Способ конструирования бактериальных штаммов, продуцирующих аминокислоты (варианты), и способ получения аминокислоты путем ферментации с использованием сконструированных бактериальных штаммов, продуцирующих аминокислоты

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа конструирования штаммов коринеформных бактерий, обладающих повышенной продуктивностью аминокислот, а также способа получения аминокислоты путем ферментации с использованием сконструированных штаммов коринеформных бактерий. Способ конструирования щтаммов коринеформных бактерий включает введение мутации в промоторную последовательность генов биосинтеза аминокислот на хромосоме коринеформной бактерии с получением мутанта коринеформного микроорганизма. Культивирование полученного мутанта. Отбор мутанта, способного продуцировать нужную аминокислоту в больших количествах. Изобретение обеспечивает получение высокого выхода аминокислот посредством усиления и регуляции экспрессии нужного гена без использования плазмиды. 3 с. и 20 з.п. ф-лы, 26 табл., 3 ил.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть)е

Формула изобретения

1. Способ конструирования коринеформных бактерий, обладающих повышенной продуктивностью аминокислот, включающий стадии: введение мутации в промоторную последовательность генов биосинтеза аминокислот на хромосоме коринеформной бактерии в целях генерирования последовательности, подобной консенсусной последовательности с получением мутанта коринеформного микроорганизма, продуцирующего аминокислоту; культивирование этого мутанта; и отбор мутанта, способного продуцировать нужную аминокислоту в больших количествах.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, серина, фенилаланина, пролина и глутамина.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что аминокислота является глутаминовой кислотой, а промотор для гена биосинтеза выбран из группы, состоящей из промотора гена глутаматдегидрогеназы (GDH), промотора гена цитратсинтазы (CS), промотора гена изоцитратсинтазы (ICDH), промотора гена пируватдегидрогеназы (PDH) и промотора гена аконитазы (АСО).

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что промотор гена глутаматдегидрогеназы (GDH) имеет ДНК-последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) по крайней мере, одной ДНК-последовательности, выбранной из группы, состоящей из CGGTCA, TTGTCA, TTGACA и TTGCCA в области -35, (ii) последовательности ТАТААТ или той же самой последовательности ТАТААТ, но в которой основание АТААТ заменено другим основанием, в области -10, и (iii) комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что промотор для GDH имеет TGGTCA в области -35, и ТАТААТ в области -10, или TTGTCA в области -35 и ТАТААТ в области -10.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что промотор для CS имеет (i) последовательность TTGACA в области -35, (ii) последовательность ТАТААТ в области -10, или (iii) последовательность комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

7. Способ по п.3, отличающийся тем, что по крайней мере один из первого и второго промоторов для ICDH имеет (i) последовательность TTGCCA или TTGACA в области -35, (ii) последовательность ТАТААТ в области -10, или (iii) последовательность комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

8. Способ по п.3, отличающийся тем, что промотор для PDH имеет (i) последовательность TTGCCA в области -35, (ii) последовательность ТАТААТ в области -10, или (iii) последовательность комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что аминокислота является аргинином, а промотор для гена биосинтеза является промотором для аргининосукцинатсинтазы.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что промотор для аргининосукцинатсинтазы имеет ДНК-последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) по крайней мере, одной ДНК-последовательности, выбранной из группы, состоящей из TTGCCA, TTGCTA и TTGTCA в области -35, (ii) последовательности ТАТААТ или ТАТААТ, но в которой основание АТААС заменено другим основанием, в области -10, и (iii) комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что промотор для аргининосукцинатсинтазы имеет ДНК-последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) TTGTCA в области -35, (ii) последовательности ТАТААТ в области -10, и (iii) комбинации (i) и (ii).

12. Способ конструирования коринеформных бактерий, обладающих повышенной продуктивностью аминокислот, включающий стадии: введение замены в промоторную последовательность генов биосинтеза аминокислот на хромосоме коринеформной бактерии посредством рекомбинации генов в целях создания последовательности, подобной консенсусной последовательности с получением мутанта коринеформного микроорганизма, продуцирующего аминокислоту; культивирование этого мутанта; и отбор мутанта, способного продуцировать нужную аминокислоту в больших количествах.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, серина, фенилаланина, пролина и глутамина.

14. Способ по п.12, отличающийся тем, что аминокислота является глутаминовой кислотой, а промотор для гена биосинтеза выбран из группы, состоящей из промотора гена глутаматдегидрогеназы (GDH), промотора гена цитратсинтазы (CS), промотора гена изоцитратсинтазы (ICDH), промотора гена пируватдегидрогеназы (PDH) и промотора гена аконитазы (АСО).

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что промотор гена глутаматдегидрогеназы (GDH) имеет ДНК-последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) по крайней мере, одной ДНК-последовательности, выбранной из группы, состоящей из CGGTCA, TTGTCA, TTGACA и TTGCCA в области -35, (ii) последовательности ТАТААТ или той же самой последовательности ТАТААТ, но в которой основание АТААТ заменено другим основанием, в области -10, и (iii) комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что промотор для GDH имеет TGGTCA в области -35, и ТАТААТ в области -10, или TTGTCA в области -35 и ТАТААТ в области -10.

17. Способ по п.14, отличающийся тем, что промотор для CS имеет (i) последовательность TTGACA в области -35, (ii) последовательность ТАТААТ в области -10, или (iii) последовательность комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

18. Способ по п.14, отличающийся тем, что по крайней мере один из первого и второго промоторов для ICDH имеет (i) последовательность TTGCCA или TTGACA в области -35, (ii) последовательность ТАТААТ в области -10, или (iii) последовательность комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

19. Способ по п. 14, отличающийся тем, что промотор для PDH имеет (i) последовательность TTGCCA в области -35, (ii) последовательность ТАТААТ в области -10, или (iii) последовательность комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

20. Способ по п.12, отличающийся тем, что аминокислота является аргинином, а промотор для гена биосинтеза является промотором для аргининосукцинатсинтазы.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что промотор для аргининосукцинатсинтазы имеет ДНК-последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) по крайней мере, одной ДНК-последовательности, выбранной из группы, состоящей из TTGCCA, TTGCTA и TTGTCA в области -35, (ii) последовательности ТАТААТ или ТАТААТ, но в которой основание АТААС заменено другим основанием, в области -10, и (iii) комбинации (i) и (ii), где указанная последовательность не ингибирует функцию промотора.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что промотор для аргининосукцинатсинтазы имеет ДНК-последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) TTGTCA в области -35, (ii) последовательности ТАТААТ в области -10, и (iii) комбинации (i) и (ii).

23. Способ получения аминокислоты путем ферментации, включающий стадии: культивирование коринеформной бактерии, сконструированной способом по любому из пп.1-22 и имеющей повышенную продуктивность аминокислоты или коринеформной бактерии, имеющей ген глутаматсинтазы, имеющий промотор по любому из пп. 4-8 и 15-19, или коринеформной бактерии, имеющей ген аргининсинтазы, имеющий промотор по пп.10 или 21, в культуральной среде с образованием и накоплением нужной аминокислоты в культуральной среде; и сбор этой аминокислоты из культуральной среды.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125, Рисунок 126, Рисунок 127

TZ4A - Поправки к описаниям изобретений

Часть описания, где обнаружена ошибка: Текст опис., Кол. 21-22, строка 16

Напечатано: .., изоцитратратсинтаза (ICDH),...

Следует читать: .., изоцитратдегидрогеназа (ICDH),...

Номер и год публикации бюллетеня: 2-2004

Номер и год публикации бюллетеня: 29-2003

Извещение опубликовано: 20.01.2004        

TZ4A - Поправки к описаниям изобретений

Часть описания, где обнаружена ошибка: Кол. 33-34 строки 15-16

Напечатано: или изоцитратсинтезирующего фермента (ICDH).

Следует читать: или изоцитратдегидрогеназы (ICDH).

Номер и год публикации бюллетеня: 2-2004

Номер и год публикации бюллетеня: 29-2003

Извещение опубликовано: 20.01.2004        

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.09.2008

Извещение опубликовано: 20.07.2010        БИ: 20/2010

---