Способ получения n-деацилированного цефалоспорина

 

Изобретение относится к способу получения N-деацилированных цефалоспоринов посредством ферментативного получения их 7-ацилированных аналогов. Способ включает ферментацию пенициллин- или цефалоспоринпродуцирующего микроорганизма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы, экспандазной активности и необязательно ацетилтрансферазной и/или гидроксилазной активности. Ферментацию проводят в присутствии предшественника боковой цепи формулы НООС -Х-(СН₂)_n-СООН (значения Х и n приведены в формуле) или его соли, эфира или амида. Производное ацил-7-цефалоспорина извлекают из ферментационного бульона, деацилируют и извлекают 7-цефалоспорин в кристаллической форме. Способ обеспечивает повышение выхода целевого продукта и снижение уровня побочных продуктов. 10 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области медицины, в частности, к ферментативному получению N-деацилированных цефалоспоринов, таких как 7-ADCA.

β-Лактамные антибиотики составляют наиболее важную группу антибиотических соединений, имеющих длительную историю клинического применения. В этой группе выделяются такие антибиотики, как пенициллины и цефалоспорины. Эти соединения продуцируются в природе нитчатыми грибками Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum соответственно.

В результате усовершенствования классических методов со штаммами уровень получения антибиотиков в Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum существенно возрос за последние десятилетия. С увеличением объема знаний о биосинтетических путях метаболизма, ведущих к образованию пенициллинов и цефалоспоринов, и открытием технологии рекомбинантных ДНК стали доступны новые средства для усовершенствования производственных штаммов и дериватизации соединений in vivo.

Большинство ферментов, участвующих в биосинтезе β-лактамов, идентифицировано и их соответствующие гены клонированы, что описано в Ingolia and Queener, Med. Res. Rev., 9 (1989), 245-264 (пути биосинтеза и ферменты) и в Aharonowitz, Cohen and Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495 (клонирование генов).

Первыми двумя стадиями при биосинтезе пенициллина в Р. chrysogenum являются конденсация трех аминокислот - L-5-амино-5-карбоксипентановой кислоты (L-α-аминоадипиновая кислота) (А), L-цистеина (С) и L-валина (V) до трипептида LLD-ACV и последующая циклизация этого трипептида с образованием изопенициллина N. Это соединение содержит типичную β-лактамную структуру.

Эти две первые стадии являются обычными при биосинтезе пенициллина в грибках и бактериях, продуцирующих пенициллин, цефамицин и цефалоспорин.

Третья стадия заключается в замене гидрофильной боковой цепи D-α-аминоадипиновой кислоты изопенициллина N на L-5-амино-5-карбоксипентановую кислоту при воздействии фермента ацилтрансферазы (AT). Ферментативная реакция обмена, опосредованная AT, происходит внутри клеточной органеллы - микротельца, как описано в ЕР-А-0448180.

В микроорганизмах, продуцирующих цефалоспорин, третьей стадией является изомеризация эпимеразой изопенициллина N в пенициллин N, после чего пятичленная циклическая структура, характерная для пенициллинов, расширяется ферментом экспандазой до шестичленной структуры, характерной для цефалоспоринов.

Единственными непосредственно ферментируемыми пенициллинами промышленного значения являются пенициллин V и пенициллин G, получаемые путем добавления во время ферментации Р. chrysogenum предшественников гидрофобной боковой цепи - феноксиуксусной кислоты или фенилуксусной кислоты соответственно, причем таким образом боковые цепи природных β-лактамов заменяются на феноксиуксусную кислоту или фенилуксусную кислоту.

Цефалоспорины значительно дороже пенициллинов. Одна из причин этого состоит в том, что некоторые цефалоспорины (например, цефалексин) получают из пенициллинов путем многих химических превращений. Цефалоспорин С, безусловно наиболее важное исходное вещество в этом отношении, хорошо растворяется в воде при любом рН, что, следовательно, предполагает длительный и дорогостоящий процесс выделения с использованием громоздкой и дорогой колоночной технологии. Цефалоспорин С, полученный таким путем, должен быть превращен в применяемые в терапии цефалоспорины посредством многих химических и ферментативных превращений.

Промежуточный цефалоспорин 7-ADCA в настоящее время получают посредством химической дериватизации пенициллина G. Необходимые химические стадии получения 7-ADCA включают расширение 5-членной пенициллиновой циклической структуры до 6-членной цефалоспориновой циклической структуры.

В последнее время появились сообщения о ферментативных способах получения 7-ADCA.

В EP-A-0532341 oписывается применение в качестве исходного материала адипата (5-карбоксипентаноата), что приводит к образованию пенициллинового производного с адипильной боковой цепью, а именно адипил-6-аминопенициллановой кислоты. Это включение происходит благодаря тому факту, что ацилтрансфераза обладает доказанной широкой субстратной специфичностью (Behrens et al. , J. Biol. Chem., 175 (1948), 751-809; Cole, Process. Biochem. 1 (1966), 334-338; Ballio et al. , Nature, 185 (1960), 97-99). Кроме того, когда к рекомбинантному штамму Р. chrysogenum, экспрессирующему экспандазу, загружают адипат, адипил-6-АРА расширяется до своего соответствующего цефалоспоринового производного. Наконец, предлагается удаление адипильной боковой цепи, причем в качестве конечного продукта получают 7-ADCA.

В заявке на патент ЕР-А-0540210 описывается подобный способ получения 7-АСА, включающий дополнительные стадии превращения 3-метильной группы кольца ADCA в 3-ацетоксиметильную группу АСА.

В WO 95/04148 и WO 95/04149 описывается загрузка из некоторых содержащих тиогруппу дикарбоновых кислот с длиной цепи в 6 или 7 атомов к экспрессирующему экспандазу штамму Р. chrysogenum, результатом чего является включение этих предшественников в пенициллиновый скелет и последующее расширение до соответствующих производных 7-ADCA.

Вообще, полагают, однако, что экспандаза, которая может предоставить решающее связующее звено между пенициллином N и биосинтезом цефалоспорина, имеет узкую специфичность (Маеа et al., Enzyme and Microbial Technology (1955), 17: 231-234; Baldwin et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 374-375 (1987)), что предупреждает возможность катализа окислительного расширения кольца пенициллина N с неприродными боковыми цепями.

Теперь неожиданно обнаружено, что загрузка дикарбоновых кислот с длиной цепи более 7 атомов углерода продуцирует β-лактамные производные с боковой цепью с длиной цепи или в 6, или в 7 атомов.

Настоящее изобретение относится к способу получения N-деацилированного цефалоспорина, включающему стадии • ферментации микробного штамма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы, а также экспандазной активности и необязательно ацетилтрансферазной и/или гидроксилазной активности, в присутствии предшественника боковой цепи формулы (1): НООС-Х-(СН₂)n-СООН (1), где n представляет четное число, по меньшей мере 2, и Х представляет (СН₂)_р-А-(СН₂)_q, где р и q, каждый по отдельности, представляют 0, 1, 2, 3 или 4, и А представляет СН=СН, C≡C, СНВ, С=O, О, S, NH, причем азот необязательно является замещенным, или сера необязательно является окисленной, и В представляет водород, галоген, C_1-3-алкокси, гидроксил или необязательно замещенный метил, при условии, что p+q должно составлять 2 или 3, когда А представляет СН= СН или C≡C, или p+q должно составлять 3 или 4, когда А представляет СНВ, С=O, О, S или NH, или его соли, эфира или амида, причем указанный предшественник боковой цепи дает производное ацил-6-АРА с ацильной группой, имеющей строение, соответствующее формуле (2): НООС-Х-СО- (2), где Х имеет установленные выше значения,
причем указанное производное ацил-6-АРА in situ расширяется до соответствующего производного ацил-7-ADCA и необязательно превращается затем в производное ацил-7-ADAC или ацил-7-АСА,
• извлечения производного ацил-7-цефалоспорина из ферментационного бульона,
•деацилирования указанного производного ацил-7-цефалоспорина, и
• извлечения кристаллического 7-цефалоспорина.

Настоящее изобретение относится к способу получения N-деацилированных цефалоспоринов (7-ADCA, 7-ADAC или 7-АСА) через посредство ферментативного получения их ацилированных аналогов с применением загрузки из новых предшественников боковой цепи.

Настоящее изобретение неожиданно показывает, что ферментация микробного штамма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы, а также экспандазной активности, в присутствии дикарбоновой кислоты с длиной цепи, превышающей 7 атомов, приводит в результате к образованию производного ацил-7-ADCA, содержащего ацильную группу с длиной цепи в 6 или 7 атомов соответственно.

В соответствии с изобретением, другие производные 7-ацилированных цефалоспоринов, иные чем ацил-7-ADCA, т. е. ацил-7-ADAC или ацил-7-АСА соответственно, получают с помощью микробного штамма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы, а также экспандазы, если указанный микробный штамм дополнительно экспрессирует гидроксилазу или гидроксилазу вместе с ацетилтрансферазой соответственно.

Дикарбоновая кислота, которую используют в способе изобретения, имеет строение, соответствующее формуле (1);
НООС-Х-(СН₂)_n-СООН (1),
где n представляет четное число, по меньшей мере 2, и
Х представляет (СН₂)_р-А-(СН₂)_q, где
р и q, каждый по отдельности, представляют 0, 1, 2, 3 или 4, при условии, что p+q=2, 3 или 4, и
А представляет СН=СН, C≡C, СНВ, С=O, О, S, NH, причем азот необязательно является замещенным или сера необязательно является окисленной, и В представляет водород, галоген, C_1-3-алкокси, гидроксил или необязательно замещенный метил.

По изобретению ферментация указанного микробного штамма в присутствии указанного предшественника боковой цепи формулы (1) или его соли, эфира или амида приводит, в результате, к образованию ацил-7-цефалоспоринового производного, при этом ацильная группа имеет строение, соответствующее формуле (2):
НООС-Х-СО- (2),
где Х имеет установленные выше значения.

Чтобы получить ацил-7-цефалоспориновое производное с ацильной группой с длиной цепи в 6 или 7 атомов соответственно, p+q должно быть равно 2 или 3 соответственно, когда А представляет СН=СН или C≡C, или p+q должно быть равно 3 или 4 соответственно, когда А представляет СНВ, С=O, О, S, NH, причем азот необязательно является замещенным или сера необязательно, является окисленной, и В имеет установленные выше значения.

Таким образом, ферментация микробного штамма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы, а также экспандазной активности, в присутствии соединения-предшественника формулы (1) дает производное ацил-6-АРА с ацильной группой формулы (2), которое затем расширяется in situ с образованием соответствующего производного ацил-7-ADCA. Иными словами, указанный предшественник формулы (1) метаболизируется микробным штаммом с образованием ацильной группы формулы (2). Указанная ацильная группа затем включается в β-лактамный скелет через посредство опосредованной ацилтрансферазой реакции.

Верхний предел длины цепи соединения-предшественника формулы 1, т.е. верхнее значение n не является критическим параметром. Верхний предел будет определяться, главным образом, эффективностью, с которой указанный предшественник метаболизируется микробным штаммом. Для удобства предшественник может иметь самую длинную цепь, подобную самой длинной цепи жирной кислоты, которая еще может быть метаболизирована данным микробным штаммом.

В одном из вариантов воплощения изобретения используют дикарбоновые кислоты, которые после ферментации в присутствии указанной дикарбоновой кислоты дают производное адипил-7-ADCA. Дикарбоновые кислоты, подходящие для получения адипил-7-ADCA, имеют строение, соответствующее формуле (1), где n представляет четное число, по меньшей мере 2, и Х представляет (СН₂)_р-А-(СН₂)_q, где р равен 1 и q равен 2, а А представляет CH₂. Предпочтительно указанная дикарбоновая кислота, дающая на выходе адипил-7-ADCA, является субериновой кислотой или себациновой кислотой (n=2 или 4 соответственно).

В другом варианте воплощения изобретения используют дикарбоновые кислоты, которые дают на выходе производное ацил-7-ADCA, содержащее тиогруппу в ацилгруппе формулы (2). Дикарбоновые кислоты, подходящие для получения таких ацил-7-ADCA, имеют строение, соответствующее формуле (1), где n представляет четное число, по меньшей мере 2, и Х представляет (СН₂)_р-А-(CH₂)_q, где А является S. Предпочтительно р и q равны 1, 2 или 3, и p+q=3 или 4. Наиболее предпочтительно р равен 1, а q равен 2, или р равен 2, а q равен 1 или 2.

В двух других вариантах воплощения изобретения используют дикарбоновые кислоты, дающие новые производные ацил-7-цефалоспоринов.

Во-первых, используют дикарбоновые кислоты, дающие после ферментации в присутствии указанной дикарбоновой кислоты производное пимелил-7-ADCA. Дикарбоновые кислоты, подходящие для получения пимелил-7-ADCA, имеют строение, соответствующее формуле (1), где n представляет четное число, по меньшей мере 2, и X представляет (CH₂)_p-A-(CH₂)_q, где р и q равны 2, и А является СН₂. Предпочтительно указанная кислота, дающая пимелил-7-ADCA, представляет азелаиновую кислоту (n=2).

Кроме того, используют дикарбоновые кислоты, дающие производное ацил-7-ADCA, содержащее ненасыщенную связь в ацилгруппе формулы (2). Дикарбоновые кислоты, подходящие для получения таких ацил-7-ADCA, имеют строение, соответствующее формуле (1), где п представляет четное число, по меньшей мере 2, и Х представляет (СН₂)_р-А-(СН₂)_q, где А представляет СН=СН или C≡C. Предпочтительно А представляет СН=СН, а р и q, оба, равны 1. Наиболее предпочтителен, таким образом, трансизомер последнего соединения.

Микробные штаммы, которые применимы в способе изобретения, представляют штаммы, способные продуцировать β-лактамы и экспрессирующие ацилтрансферазу, а также экспандазу. Необязательно указанные микробные штаммы могут, кроме того, экспрессировать гидроксилазу или гидроксилазу вместе с ацетилтрансферазой. Первые штаммы делают возможным получение производных ацил-7-ADCA, в то время как последние штаммы делают возможным получение производных ацил-7-ADAC или ацил-7-АСА.

Примерами таких микробных штаммов являются пенициллинпродуцирующие штаммы, обеспеченные полигенным экспрессирующим кластером, обеспечивающим экспрессию экспандазы, и цефалоспоринпродуцирующие штаммы, обеспеченные полигенным экспрессирующим кластером, обеспечивающим экспрессию ацилтрансферазы.

Экспандазные гены, которые удобно использовать, могут происходить из Acremonium chrysogenum, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces antibioticus или Nocardia lactamdurans. Ацилтрансферазный ген может происходить из Р. chrysogenum, P. nalgiovense или A. nidulans.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения используют пенициллинпродуцирующий грибковый штамм, который рекомбинантно экспрессирует экспандазу. Предпочтительнее использовать грибки рода Aspergillus или Penicillium, наиболее предпочтительно - штамм Penicillium chrysogenum. Штамм Р. chrysogenum Panlabs P14-B10, DS 18541 (депонирован в CBS под регистрационным номером 455.95) является примером подходящего хозяина для экспрессии экспандазы.

Создание рекомбинантных экспрессирующих экспандазу штаммов находится в компетенции специалиста. Примерами полигенных экспрессирующих кластеров, которые можно использовать для создания рекомбинантных экспрессирующих экспандазу грибковых штаммов, описываются в ЕР-А-0532341, Crawford et al. (Biotechnol. 13 (1995), 58-62) и WO 95/04148. Следует проявить внимание при отборе трансформированного штамма с достаточно высоким уровнем экспрессии экспандазы. Такие трансформанты можно отобрать, например, посредством проверки их способности продуцировать адипил-7-ADCA, как это описано в Crawford et al. (цит. выше).

В другом варианте воплощения изобретения используют цефалоспоринпродуцирующий штамм, который рекомбинантно экспрессирует ацилтрансферазу, например продуцирующий ацилтрансферазу штамм Acremonlum chrysogenum. Штамм A. chrysogenum, рекомбинантно экспрессирующий ацилтрансферазу, будет, таким образом, продуцировать производное ацил-7-АСА, так как штамм по природе экcпрессирует гидроксилазу и ацетилтрансферазу.

Настоящее изобретение также относится к способу извлечения производного ацил-7-цефалоспорина из ферментационного бульона микробной ферментации по изобретению с использованием определенных растворителей, например к извлечению из ферментационного бульона, экспрессирующего экспандазу штамма Р. chrysogenum, такого производного ацил-7-ADCA, как адипил-, пимелил-, 2-(карбоксиэтилтио)ацетил-, 3-(карбоксиметилтио)пропионил- или транс-β-гидромуконил-7-ADCA.

Конкретно производное 7-ацилированного цефалоспорина извлекают из ферментационного бульона путем экстракции бульонного фильтрата органическим растворителем, несмешивающимся с водой, при рН примерно ниже 4,5, и его обратной экстракции водой при рН от 4 до 10.

Бульон фильтруют и к фильтрату добавляют несмешивающийся с водой органический растворитель. Корректируют рН, чтобы экстрагировать производное 7-ацилированного цефалоспорина из водного слоя. Интервал рН должен быть ниже 4,5; предпочтительно - от 4 до 1, предпочтительнее - от 2 до 1. При этом производное 7-ацилированного цефалоспорина отделяют от многих других примесей, присутствующих в ферментационном бульоне. Предпочтительно используют меньший относительно объема водного слоя объем органического растворителя, например половину этого объема, и получают концентрированный раствор 7-ацилированного цефалоспорина, причем таким образом достигают уменьшения объемных скоростей потока. Другой возможностью является экстракция всего бульона при рН 4 или ниже. Предпочтительно бульон экстрагируют органическим растворителем, несмешивающимся с водой, при рН от 4 до 1.

Можно использовать любой растворитель, который не влияет на молекулу цефалоспорина. Подходящими растворителями являются, например, бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, спирты, такие как бутанол, и т.п. Предпочтительно используют 1-бутанол или изобутанол.

После этого 7-ацилированное производное цефалоспорина "обратно" экстрагируют водой при рН от 4 до 10, предпочтительно - от 6 до 9. И снова конечный объем можно уменьшить. Извлечение можно осуществлять при температурах от 0 до 50^oС, а предпочтительно - при температурах окружающей среды.

Производные 7-ацилированные цефалоспорины, полученные способом по изобретению, удобно применять в качестве промежуточных соединений для химического синтеза полусинтетических цефалоспоринов, так как 7-аминогруппа адекватно защищена наличием соответствующей ацильной боковой цепи.

С другой стороны, 7-ацилированные цефалоспориновые производные деацилируют в одностадийном ферментативном процессе с использованием подходящего фермента, например ацилазы Pseudomonas SE83.

Предпочтительно используют иммобилизованный фермент, чтобы иметь возможность использовать фермент повторно. Методология получения таких частиц и иммобилизации ферментов пространно описаны в ЕР-А-0222462. Величина рН водного раствора составляет, например, от рН 4 до рН 9, при которой сводится к минимуму реакция расщепления цефалоспорина и оптимизируется желательная конверсия ферментом. Так, фермент добавляют к водному раствору цефалоспорина, в то же время поддерживая рН на соответствующем уровне посредством, например, добавления неорганического основания, например, раствора гидроксида калия, или применения катионообменной смолы. Когда реакция завершается, иммобилизованный фермент удаляют фильтрацией. Другой возможностью является применение иммобилизованного фермента в колонке с неподвижным или псевдоoжиженным слоем или применение фермента в растворе и удаление продуктов посредством ультрафильтрации через полунепроницаемую мембрану. Затем реакционную смесь подкисляют в присутствии органического растворителя, несмешивающегося с водой. После корректировки рН примерно до 0,1-1,5 слои разделяют и доводят рН водного слоя до 2-5. Затем отфильтровывают кристаллический N-деацилированный цефалоспорин.

Деацилирование можно также осуществлять химически, как известно на сегодня в технике, например, через образование иминохлоридной боковой цепи, посредством добавления пентахлорида фосфора при температуре ниже 10^oС, а затем изобутанола при температурах окружающей среды или более низких температурах.

Пример 1
Ферментативное получение ацил-7-ADCA.

В качестве штамма-хозяина для конструкций полигенного экспрессирующего кластера экспандазы используют штамм Р. chrysogenum Panlabs P14-B10, депонированный в CBS под регистрационным номером 455.95.

Используемый экспрессирующий полигенный кластер, содержащий ген экспандазы под сигналами регуляции транскрипции и трансляции гена IPNS P. chrysogenum, описывается в Crawford et al. (см. выше). Условия трансформации и культивирования таковы, как описано в Crawford et al. (см. выше). Трансформанты очищают и анализируют на экспрессию фермента экспандазы посредством проверки их способности продуцировать адипил-7-ADCA, как описано в Crawford et al. (см. выше).

Продуцирующие ацил-7-ADCA трансформанты инокулируют в количестве 2•10⁶ конидий на мл в среду для посева, состоящую из (г/л) 30 глюкозы; 10 Pharmamedia (мука из семян хлопчатника); 20 твердого вещества кукурузного экстракта; 20 (NH₄)₂SO₄; 5 СаСО₃, 0,5 KH₂PO₄; 10 лактозы; 10 дрожжевого экстракта, при рН перед стерилизацией 5,6.

Посевную культуру (20 мл в 250 мл колбе Эрленмейера, закрытой ватной пробкой) инкубируют при 25^oС при 220 об/мин. Через 48 ч используют 1 мл для инокуляции 15 мл производственной питательной среды, состоящей из (г/л) 0,5 КН₂РО₄; 5 К₂SO₄; 17,5 (NH₄)₂SO₄; 140 лактозы; 20 Pharmamedia; 10 СаСО₃; 10 лярда, при рН перед стерилизацией 6,6.

После инокуляции посевной культурой к ферментационной смеси добавляют 20% исходный раствор выбранного предшественника с рН, отрегулированным до 6,5 с помощью КОН, до достижения конечной концентрации 0,5%.

Продуцирующую культуру культивируют при 25^oС при 220 об/мин, в течение 168 ч в 250 мл колбе Эрленмейера, закрытой молочным фильтром. Испарившуюся воду восполняют каждый второй день.

По окончании производственной ферментации мицелий удаляют центрифугированием или фильтрацией, а ацил-7-ADCA анализируют посредством ВЭЖХ.

Пример 2
Анализ образования ацил-7-ADCA.

Продукты ферментации от трансформированных штаммов Penicillium анализируют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Система ВЭЖХ состоит из следующих компонентов: системы доставки растворителя Р1000 (TSP), автоматического пробоотборника модели на основе непрерывного действия (Spark Holland) (инжекционный объем 3), детектора с переменной длиной волны UV150 (TSP) (установлен на 260 нм) и информационной системы РС1000 (TSP). Неподвижная фаза представляет набивку YMC, колонка ODS AQ 150*4,6 мм. Подвижная фаза состоит на 84% из фосфатного буфера, рН 6,0, к которому добавлено 0,17% гидросульфата тетрабутиламмония, и на 16% из ацетонитрила. Количество продуктов устанавливают посредством сравнения со стандартной кривой для ожидаемого ацил-7-ADCA.

Пример 3
Идентификация образовавшихся ацил-7-ADCA.

Культивируют рекомбинантный штамм Р. chrysogenum, экспрессирующий экспандазу, в соответствии с примером 1, в присутствии каждого из следующих предшественников: адипиновой кислоты, субериновой кислоты, себациновой кислоты, пимелиновой кислоты и азелаиновой кислоты.

Анализ продуктов ферментации этих ферментационных процессов по примеру 2 показывает, что ферментация в присутствии адипиновой кислоты, субериновой кислоты и себациновой кислоты приводит к образованию адипил-7-ADCA, в то время как в случае загрузки пимелиновой кислоты или азелаиновой кислоты образуется пимелил-7-ADCA.

Когда при ферментации используют высокие концентрации субериновой кислоты (2,0% вместо 0,5%), вслед за адипил-7-ADCA обнаруживают небольшое, но существенное количество суберил-7-ADCA.

Формула изобретения

1. Способ получения N-деацилированного цефалоспорина, включающий стадии: ферментации микробного штамма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы, а также экспандазной активности и необязательно ацетилтрансферазной и/или гидроксилазной активности, в присутствии предшественника боковой цепи формулы (1)
НООС-Х-(СН₂)_n-СООН (1),
где n представляет четное число, по меньшей мере 2;
Х представляет (СН₂)_р-А-(СН₂)_q, где р+q составляют 3 или 4; А представляет СНВ, где В представляет водород, С _1-3-алкокси, или необязательно замещенный метил,
или его соли, эфира или амида, причем указанный предшественник боковой цепи дает производное ацил-6-АРА с ацильной группой, имеющей строение, соответствующее формуле (2)
НООС-Х-СО- (2),
где Х имеет указанные выше значения,
причем указанное производное ацил-6-АРА in situ расширяется до соответствующего производного ацил-7-ADCA, и необязательно превращается затем в производное ацил -7-ADAC или ацил-7-АСА, извлечения производного ацил-7-цефалоспорина из ферментационного бульона, деацилирования указанного производного ацил-7-цефалоспорина, и извлечения кристаллического 7-цефалоспорина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют предшественник боковой цепи формулы (1), где n представляет четное число, по меньшей мере 2, и Х представляет (СН₂)_р-А-(СН₂)_q, где р равен 1, q равен 2 и А представляет СН₂.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный предшественник боковой цепи представляет субериновую кислоту или себациновую кислоту.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют предшественник боковой цепи формулы (1), где n представляет четное число, по меньшей мере 2, и Х представляет (СН₂)_р-А-(СН₂)_q, где р и q равны 2 и А представляет СН₂.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный предшественник боковой цепи представляет азелаиновую кислоту.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что микробный штамм представляет пенициллинпродуцирующий штамм, снабженный полигенным экспрессирующим кластером, обеспечивающим экспрессию экспандазы.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что пенициллинпродуцирующий штамм представляет Penicillium chrysogenum.

8. Способ по любому из п.6 или 7, отличающийся тем, что кристаллическим цефалоспорином является 7-ADCA.

9. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что микробный штамм представляет цефалоспоринпродуцирующий штамм, снабженный полигенным экспрессирующим кластером, обеспечивающим экспрессию ацилтрансферазы.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что цефалоспорин-продуцирующий штамм представляет Асremonium chrysogenum.

11. Способ по любому из п.9 или 10, отличающийся тем, что кристаллическим цефалоспорином является 7-АСА.