Способ одновременного определения нескольких аналитов

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунохимическому анализу, и может быть использовано для улучшения аналитических и технологических характеристик иммунохимического анализа. Сущностью способа является одновременное определение нескольких аналитов - антигенов или антител путем контактирования исследуемого образца с иммобилизированным на носителе антителом или антигеном, способным связываться с аналитом, с последующим внесением гибридной молекулы, сконструированной для каждого определяемого аналита, состоящей из лигандной части, способной связываться с аналитом, полинуклеотидной части, имеющей зону связывания с комплиментарными праймерами и матричной зоны с уникальной последовательностью нуклеотидов, заданной соответственно каждому определяемому аналиту. Затем проводят полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), с помощью гибридизационного анализа определяют полученные амплифицированные продукты ПЦР, при обнаружении уникальной нуклеотидной последовательности определяют присутствие в исследуемом образце определенных аналитов. Техническим результатом является создание высокочувствительного способа одновременного определения нескольких аналитов в различных биологических жидкостях. 8 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунохимическому анализу, и предназначено для улучшения аналитических и технологических характеристик иммунохимического анализа.

Известен способ обнаружения иммуноглобулинового антитела в пробе, включающий проведение иммуноанализа, причем смешивают лигандный антиген, антитело или гаптен, связанные с биотином или его функциональным производным, антитело, направленное против детектируемого антитела, связанное с парамагнитными частицами, и хемилюминесцентное акридиновое соединение, связанное с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, с пробой для образования твердофазного связанного комплекса, проводят магнитное отделение твердой фазы от жидкой фазы, инициирование хемилюминесцентной реакции и анализ отделенной твердой фазы на присутствие хемилюминесцентного комплекса, причем присутствие хемилюминесценции является указанием на присутствие упомянутого антитела в пробе (RU, 2132070, кл. G 01 N 33/533, 1999 г.).

Недостатком способа является невозможность одновременного обнаружения большого количества различных комплексов антиген-антитело при параллельном анализе различных веществ в одной реакционной ячейке.

Техническим результатом способа является выявление в ходе одного анализа несколько аналитов при помощи гибридной молекулы.

Для достижения указанного технического результата в способе одновременного определения нескольких аналитов исследуемый образец контактируют с иммобилизированным на носителе антителом или антигеном, способным связываться с аналитом, после инкубации и промывания вносят сконструированную для каждого определяемого аналита гибридную молекулу, содержащую лигандную часть, способную связываться с аналитом, и полинуклеотидную часть, имеющую зону связывания с комплементарными праймерами, и матричную зону с уникальной последовательностью нуклеотидов, заданной соответственно каждому определяемому аналиту, образовавшийся комплекс, состоящий из гибридной молекулы, аналита и иммобилизированного антитела или антигена промывают и проводят после добавления необходимых компонентов полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), полученные амплифицированные продукты ПЦР определяют с помощью гибридизационного анализа, при этом по факту обнаружения уникальной нуклеотидной последовательности судят о присутствии в исследуемом образце определенных аналитов.

Причем праймер имеет длину от 10 до 30 нуклеотидов.

Соотношение А-Т и G-C нуклеотидов в праймере составляет 1:1.

Матричная зона составляет 30-100 нуклеотидов.

Лигандная и нуклеотидная части связаны ковалентно.

Лигандная и полинуклеотидная части связаны при помощи авидин-биотина.

Гибридизационный анализ проводят с помощью технологии ДНК-чипов.

Гибридизационный анализ проводят с помощью олигонуклеотидных зондов, меченных ферментом или радиоактивно.

Способ предназначен для определения антигенов и/или антител.

Определение проводится в сыворотке крови или в любой другой биологической жидкости.

Для положительного контроля лигандная часть гибридной молекулы подбирается к аналиту, заведомо находящемуся в образце, а для отрицательного контроля лигандная часть подбирается к аналиту, заведомо отсутствующему в образце.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Принцип метода иммунохимического определения нескольких аналитов с возможностью одновременной постановки положительного и отрицательного внутренних контролей с использованием "гибридной молекулы".

К носителю с иммобилизированными антителами и/или антигенами, способными связываться с различными аналитами, добавляют анализируемый раствор. После первой инкубации и промывки вносят "гибридные молекулы" различных типов. Каждый тип "гибридной молекулы" имеет лигандную часть, способную связываться с каким-то одним из выявляемых данной методикой аналитов. Для положительного контроля лигандная часть "гибридной молекулы" подбирается к такому аналиту, который заведомо должен находиться в образце. Для отрицательного контроля подбирается такая лигандная часть "гибридной молекулы", которая заведомо не может связаться ни с одним из аналитов в исследуемом образце. Каждому типу лигандной части должна соответствовать своя уникальная последовательность нуклеотидов в матричной зоне полинуклеотидной части "гибридной молекулы". После второй инкубации и промывки вносят праймеры и другие компоненты для проведения ПЦР. Уникальная последовательность нуклеотидов матричной зоны каждого вида "гибридной молекулы", вошедшего в состав "сэндвича", многократно копируется. На заключительном этапе проводится выявление уникальной последовательности нуклеотидов при помощи любой разновидности гибридизационного анализа (ДНК-чип) или другим пригодным для этого методом.

В качестве примера для иллюстрации работы метода для одновременного выявления нескольких аналитов предлагается тест для определения антител к core, NS3, NS4, NS5 антигенам вируса гепатита С (HCV) в сыворотке крови с положительным и отрицательными внутренними контролями.

- Рекомбинантные антигены HCV, соответствующие участкам белков, кодируемых структурной (core), и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областями генома HCV, а также антитела к иммуноглобулинам человека (для положительного внутреннего контроля) сорбируются на поверхности 96-луночных полистироловых планшетов. Для этого в каждую лунку вносят по 0,2 мл раствора рекомбинантных антигенов HCV и иммуноглобулинов человека в оптимальной концентрации в 0,01 М К-фосфатном буфере (рН 7,4) с 0,1М NaCl. Накрывают крышкой и инкубируют при температуре +4^oС. Затем лунки промывают 4 раза раствором фосфатного буфера, содержащим 0,5% твин-20 или тритон-100.

- Получение "гибридной молекулы". В данном тесте участвуют шесть различных видов "гибридных молекул". В качестве лигандной части используются core, NS3, NS4,NS5 рекомбинантные антигены HCV, антитела к иммуноглобулинам человека (для положительного внутреннего контроля). Для отрицательного внутреннего контроля в качестве лигандной части может быть использован любой инертный белок, например бычий сывороточный альбумин (БСА). Полинуклеотидные части представляют собой одноцепочную ДНК длиной 130 нуклеотидов и имеют по две зоны связывания с праймерами ПЦР длиной 20 нуклеотидов, идентичные для всех типов "гибридных молекул", которые ограничивают собой матричную зону. Последовательность нуклеотидов матричной зоны уникальна для каждого вида "гибридной молекулы".

Конъюгирование лигандной и полинуклеотидной части. Для ковалентной сшивки лигандной (рекомбинантные антигены HCV, антитела к иммуноглобулинам человека) и полинуклеотидной частей "гибридной молекулы", к 5'-концу полинуклеотидной цепочки присоединяют аминогруппу, с которой затем в ходе химической реакции связывается лиганд. Данный метод детально описан в работе Chu В. С. F., Orgel L., (1985), DNA, 4, 327.

Для нековалентного связывания частей "гибридной молекулы" при помощи авидин-биотина производят биотинилирование полинуклеотидной цепочки ДНК, а авидин конъюгируют с лигандами. Смешивая полученные реагенты, получают "гибридную молекулу".

Для биотинилирования полинуклеотидной цепочки ДНК можно использовать 3'-концевое присоединение биотина при помощи терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT), методика описана в книге "Молекулярная клиническая диагностика. Методы.", Херрингтон, Макги, М., Мир, 1999 г.

Материалы 5 х ТdТ-буфер: 5 мМ СоСl₂, 700 мМ какодилат натрия, 0,5 мМ ДТТ, 150 мМ трис-НСl, рН 6,8 Вio-11dUТР: 0,4 ммоль Полинуклеотид (до 1мкг) TdT: 50 ЕД/мкл Методика В помещенную в лед микроцентрифужную пробирку вносят следующие реактивы: 5 х TdT-бyфep 10 мкл Полинуклеотид 10 мкл (1мкг) Bio-11dUTP 1,75 мкл
TdT 1 мкл (50 EД)
Вода 27,25 мкл
Перемешивают реактивы и быстро центрифугируют в микроцентрифуге при 12000 g. Инкубируют при 37 г в течение 2 ч.

Доводят объем с полинуклеотидом до 100 мкл и очищают зонд центрифугированием на колонке. Полученный gолинуклеотид содержит на 3'-конце до трех остатков биотина.

Методика проведения иммунохимического анализа:
- В лунки планшета вносят анализируемые сыворотки. Инкубируют при температуре 37 ^oC в течение 30 мин. В том случае, если в анализируемых сыворотках имеются искомые антитела, образуется комплекс: твердая фаза - рекомбинантные антигены HCV-антитела.

- Первая промывка. Пятикратно промывают лунки фосфатным буфером с твином-20 или тритоном-100.

- В лунки планшета вносят по 100 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего шесть различных видов "гибридных молекул". Инкубируют при температуре 37 ^oC в течение 30 мин. Образуется комплекс: твердая фаза - рекомбинантные антигены HCV или антитела против человеческого иммуноглобулина (положительный внутренний контроль) - антитела, содержащиеся в анализируемом образце - соответствующий тип "гибридной молекулы"
- Вторая промывка. Пятикратно промывают лунки планшета фосфатным буфером с твином-20 или тритоном-100 для удаления гибридных молекул, не связавшихся с поверхностью лунки.

- Проведение ПЦР. В лунки вносят компоненты, необходимые для проведения ПЦР: буферный раствор, содержащий 20 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 50 мМ КСl, 3,5 мМ MgCl₂, 0,01% раствор желатина, праймеры 0,5 пмоль/л, ДНК-полимераза Taq 0.025 ед./мкл, по 0,2 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP (для всех компонентов реакционной смеси указаны конечные концентрации), 50 мкл. минерального масла. Планшет помещают в термоциклер и проводят 20-25 циклов амплификации. Каждый цикл включает: денатурацию - 95 ^oC 1мин., отжиг - 55 ^oC 30 с, элонгацию - 72 ^oC 30 с.

- На заключительном этапе проводится гибридизационный анализ продуктов ПЦР. Наличие в реакционной ячейке нуклеотидной последовательности соответствующей "гибридной молекуле" с антителами к иммуноглобулинам человека в качестве лигандной части (положительный контроль) свидетельствует о правильном проведении анализа (наличие образца в лунке, отсутствие веществ, ингибирующих иммунную реакцию, ПЦР и т.д.). Отсутствие в реакционной ячейке нуклеотидной последовательности, соответствующей "гибридной молекуле" с БСА в качестве лигандной части, свидетельствует об отсутствии неспецифической сорбции "гибридных молекул" на твердой фазе. Обнаружение полинуклеотидных последовательностей, соответствующих "гибридным молекулам" с core, NS3, NS4, NS5 антигенами в качестве лигандной части, свидетельствует о наличии антител к данным антигенам HCV в анализируемом образце сыворотки.

Предпочтительней гибридизационный анализ проводить с использованием технологии ДНК-чипов, что позволяет анализировать большое количество образцов с минимальными затратами времени и реактивов. Однако возможно использование и традиционных вариантов гибридизационного анализа. В качестве примера предлагается методика гибридизационного анализа в 96-луночном полистироловом планшете.

- На поверхность лунок 96-луночного планшета раздельно сорбируются одноцепочные ДНК, с последовательностью нуклеотидов, комплиментарной одной из шести матричных зон "гибридных молекул".

- Материал с продуктами ПЦР из реакционной ячейки переносится в каждую из шести лунок планшета.

- Во все лунки планшета вносятся олигонуклеотидные зонды, комплиментарные зоне связывания с праймерами полинуклеотидной части "гибридной молекулы", меченные ферментом.

- Планшет инкубируют. В случае наличия в анализируемом материале комплиментарных последовательностей ДНК происходит гибридизация матричной зоны полинуклеотидной части "гибридной молекулы" с ДНК, сорбированной на поверхности лунок. В свою очередь зона связывания с праймерами полинуклеотидной части "гибридной молекулы" гибридизируется с олигонуклеотидными зондами, меченными ферментом.

- Лунки планшета промывают для удаления несвязавшихся зондов.

- Вносят раствор хромогенного субстрата. По тому, в каких лунках произошло развитие окраски, судят матричные зоны каких типов "гибридных молекул" амплифицировались в ходе ПЦР.

В качестве примера, иллюстрирующего работу метода для одновременного определения антител и антигенов, предлагается тест для определения антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типов, антигена ВИЧ-1, HBsAg и антител к HCV.

- Получение носителя с иммобилизированными антителами и антигенами. Вирусный белок gp160 ВИЧ-1, синтетический пептид ANT70 ВИЧ-1 группы 0, синтетический пептид gp36 env ВИЧ-2, моноклональные антитела мыши к антигену р24 ВИЧ-1, поликлональные антитела к HBsAg, рекомбинантные антигены HCV, соответствующие участкам белков, кодируемых структурной (core) и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областями геномавируса гепатита С, а также антитела к иммуноглобулинам человека (для положительного внутреннего контроля) сорбируются на поверхности 96-луночного полистиролового планшета.

- Получение "гибридной молекулы". В качестве лигандной части используются вирусный белок gp160 ВИЧ-1, синтетический пептид ANT70 ВИЧ-1 группы 0, синтетический пептид gp36 env ВИЧ-2, моноклональные антитела мыши к антигену р24 ВИЧ-1, поликлональные антитела к HBsAg, рекомбинантные антигены HCV, соответствующие участкам белков, кодируемых структурной (core), и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областями геномавируса гепатита С, антитела к иммуноглобулинам человека (для положительного внутреннего контроля), бычий сывороточный альбумин (для отрицательного внутреннего контроля). Полинуклеотидные части представляют собой одноцепочную ДНК длиной 130 нуклеотидов и имеют по две зоны связывания с праймерамии ПЦР длиной 20 нуклеотидов, идентичные для всех типов "гибридных молекул", которые ограничивают собой матричную зону. Последовательность нуклеотидов матричной зоны уникальна для каждого типа "гибридной молекулы". Конъюгирование лигандной и полинуклеотидной частей происходит аналогично тому, как это было описано в предыдущем примере.

Методика проведения иммунохимического анализа:
- В лунки планшета вносят по 100 мкм анализируемых сывороток и по 100 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего все типы "гибридных молекул". Инкубируют 1 ч при температуре 37^oC. В случае присутствия в образце аналита образуется комплекс: твердая фаза - сорбированные антигены или антитела - аналит - соответствующий тип "гибридной молекулы".

- Промывка. Промывают лунки планшета фосфатным буфером с твином-20 или тритоном-100 восемь раз.

- Проведение ПЦР. В лунки вносят компоненты, необходимые для проведения ПЦР: буферный раствор, содержащий 20 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 50 мМ КСl, 3,5 мМ MgCl₂, 0,01% раствор желатина, праймеры 0,5 пмоль/л, ДНК-полимераза Taq 0.025 ед. /мкл, по 0,2 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP (для всех компонентов реакционной смеси указаны конечные концентрации), 50 мкл минерального масла. Планшет помещают в термоциклер и проводят 20-25 циклов амплификации. Каждый цикл включает: денатурацию - 95 ^oC 1 мин, отжиг - 55^oC 30 с, элонгацию - 72 ^oC 30 с.

- На заключительном этапе проводится гибридизационный анализ продуктов ПЦР. Факт обнаружения нуклеотидной последовательности, присущей определенному типу "гибридной молекулы" является свидетельством наличия данного аналита в образце.

В качестве примера, иллюстрирующего работу метода для одновременного выявления аналитов в биологических жидкостях, предлагается тест для определения следующих лекарственных и наркотических веществ в моче: опиаты, амфетамин, барбитурат, метадон, метаболиты бензодиазепина, пропоксифен, метаболиты кокаина, фенциклидин, каннабио-иды, метаквалон.

- Антитела к определяемым в тесте лекарственным и наркотическим соединениям сорбируются на поверхности 96-луночного полистиролового планшета.

- Получение "гибридной молекулы". В качестве лигандной части также используются антитела к определяемым лекарственным и наркотическим веществам. Полинуклеотидные части представляют собой одноцепочную ДНК длиной 130 нуклеотидов и имеют по две зоны связывания с праймерами и ПЦР длиной 20 нуклеотидов, идентичные для всех типов "гибридных молекул", которые ограничивают собой матричную зону. Последовательность нуклеотидов матричной зоны уникальна для каждого типа "гибридной молекулы". Конъюгирование лигандной и полинуклеотидной частей происходит аналогично тому, как это было описано в предыдущих примерах.

Методика проведения иммунохимического анализа:
- В лунки вносят образец. Инкубируют при комнатной температуре 10 мин. В случае, если в образце есть искомые вещества, образуется комплекс: твердая фаза - сорбированные антитела - аналит - "гибридная молекула".

- Лунки промывают фосфатно-солевым буфером пять раз.

- После добавления всех необходимых компонентов проводят ПЦР, так как это было описано в предыдущих примерах.

- Проводят анализ гибридизационный продуктов ПЦР. Выявление уникальной нуклеотидной последовательности матричной части "гибридной молекулы" будет свидетельствовать о наличии аналита в образце.

Вообще определение продуктов ПЦР можно проводить не только при помощи гибридизационного анализа. Например, если уникальность матричной зоны задавать как последовательностью нуклеотидов, так и их количеством, то для идентификации продуктов ПЦР можно использовать масс-спектрометрию.

Формула изобретения

1. Способ одновременного определения нескольких аналитов-антигенов или антител в одном образце, отличающийся тем, что исследуемый образец контактируют с иммобилизированным на носителе антителом или антигеном, способным связываться с аналитом, после инкубации и промывания вносят гибридную молекулу, сконструированную для каждого определяемого аналита, состоящую из лигандной части, способной специфически связываться с аналитом, и полинуклеотидной части, имеющей зону связывания с комплементарными праймерами и матричной зоны с уникальной последовательностью нуклеотидов, заданной соответственно каждой лигандной части, образовавшийся комплекс, состоящий из гибридной молекулы, аналита и иммобилизированного антитела или антигена, промывают и проводят полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), полученные амплифицированные продукты ПЦР определяют с помощью гибридизационного анализа, при обнаружении уникальной нуклеотидной последовательности матричной зоны гибридной молекулы определяют присутствие в исследуемом образце определенных аналитов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймер имеет длину от 10 до 30 нуклеотидов.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что соотношение А-Т и G-C нуклеотидов в праймере составляет 1:1.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что матричная зона составляет 30-100 нуклеотидов.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что лигандная и нуклеотидная части связаны ковалентно.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что лигандная и полинуклеотидная части связаны при помощи авидин-биотина.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что гибридизационный анализ проводят с помощью технологии ДНК-чипов.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что гибридизационный анализ проводят с помощью олигонуклеотидных зондов, меченных ферментом или радиоактивно.

9. Способ по пп.1, 6, 7, отличающийся тем, что для положительного контроля лигандная часть гибридной молекулы подбирается к аналиту, заведомо находящемуся в образце, а для отрицательного контроля лигадная часть подбирается к аналиту, заведомо отсутствующему в образце.