Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая синтез, способ получения и препарат рекомбинантного интерферона гамма человека

 

Изобретение может быть использовано в биотехнологии и фармации для создания лекарственных препаратов человеческого гамма-интерферона и касается рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез, способа получения и препарата рекомбинантного интерферона гамма человека. Сконструированная рекомбинантная плазмида pgif315 содержит промоторы, обеспечивающие высокую конститутивную экспрессию в клетках Е. coli гена, кодирующего гамма-интерферон размером 144 а.о. с молекулярной массой 16,9 кДа. Способ получения интерферона включает культивирование штамма Е. coli, трансформированного плазмидой pgif315, в питательной среде, не требующей дефицита каких-либо компонентов или добавления каких-либо индукторов для синтеза гамма-интерферона, после лизиса клеток осадок отмывают 1-3 М растворами мочевины и растворяют в 6-8 М растворе мочевины, полученный раствор наносят на катионообменный сорбент с элюцией буфером без мочевины, чем достигается ренатурация гамма-интерферона. Препарат рекомбинантного человеческого гамма-интерферона дополнительно содержит биологически инертный низкомолекулярный наполнитель и соль. Преимущество изобретения заключается в создании плазмиды, приводящей к высокому выходу гамма-интерферона. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии и фармации и может быть использовано для создания лекарственных препаратов человеческого гамма-интерферона.

Гамма интерферон (ИФН-γ) человека синтезируется активированными Т-клетками в виде предшественника с сигнальным пептидом, состоящим из 23 аминокислотных остатков (а.о.) и отщепляемым в процессе секреции. Аминокислотная последовательность "зрелого" ИФН-γ человека включает 146 а.о. и приведена ниже в таблице.

Современным способом получения человеческого гамма-интерферона является технология с использованием рекомбинантных ДНК.

Наиболее близкими аналогами изобретения являются рекомбинантная плазмида pTTgKm2, кодирующая синтез ИФН-γ человека в Escherichia coli, штамм-продуцент и способ получения рекомбинантного человеческого гамма-интерферона [Патент RU 2097428]. Плазмида pTTgKm2 сконструирована на основе плазмиды pUC 19, имеющей ген устойчивости к канамицину, триптофановый промотор, вслед за ним ген человеческого гамма-интерферона и терминаторы транскрипции rrnBT₁T₂. Эта плазмида введена в штамм С 600 Е. coli, который и является штаммом-продуцентом ИФН-γ человека. Способ получения гамма-интерферона включает культивирование клеток штамма-продуцента в среде с пониженным содержанием триптофана, лизис клеток, отмывку агрегированного белка, растворение ИФН-γ в 7 М растворе мочевины с цетавлоном, ренатурацию за счет десятикратного разведения водой, фракционирование и осаждение ИФН-γ сульфатом аммония и хроматографию на анионообменнике или дополнительно "обращенно-фазной высокоэффективной жидкости" хроматографией.

Недостатком плазмиды pTTgKm2 является то, что экспрессия гена человеческого гамма-интерферона с триптофанового промотора запускается в средах с дефицитом триптофана. В обычных питательных средах работа триптофанового промотора ослаблена (репрессирована). При этом в компонентах обычных питательных сред (таких как дрожжевой экстракт, гидролизаты казеина: триптон, пептон) содержание триптофана не ограничивается, поэтому поиск или приготовление сред с пониженным содержанием триптофана усложняет технологию и удорожает себестоимость этапа культивирования.

Кроме того, использование в качестве штамма-продуцента рекомбинантного человеческого гамма-интерферона штамма С 600 Е. coli не вполне соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам-продуцентам, в частности по продуктивности и стабильности синтезируемых рекомбинантных белков. Более продуктивные штаммы Е. coli, например: SG 20050 или BL 21, имеющие lon- и оmрТ-мутации по генам протеаз, позволяют получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах.

Способ получения гамма-интерферона, указанный в патенте RU 2097428, включает ренатурацию за счет десятикратного разведения водой ИНФ-γ, растворенного в 7 М растворе мочевины, а затем фракционирование и осаждение ИФН-γ сульфатом аммония. Это не технологично, так как операции с большими объемами растворов требуют большего расхода реагентов (того же сульфата аммония) и использования крупномасштабного оборудования. Далее в формуле изобретения указана хроматография на анионообменнике, а ИФН-γ имеет положительный заряд при рН от 0 до 10 и не может сорбироваться на положительно заряженные анионообменники.

Известен препарат генно-инженерного гамма-интеферона [Патент RU 2077336] , состоящий из интерферона и стабилизирующих добавок, включающих биологически инертный полимерный наполнитель, аминокислоту и поверхностно-активное вещество. В качестве полимерного наполнителя используется поливинилпирролидон либо декстран (полиглюкин, реополиглюкин). Недостатком применения таких наполнителей являются возможные побочные реакции у пациентов, включающие нарушения дыхания, кровообращения, аллергии вплоть до анафилактического шока [М.Д.Машковский, Лекарственные средства. М.: Медицина, 1994, с.123-128].

Сущность изобретения заключается в создании рекомбинантной плазмиды, содержащей ген для синтеза в клетках Е. coli рекомбинантного человеческого гамма-интерферона. Эта рекомбинантная плазмида отличается от известных аналогичных плазмид наличием промоторов, обеспечивающих высокую конститутивную экспрессию гена человеческого гамма-интерферона. Это при прочих равных условиях позволяет использовать обычные питательные среды, не требующих дефицита каких-либо компонентов или добавления каких-либо индукторов, что упрощает технологию и снижает себестоимость.

Плазмида может быть трансформирована в любые штаммы Е. соli, соответствующие требованиям, предъявляемым к штаммам-продуцентам, например: SG 20050 или BL 21.

Изобретение включает упрощенный способ получения гамма-интерферона, состоящий из культивирования клеток штамма-продуцента в обычной среде, лизис клеток, отмывку агрегированного белка, растворение ИФН-γ в 7 М растворе мочевины и хроматографию на катионообменнике с одновременной ренатурацией.

Изобретение также включает сухой препарат генно-инженерного гамма-интеферона, состоящий из интерферона, наполнителя и соли. В качестве наполнителя используется шестиатомный спирт, относящийся к сахарам, маннит (маннитол). Это низкомолекулярное вещество не вызывает аллергических и токсических реакций и используется в медицине в виде гипертонических (15%) растворов в качестве диуретика.

Конструирование рекомбинантной плазмиды с промоторами, обеспечивающими высокую конститутивную экспрессию гена рекомбинантного человеческого гамма-интерферона, проводили в несколько этапов.

1. Клонирование гена человеческого гамма-интерферона.

Лимфоциты периферической крови человека (10⁵ клеток) индуцировали в течение 30 минут стафилококковым энтеротоксином Б 0,04 мкг/мл, после чего промывали при 4^oС фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащим 10 мМ фосфата натрия рН 7,2 и 150 мМ натрия хлористого. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 3000 g. Для выделения и очистки м-РНК использовали набор MRI-1 фирмы Sigma. Клетки суспендировали в 3 мл лизирующего буфера, содержащего додецил сульфат натрия и РНК-азо/белковый расщепитель. Суспензию лизированных клеток пропускали 5 раз через иглу пластикового шприца для фрагментации высокомолекулярной ДНК. Инкубировали лизат в течение 60 минут при 45^oС в водяной бане. Добавляли 190 мкл 5 М NaCl и олиго(dТ)-целлюлозу, после чего перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Олиго((dТ)-целлюлозу осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 3000 g и трижды промывали связывающим буфером. Затем олиго(dТ)-целлюлозу переносили в микроколонку и промывали низкосолевым буфером на микроцентрифуге 3 раза. М-РНК смывали 100 мкл элюирующего буфера и осаждали добавлением 0,15 объемов 2 М уксуснокислого натрия и 2,5 объемов этилового спирта (96%), инкубацией при - 70^oС в течение часа и центрифугированием в течение 15 минут при 16000 g. М-РНК растворяли в 20 мкл деионизованной воды и использовали в реакции синтеза к-ДНК. Синтез к-ДНК проводили с 0,5 мкг м-РНК при 37^oС в течение часа, используя М-MuLV обратную транскриптазу, набор и протокол фирмы Pharmacia Biotech. К-ДНК амплифицировали 30 циклами (92^oС, 30 с; 62^oС, 35 с; 72^oС, 35 с) с помощью Tag-полимеразы и праймеров: TCTAGATGCAGGACCCATATGTAAAAG-AAGC и AGATCTCACTGGGAAGCTCTTCGACCTCG. Амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий рекомбинантный ген человеческого гамма интерферона, размером 440 п.о. был вырезан из электрофорезного агарозного геля и элюирован. Затем этот фрагмент ДНК был лигирован с плазмидой pUC 18, предварительно обработанной рестриктазой Smal. Лигазная смесь была трансформирована в штамм JM 83 Е. соli с высевом на L-агар, содержащий X-gal и ИПТГ. Белого цвета колонии были отобраны, и рекомбинантные плазмиды из них были выделены и подвергнуты рестрикционному анализу ферментами XbaI и BglII, сайты для которых были заложены в указанных выше праймерах.

2. Конструирование плазмиды, обеспечивающей конститутивную экспрессию гена человеческого гамма-интерферона в клетках Е. соli.

Вырезанный фрагмент ДНК размером 440 п.о. был элюирован из электрофорезного агарозного геля. К нему был добавлен синтетический гетеродуплекс из фрагментов GTACCTAATTTAATTTAAGGATTAT и CTAGATAATCCTTAAATTAAATTAG, содержащий рибосом связывающий сайт. В качестве вектора экспрессии была использована плазмида pThy 315 [Шмелев В.А. и др., Молек. Генет. Микроб. Вирусол. - 1995. - 1. - С.9-14], содержащая промоторы А 2 и A 3 фага Т 7. Из плазмиды pThy 315 был удален KpnI-BglII-фрагмент, кодирующий слитый белок фактор некроза опухолей-тимозин, и вместо него лигирована смесь фрагмента ДНК, содержащего рекомбинантный ген человеческого гамма-интерферона, и гетеродуплекс, указанные выше. Лигазная смесь была трансформирована в штамм НВ 2151 Е. coli с высевом на L-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. Отобраны рекомбинантные плазмиды, содержащие вставку фрагмента ДНК размером 440 п.о. и кодирующие синтез рекомбинантного человеческого гамма-интерферона в различных штаммах Е. coli. Рекомбинантный человеческий гамма-интерферон, кодируемый этой плазмидой pgif 315, состоит из 144 а. о., лишен трех N-концевых Cys-Tyr-Cys аминокислотных остатков в отличие от природного, имеет молекулярную массу 16,9 кДа, рI=10,36 и коэффициент экстинции раствора 1 мг/мл при 280 нм, равный 0,64.

Полученная рекомбинантная плазмида Pgif 315 характеризуется следующими признаками: - размер 3,15 т.п.н., - содержит между двумя сайтами рестриктазы EcoRI промотор А 2 и между сайтами рестриктаз EcoRI и KpnI промотор A 3 фага Т 7, - содержит между сайтами рестриктаз КрnI и XbaI рибосом связывающий сайт, - содержит между сайтами рестриктаз XbaI и BglII ген, кодирующий синтез рекомбинантного человеческого гамма-интерферона размером 144 а. о. с молекулярной массой 16,9 кДа, - содержит между двумя сайтами рестриктазы XbaI терминатор транскрипции, - имеет ген устойчивости к ампициллину.

Полученная плазмида pgif 315 после трансформации в компетентные клетки штаммов Е. coli обеспечивает высокий уровень биосинтеза рекомбинантного человеческого гамма-интерферона, определяемый электрофорезом в 15%-ном ПААГ-ДСН. Трансформируемым штаммом может быть любой штамм Е. coli, соответствующий требованиям к штаммам-продуцентам. Например: штаммы SG 20050, имеющий lon-мутацию, или BL 21, имеющий lon- и оmpТ-мутации по генам протеаз, и позволяющие получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах.

Способ получения гамма-интерферона включает: - трансформацию подходящего штамма Е. coli плазмидой pgif 315, - культивирование клеток трансформированного штамма в обычной среде, - лизис клеток и отмывка агрегированного белка,
- растворение ИФН-γ в 7 М растворе мочевины,
- хроматографию на катионообменнике с одновременной ренатурацией.

Трансформация штамма Е. coli плазмидой pgif 315.

Выращивают штамм Е. coli SG 20050 или BL 21 при 37^oС в течение ночи в 5 мл L-бульоном, содержащего 1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый. Разводят культуру свежим L-бульона в 50-100 раз и растят на качалке при 37^oС до оптической плотности при 590 нм, равной 0,2-0,3. Если оптическая плотность более 0,3, культуру разводят свежим L-бульоном до 0,1 и подращивают 30 мин. Переносят 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждают клетки при 4^oС 5000 g в течение 10 мин. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 50 мл 0,1 М CaCl₂, охлажденного на льду. Инкубируют клетки 20 мин на льду. Осаждают клетки 10 мин при 5000 об./мин, 4^oС. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 3 мл 0,1 М СаСl₂, охлажденного на льду. К компетентным клеткам можно добавить стерильный глицерин до 15% и хранить клетки для трансформации до трех месяцев при температуре минус 70^oС. Переносят 3 мл компетентных клеток в холодную пробирку и добавляют 5-10 мкг плазмидной ДНК pgif 315. Инкубируют на льду 1 ч. Переносят пробирку на 42^oС и выдерживают 5 мин. Переносят клетки в колбу с 100 мл подогретого до 37^oС L-бульона без антибиотика и инкубируют при 37^oС в течение 1-1,5 ч. Затем клетки или используют непосредственно для засева в ферментер (лучше для штамма SG 20050, трансформированного плазмидой pgif 315), или высевают на L-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина.

Культивирование клеток трансформированного штамма.

Подготавливают 7 л L-бульона с 50 мкг/мл ампициллина и заполняют ферментер вместимостью 10 л. Прогревают ферментер до температуры 37^oС и вносят посевную дозу 100 мл L-бульонной культуры свежеполученных трансформантов. Культивируют клетки при температуре 37^oС, рН 7,3 и рO₂ 60% до оптической плотности 4 ОЕ при длине волны 590 нм, затем культуру переносят в ферментер объемом 100 л, содержащий 60 л L-бульона с 50 мкг/мл ампициллина. Продолжают культивирование при температуре 37^oС, поддерживают величину рН 7,0-7,2 до оптической плотности культуры 4 ОЕ при длине волны 590 нм и затем понижают рН до 5,8-6,0 до конца процесса культивирования. рO₂ поддерживают 60-70% от насыщения до оптической плотности культуры 4 ОЕ и 40% до конца процесса. Накопление γ-интерферона в виде "телец включений" контролируют с помощью фазово-контрастного микроскопа. Процесс культивирования завершают через 1 час после достижения стационарной фазы роста. Берут пробу для определения уровня синтеза γ-интерферона методом электрофореза в 15% ПААГ-ДСН. Клетки отделяют центрифугированием или микрофильтрацией и замораживают при температуре минус 70^oС.

Лизис клеток и отмывка агрегированного γ-интерферона.

Клетки суспендируют в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-НСl рН 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторида, из расчета на 1 г клеток 5-7 мл буфера. Клетки разрушают каким-либо способом (например: замораживанием-оттаиванием, или импульсами ультразвука три раза по 40 с, или продавливанием в замороженном состоянии через фильеру в French-прессе или Х-прессе). Лизат центрифугируют 10 мин при 4^oС, 5000 g. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют раствор 1 М мочевины из расчета 10 мл на 1 г клеток, интенсивно перемешивают. Повторяют центрифугирование. Супернатант сливают, осадок суспендируют в растворе 2 М мочевины того же объема. Повторяют центрифугирование. Супернатант сливают, осадок растворяют в буфере, содержащем 0,1 М аммония ацетата рН 7,5 и 7 М мочевины, того же объема. Повторяют центрифугирование. Надосадочная жидкость представляет собой раствор γ-интерферона около 60-70%-ной электрофоретической чистоты.

Хроматографическая очистка и ренатурация γ-интерферона.

Полученный мочевинный раствор γ-интерферона наносят на хроматографическую колонку с целлюлозой КМ-52, уравновешенной буфером, содержащим 7 М мочевины, 0,1 М аммония ацетата рН 7,5 и 0,1 М натрия хлористого. Сразу после нанесения белка колонку промывают уравновешивающим буфером без мочевины до достижения базовой линии оптической плотности. γ-Интерферон элюируют буфером, содержащим 0,1 М аммония ацетата рН 7,5 и 0,18 М натрия хлористого. Фракции контролируют электрофорезом в 15% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия с окрашиванием геля красителем кумасси G-250 и определяют удельную биологическую активность методом ингибирования цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на диплоидные фибробласты человека.

Получают γ-интерферон не менее 95%-ной электрофоретической чистоты, с отношением величины оптической плотности раствора 280/254 нм более 2,5 и удельной биологической активностью (1,5-2)•10⁷ ME на мг белка.

Препарат генно-инженерного гамма-интерферона.

Очищенный гамма-интерферон стерилизуют микрофильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и используют для приготовления сухого стабильного при хранении препарата. Препарат получают путем смешивания раствора очищенного гамма-интерферона с 15%-ным стерильным раствором маннита и физиологическим раствором (150 мМ натрия хлористого). Состав препарата включает в расчете на одну дозу: гамма-интерферона 5, 25 или 50 мкг (100000, 500000 и 1000000 ME соответственно), маннита 1,2-1,5%, физиологического раствора до 1 мл.

Полученный раствор разливают в ампулы или флаконы по 1 мл и замораживают при температуре -40^oС. Режим лиофилизации включает высушивание в течение 2 часов при температуре - 40^oС, далее при постепенном повышении температуры со скоростью 2,5^oС в час и досушивание при 30^oС в течение 6-8 ч до остаточной влажности 2-5%. Полученный сухой препарат представляет собой таблетку белого цвета, растворяется в воде для инъекций в течение нескольких секунд с образованием прозрачного бесцветного или слегка желтоватого раствора. Введение препарата животным (мышам, кроликам) в дозах, превышающих терапевтические дозы для человека в 10-100 раз, не вызывает токсических реакций, повышения температуры и других побочных эффектов. При проверке антивирусной активности препарата на культуре фибробластов человека, зараженных вирусом везикулярного стоматита, ее уменьшение составило 10±5% от исходной при хранении в течение 1 года при температуре 4-8^oС.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рgif315 размером 3,15 т.п.н., кодирующая в клетках Escherichia coli рекомбинантный человеческий гамма-интерферон размером 144 а.о. с молекулярной массой 16,9 кДа, характеризующаяся следующими свойствами: содержит между двумя сайтами рестриктазы EcoRI промотор А2 и между сайтами рестриктаз EcoRI и KpnI промотор А3 фага Т7, между сайтами рестриктаз KpnI и XbaI рибосомосвязывающий сайт, между сайтами рестриктаз XbaI и BglII ген, кодирующий синтез рекомбинантного человеческого гамма-интерферона, между двумя сайтами рестриктазы XbaI терминатор транскрипции, имеет ген устойчивости к ампициллину.

2. Способ получения рекомбинантного человеческого гамма-интерферона, заключающийся в культивировании штамма Escherichia coli, трансформированного введением плазмиды, кодирующей синтез гамма-интерферона, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка, отличающийся тем, что используют плазмиду pgif315, культивирование проводят в питательной среде, не требующей дефицита каких-либо компонентов или добавления каких-либо индукторов для синтеза гамма-интерферона, после лизиса клеток осадок отмывают 1-3 М растворами мочевины и растворяют в 6-8 М растворе мочевины, полученный раствор наносят на катионообменный сорбент при рН 7,0-8,5 с элюцией буфером без мочевины с добавлением 180 мМ NaCl, чем достигается ренатурация гамма-интерферона.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что получают гамма-интерферон не менее 95%-ной электрофоретической чистоты, с отношением величины оптической плотности раствора 280/254 нм более 2,5 и удельной биологической активностью (1,5-2)•10⁷.

4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что плазмидой pgif315 трансформирован штамм E. coli, имеющий lon- и/или ompT-мутации по генам протеаз.

5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве катионообменного сорбента используют сорбент, имеющий отрицательный заряд частиц при рН 7,0-9,0.

6. Препарат рекомбинантного человеческого гамма-интерферона, включающий гамма-интерферон и стабилизирующие добавки, отличающийся тем, что содержит гамма-интерферон, полученный по любому из способов по любому из пп.2-5, а в качестве стабилизирующей добавки - маннит и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов в расчете на одну дозу: гамма-интерферон от 100000 до 1000000 МЕ, маннит 1,2-1,5% и физиологический раствор до 1 мл.

РИСУНКИ

Рисунок 1

NF4A Восстановление действия патента

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.02.2012

Дата публикации: 20.02.2012

---