.

11. Способ предотвращения инфицирования млекопитающего вирусом клещевого энцефалита, включающий введение упомянутому млекопитающему эффективного, предотвращающего инфицирование вирусом клещевого энцефалита количества ДНК-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса, при этом упомянутый ДНК-конструкт жизнеспособного химерного флавивируса содержит первый участок нуклеиновой кислоты, кодирующей структурные протеины рrеМ, Е вируса Langat и протеин С вируса Langat или москитного вируса, оперативно связанный со вторым участком нуклеиновой кислоты, кодирующей неструктурные протеины москитного флавивируса, в фармацевтически приемлемом носителе.

12. Способ по п.11, в котором упомянутым млекопитающим является человек.

13 Способ по п. 11, в котором введение упомянутого эффективного, предотвращающего инфицирование вирусом клещевого энцефалита количества ДНК-конструкта жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса осуществляется или интраназально, или внутрикожно, или подкожно, или внутримышечно, или внутривенно.

14. Способ по п.11, в котором упомянутое эффективное, предотвращающее инфицирование вирусом клещевого энцефалита количество ДНК-конструкта жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса находится в пределах 1 - 1000 г.

15. Способ по п.11, отличающийся тем, что вводят дополнительно одну или несколько усиливающих инъекций упомянутого ДНК-конструкта жизнеспособного химерного флавивируса.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 20.11.2006        БИ: 32/2006