Способ получения селенсодержащего препарата биомассы спирулины

 

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологической и фармакологической промышленности. Питательную среду Заруха для культивации спирулины готовят по частям. В первую часть раствора, содержащую только NaHCO₃, К₂НРО₄•3Н₂О и Na₂CO₃ при рН<10, добавляют селенсодержащий препарат - селенистую кислоту (Н₂SeO₃). Затем первый раствор смешивают со вторым раствором, содержащим все остальные компоненты среды Заруха: NaNO₃, K₂SO₄, NaCl, MgSO₄, CaCl₂•2H₂O, FeSO₄•7H₂O, Na₂EDTA, а также микроэлементы: H₃BO₃, MnCl₂•4H₂O, ZnSO₄•7H₂O, CuSO₄•5H₂O, MoO₃, NH₄VO₃, K₂Cr₂(SO₄)₂•12H₂O, NiSO₄•7H₂O, Na₂WO₄•2H₂O, Ti₂(SO₄)₃, Co(NO₃)₂•6H₂O. Изобретение позволяет повысить биологическую ценность продукта. 1 з.п.ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к способам получения биологически активных препаратов на основе биомассы микроводоросли и может быть применено в биотехнологии, микробиологии, медицине, альгологии и пищевой промышленности.

Известен способ [1] получения диетической композиции из биомассы микроводорослей хлорелла (Chorella) и сценедесмус (Scenedesmus) и очищенного и дезодорированного рыбьего жира. Как считают авторы, эти водоросли наиболее полезны для организма, культивируются в питательной среде с добавлением селенистокислого натрия Na₂SeO₃ и накапливают селен до 1,2 мг на грамм сухой биомассы. Рыбий жир используется в связи с наличием в нем большого количества ненасыщенных жирных кислот.

Известен также способ [2] получения селенсодержащей диетической композиции для таблеток - смесь селенистокислого натрия Na₂SeО₃, порошка спирулины и витамина Е. Авторы считают, что спирулина как богатый источник белков нейтрализует токсическое действие селена, а органические соединения селена встраиваются в белки при их синтезе вместо серосодержащих аминокислот.

Качественные характеристики биомассы спирулины и их возможное изменение в процессе изготовления препаратов в патентах [1, 2] не рассматриваются вообще. В то же время широко известно, что лечебно-профлактические свойства спирулины Spirulina Platensis обусловлены именно качеством ее биомассы, богатым белковым составом, и совершенно очевидно, что для изготовления качественных селенсодержащих препаратов состав биомассы должен быть максимально сохранен при включении селена в органические молекулы. При этом концентрация селена в биомассе должна быть оптимальной. Низкое содержание селена для живых организмов так же вредно, как и высокое. Спирулина как живой организм способна регулировать оптимальное количество селена, включая его в такие соединения, как метионин, цистин, цистеин и др. Кроме того, она сама содержит витамины, ненасыщенные жирные кислоты (в том числе и γ-линоленовую), а также другие полезные вещества, сохранение которых в процессе изготовления селенсодержащих препаратов очень важно.

Известен также способ получения селенсодержащего препарата биомассы спирулины [3] с повышенным содержанием селена. Этот способ, который можно рассматривать как прототип, ставит целью включение в биомассу спирулины как можно больше селена, достигая решения технической, а не диетической и медицинской задачи. Известно, что для живых организмов чрезмерно высокие концентрации селена очень вредны. Предлагаемые концентрации Na₂SeO₃ в питательной среде дают 50 и 100 мг/л селена при культивации спирулины и токсичны для нее. При содержаниях метионина 1,16% и цистина 0,27% в клетках спирулины (http://www.spirulina.com/SPBNutrition.html) она не может естественным образом включать в свои органические молекулы столько селена. Рост клеток идет на фоне борьбы за выживание. Качество биомассы не может быть природным, и белковый состав должен меняться. Именно это и является основным недостатком прототипа.

Целью предлагаемого изобретения является получение биомассы спирулины с оптимальными концентрациями селена, наиболее полезными для организма при сохранении естественных природных свойств спирулины и ее белкового состава.

Поставленная цель достигается тем, что неорганическое соединение селена - селенистую кислоту Н₂SеО₃ первоначально вводят в раствор, содержащий лишь часть компонентов стандартной питательной водно-солевой среды Заруха [4], а именно бикарбонат натрия NаНСО₃, двузамещенный фосфорнокислый калий К₂HРO₄•3H₂O и карбонат натрия Nа₂СО₃ при рН меньше 10. В результате этого в растворе образуются соединения селена, которые впоследствии при культивации легче встраиваются в органические комплексы клеток спирулины, не нарушая их естественного состава. Вторая часть раствора, содержащая все остальные компоненты питательной среды, готовится отдельно и затем соединяется с первой частью. Перед введением культуры микроводоросли в питательную среду производят под микроскопическим контролем ее легкую гомогенизацию с целью частичного укорачивания нитей спирулины. Это способствует стимуляции ее роста после помещения в питательную среду и интенсивному эндогенному включению селена в органические биокомплексы спирулины, а также позволяет избежать вредного влияния высоких концентраций селена на свойства и структуру клеток и сохранить их естественный состав. Инокулят гомогенизованной культуры спирулины помещается в питательную среду, приготовленную по указанному способу, и затем проводится инкубация втечение 4-5 дней при освещении натриевой лампой. По окончании культивации биомасса отделяется от раствора общеизвестными методами, а затем определяется содержание в ней селена и белков. Согласно анализам концентрации селена в биомассе удовлетворяют фармакологическим требованиям, а содержание белков составляет 65%.

Полученные результаты демонстрируется следующими графическими материалами: На фиг. 1 представлена кривая накопления биомассы спирулины при культивации в накопительном режиме, из которой видно, что наилучшие условия роста биомассы обеспечиваются в течение 4-5 суток от начала культивации.

На фиг.2 показана зависимость концентрации селена в сухой биомассе спирулины от концентрации селена в питательной среде на 5 сутки от начала культивирования. Результаты получены методом эпитеплового нейтронного активационного анализа биомассы спирулины на импульсном быстром реакторе ИБР-2 ОИЯИ (г. Дубна). Из полученной кривой видны пределы концентраций селена в питательной среде (0,02-3000 мг/л) и соответствующие им концентрации селена в сухой биомассе спирулины на 4-5 день после начала культивации. Концентрация селена в биомассе 150 мг/г соответствует нормальной скорости роста культуры (фиг. 1) и является оптимальной при сохранении белкового состава и природных свойств спирулины.

На фиг. 3 показаны электрофореграммы спирулины в 10% ПААГ для образцов биомассы, выращенных без добавления селена в питательную среду (правая) и при добавлении селена в среду (левая), из которых видно, что по белковому составу образцы практически идентичны.

Пример осуществления способа. Питательная водно-солевая среда Заруха для культивации спирулины с эндогенным и интенсивным включением Se в клетки микроводросли готовится следующим образом: селенсодержащий препарат - селенистая кислота H₂SeO₃ в оптимальной концентрации ~2 мг/л вводится первоначально в часть раствора питательной среды Заруха, содержащую NaHCO₃ 13,61 г/л, К₂НРO₄•3Н₂О 1,0 г/л и Nа₂СО₃ 4,03 г/л при рН меньше 10. Затем этот раствор смешивается с другой частью раствора, содержащей остальные ингредиенты среды Заруха: NaNО₃ 2,5 г/л, K₂SО₄ 1,0 г/л, NaCl 1,0 г/л, MgSO₄ 0,2 г/л, CaCl₂•2H₂O 0,04 г/л, FeSO₄•7H₂O 0,01 г/л, Na₂EDTA 0,008 г/л, а также микроэлементы: Н₃ВО₃ 2,86•10^-3 г/л, МnСl₂•4Н₂O 1,81•10^-3 г/л, ZnSO₄•7H₂O 0,22•10^-3 г/л, CuSO₄•5Н₂O 8•10^-5 г/л, МоО₃ 15•10^-6 г/л, NH₄VO₃ 23•10^-6 г/л, K₂Cr₂(SO₄)₂•12Н₂O 96•10^-6 г/л, NiSO₄•7H₂O 48•10^-6 г/л, Na₂WO₄•2H₂O 18•10^-6 г/л, Ti₂(SO₄)₃ 40•10^-6 г/л, Со(NО₃)₂•6Н₂O 44•10^-6 г/л. Для стимулирования роста культура спирулины подвергается предварительной легкой обработке в гомогенизаторе Поттера с целью частичного укорочения ее нитей под микроскопическим контролем. Полученный после этого отстоявшийся осадок инокулята спирулины в количестве 10% (объемных) добавляется в питательную среду с селеном, приготовленную по вышеописанному способу. В этой среде в течение 4-5 дней в накопительном режиме проводится культивация спирулины при рН 8,5-11, температуре 32±1^oС и освещении натриевой лампой. Накопление биомассы показано на фиг.1. Урожай биомассы собирается фильтрацией через сито и промывкой на нем бидистилированной водой. Полученный осадок подвергается центрифугированию при 2000 g • 25', а затем лиофилизации, после чего используется для анализов.

Для определения сухого веса биомассу спирулины промывают бидистиллированой водой, подкисленной НСl до рН 4,0, центрифугируют при 16000 об/мин • 20' и полученный осадок высушивают при 70^oС 24 часа или при 150^oС 2-3 часа.

Белок определяется в центрифужном осадке, многократно промываемом метаном для удаления хлорофилла. После этого содержание белка определяется по методу Лоури [5]. Полученная величина составляет около 65%, что вполне соответствует нормальному уровню содержания белков в естественной биомассе спирулины. В полученном препарате сохраняется также и богатый естественный состав всех полезных веществ, в том числе и витаминов, один из которых, а именно витамин Е, является синергистом селена и дефицит его часто сопутствует селенодефициту.

Содержание селена в биомассе спирулины определялось методом эпитермального нейтронного активационного анализа. Зависимость концентрации селена в биомассе спирулины от его концентрации в питательной среде показана на фиг. 2.

Для контроля качества биомассы спирулины были сняты электрофореграммы спирулины в 10% ПААГ для образцов биомассы, выращенных без добавления селена в питательную среду (правая) и при добавлении селена (левая) (фиг.3), из которых видно, что по белковому составу образцы практически идентичны.

Таким образом, способ позволяет за 4-5 дней в накопительном режиме достигнуть включения приблизительно 150 мг Se на 1 г лиофилизованной биомассы спирулины без изменения ее качественных характеристик, что вполне соответствует фармакологическим дозам при изготовлении полноценных лекарственных препаратов на основе матрицы спирулины. Из научно-технической и патентой литературы не известны способы, позволяющие получать селенсодержащую биомассу спирулины с такими качественными характристиками, пригодную для производства диетических и лечебно-профилактических препаратов.

Источники информации 1. GB 2203043. 18 Mar 1987. Dietary composition. G. Baktey, P.L. Nagy, L.G. Nagy, G. Blasko, M. Grosz, Y. Palinkas, M. Boros, M. Fabian.

2. DE 3421644. 12.12.85. Diatetische Zusammensetzung. Hann M., Stemgel H.

3. RU 2096037. 20.11.97. Способ получения селенсодержащего препарата биомассы спирулины. Тамбиев А.Х., Кирикова Н.Н., Мазо В.К., Скальный А.В.

4. A. Vonshak. Spirulina Platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology and Biotechnology. Taylor and Francis, 1997.

5. Практикум по биохимии (под ред. М.П. Мешковой и С.Е. Северина), изд. МГУ, 1978, с. 90.

Формула изобретения

1. Способ получения селенсодержащего препарата биомассы спирулины путем введения неорганических соединений селена в питательную среду с последующей инкубацией культуры, отличающийся тем, что неорганическое соединение, содержащее селен - селенистую кислоту Н₂SeO₃, первоначально вводят в раствор, содержащий лишь часть компонентов питательной среды Заруха, а именно бикарбонат натрия NaHCO₃, двузамещенный фосфорнокислый калий К₂НРО₄•3Н₂О и карбонат натрия NaCO₃ при рН менее 10, и затем смешивают с остальными ее компонентами: NaNO₃, K₂SO₄, NaCl, MgSO₄, CaCl₂•2H₂O, FeSO₄•7H₂O и Na₂•EDTA. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед введением культуры спирулины в питательную среду производят ее предварительную гомогенизацию, обеспечивающую укорачивание нитей спирулины и стимуляцию ее роста.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3