Метод обнаружения антител к трансглутаминазе для применения в диагностике целиакии

 

Изобретение относится к медицине. Разработан метод диагностики целиакии, основанный на общих принципах иммунохроматографического анализа. Сущность изобретения состоит в использовании в качестве маркера антигена - трансглутаминазы, конъюгированной с таким окрашенным веществом, как частицы коллоидного золота или цветного латекса для определения в крови изотипов IgA и IgG. Конъюгированный антиген нанесен на инертный волокнистый носитель, из которого он может высвобождаться жидким биологическим образцом. Антитела в образце реагируют с конъюгированным антигеном с образованием иммунокомплекса, который мигрирует по мембране носителя из нитроцеллюлозы или нейлона с порами такого размера, который позволяет реагентам продвигаться по мембране, пока он не прореагирует с тем же антигеном трансглутаминазой, иммобилизованной на мембране в зоне реакции. Вследствие этой реакции иммунокомплекс фиксируется на месте реакции и возникает цветной сигнал. Таким образом, появление визуально наблюдаемого сигнала в зоне реакции мембраны означает положительный результат на наличие антител к трансглутаминазе в образце. Технический результат состоит в том, что метод отличается быстротой и простотой и дает возможность надежного обнаружения антител к трансглутаминазе двух изотипов IgA и IgG в образцах сыворотки, плазмы или крови человека. 4 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, в частности к биомедицинской диагностике. Технической задачей изобретения является разработка быстрого, простого и надежного, одностадийного визуального метода обнаружения антител против трансглутаминазы, обоих изотипов - IgA и IgG, в образцах сыворотки, плазмы или крови человека. В настоящее время обнаружение антител к трансглутаминазе проводится инструментальными методами - ферментным иммуносорбционным анализом (ELISA) или радиолигандным анализом (RLA). Эти методы оказались полезными для диагностики целиакии (celiac disease).

Уровень техники Целиакия - тяжелое желудочно-кишечное заболевание, поражающее генетически предрасположенных людей. Целиакия характеризуется перманентной непереносимостью белков пшеницы, ячменя, ржи и овса. Патофизиология целиакии изучена не полностью, однако известно, что присутствие токсических для пациента белков в пище вызывает полное или частичное повреждение слизистой кишечника (Brandtzaeg P. 1997. Mechanisms of gastro-intestinal reactions to food. Environmental Toxicology and Pharmacology 4: 9-24), что ведет к развитию тяжелых синдромов нарушения всасывания и вызывает понос, тошноту, боли в животе, анорексию, задержку роста, нехватку питательных веществ и анемию. Целиакию связывали с повышенным риском рака кишечника у больных (Holmes PKT. 1989. Malignancy in coeliac disease - effect of a gluten-free diet. Gut 30: 333-338). Целиакия поражает главным образом детей в возрасте до 3 лет, но она встречается и у взрослых, а также выступает в клинически нетипичной или бессимптомной форме (Ferguson A et al. 1992. Definitions and diagnostic criteria of latent and potential coeliac disease. Ed by Aurricchio S, Visakorpi JK, in Epidemiology of CD. Dyn Nutr Res, Basel, Karger 2: 119-127). Целиакия чаще встречается у пациентов с другими генетическими или аутоиммунными заболеваниями, такими как инсулин-зависимый сахарный диабет, синдром Дауна, отдельные виды дефицита IgA и герпесовидный дерматит (Sirgus N et al. 1993. Prevalence of coeliac disease in diabetic children and adolescents in Sweden. Acta Pediatr 66: 491-494; Zubillaga P et al. 1993. Down syndrome and coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 16: 168-171; Boyce N. 1997. Testing for celiac disease may be soon on the rise. LabMedica Internat 14(4):8).

Клинические симптомы целиакии можно спутать с симптомами других желудочно-кишечных заболеваний. В таких случаях ставится неправильный диагноз и больные не получают надлежащего лечения, каковым является полное устранение клейковины из их рациона. С другой стороны, если больному, не страдающему целиакией, поставлен такой диагноз, то ему придется без необходимости всю жизнь соблюдать бесклейковинную диету. Вот почему необходима точная диагностика целиакии.

В настоящее время образцовой диагностикой целиакии является биопсия кишечника, которую повторяют 3 раза: - при появлении клинических симптомов, - после нескольких месяцев бесклейковинной диеты, - после пробы на введение клейковины.

Поскольку биопсия кишечника - инвазивный метод, и разработан точный серологический тест, указанные критерии подверглись пересмотру (Walker-Smith et al. 1990. Revised criteria for diagnosis of coelical disease. Report of Working Group of European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child 65: 909-911). В настоящее время серологические тесты могут проводиться при появлении клинических симптомов, и если они положительны, то для подтверждения диагноза показана биопсия кишечника. Реакцию на лечение бесклейковинной диетой также можно проследить по серологическим тестам. Если наблюдаются расхождения между клинической реакцией на лечение и результатом серологических тестов, то назначается повторная биопсия кишечника. Разработано несколько серологических тестов для диагностики целиакии, таких как обнаружение антител к клеточным антигенам или антител к пищевым антигенам типа глиадинов. Имеются диагностические наборы для обнаружения: - антител против эндомизия, - антител против ретикулина, - антител против глиадина.

Антитела против эндомизия (АЭМ) оказались наиболее специфичными для серологического диагноза целиакии (Kapuschinska A et al. 1987. Disease specificity and dynamics of changes in IgA class anti-endomysial antibodies in celiac disease. J Pediatric Gastroenterol 6:529-534; Rossi TM et al. 1988. Relationship of endomysial antibodies to jejunal mucosal pathology: specificity towards both symptomatic and asymptomatic celiac. J Pediatr Gastroenterol Nutr 7: 858-863). Антитела против эндомизия обнаруживают методом непрямой иммунофлуоресценции (ИФ), используя срезы эндомизия обезьян или пуповины человека, которые инкубируют с образцами сыворотки. Метод требует высокого профессионализма для проведения теста и для правильной интерпретации результатов вследствие его субъективности. Но метод АЭМ не годится для анализа большого количества образцов при скринировании целиакии в группах риска вследствие его сложности и высокой стоимости. Другим недостатком является то, что при этом обнаруживаются только антитела против эндомизия изотипа IgA, хотя известно, что у некоторых больных целиакией имеется дефицит именно IgA. Эти пациенты будут отрицательными по этому тесту.

С другой стороны, для серологической диагностики целиакии также широко применялись антитела против глиадина (АГА) (Stem M et al. 1996. Validation and standardization of serological screening tests for coelical disease in 1996. 3rd EMRC/ESPGAN Workshop, Dec 5-8, 1996, Molsheim, France, pp.9-24; Catassi С et al. 1999. Quantitative antigliadin antibody measurement in clinical practice: an Italian multicentre study. Ital J Gastroenterol Hepatol 31: 366-370). АГА обнаруживают главным образом методом ELISA, который проще, чем ИФ, и может применяться для анализа большого количества образцов. Тем не менее, метод АГА менее специфичен к целиакии, чем АЭМ, и обнаружение антител изотипов IgA и IgG требует двух независимых определений. Недавно сообщалось о визуальном иммуноанализе для обнаружения АГА, в котором решены некоторые из этих проблем (Garrote JA, Sorell L, Alfonso P et al. 1999. A simple visual immunoassay for the screening of coeliac disease. Eur J Clin Invest 29: 697-699; Spanish Office for Patents and Marks No. 98011067).

В 1997г. Dietrich et al. установили, что главным, если не единственным аутоантигеном, обнаруживаемым антителами против эндомизия, является тканевая трансглутаминаза (ТТГ) - белок в 85 кДа (Dietrich W et al. 1997. Identification of tissue transglutaminase as the auto antigen of celiac disease. Nat Med 3: 797-801). Недавно сообщали об обнаружении антител к ТТГ методом ELISA или радиолигандным методом на основе ТТГ из экстрактов печени морских свинок или рекомбинантной ТТГ человека, клонированной из различных тканей (Sulkanen S et al. 1998. Tissue transglutaminase autoantibody enzyme-linked immuno-sorbent assay in detecting celiac disease. Gastroenterology 115: 1322-1328; Siessler J et al. 1999. Antibodies to human recombinant tissue transglutaminase measured by radioligand assay: Evidence for high diagnostic sensitivity for celiac disease. Horm Metab Res 31: 375-379).

Методы с антителами к трансглутаминазе проявляют близкую или большую чувствительность и специфичность при диагностике целиакии, чем АЭМ (Bazzigaluppi A et al. 1999. Comparison of tissue transglutaminase-specific antibody assays with established antibody measurement for coeliac disease. Journal of Autoimmunity 12:51-56; Amin M et al. 1999. Correlation between tissue transglutaminase antibodies and endomysium antibodies as diagnostic markers of coeliac disease. Clin Chim Acta 282:219-225). Как указано выше, методы АЭМ до недавнего времени считались наилучшим серологическим тестом для диагностики целиакии.

Однако обнаружение антител к ТТГ методами ELISA или RLA имеет некоторые ограничения. Эти методы - инструментальные, для них нужен спектрофотометр или счетчик радиоактивности и высокий профессионализм, и они трудоемки и отнимают много времени при многочисленных операциях. Кроме того, требуются два независимых определения для обнаружения антител к ТТГ типа IgG и IgA.

Были разработаны различные иммунохроматографические методы (ИХМ) для диагностики беременности, а также инфекционных и неинфекционных заболеваний. Общие принципы ИХМ имеют статус интеллектуальной собственности, в их числе Shanfung Ching et al. EP 0 299 428 B1; Rosenstein R. EP 0 284 232 B1, которые родственны настоящему изобретению.

Другими патентами защищено применение этих методов для обнаружения различных биомолекул (Campbell R. US Patent No.4, 703, 017), медпрепаратов и небелковых антигенов (Sung M. US Patent No.5, 238, 652), а также связанных с раком антигенов (Manita Hideaki et al. EP 0396801).

Главной целью настоящего изобретения является разработка простого визуального метода обнаружения антител к ТТГ. Этот метод прост в исполнении, не требует никакого лабораторного оборудования, а результаты можно получить в течение 15 минут при одностадийной операции. Метод позволяет обнаружить простым тестированием антитела к ТТГ типа IgG и IgA в крови, сыворотке или плазме, просто внося образец в указанное место и ожидая результата. Насколько нам известно, это самый легкий и быстрый метод из числа разработанных для обнаружения антител к ТТГ для диагностики целиакии. Анализ может проводиться в лабораториях с минимальной технической базой, в кабинете врача, в городских и сельских районах и даже может осуществляться самим пациентом.

Сущность изобретения Согласно настоящему изобретению был разработан иммунохроматографический метод третьего поколения для обнаружения антител к ТТГ типа IgG и IgA всего в одну стадию в крови, сыворотке или плазме человека для диагностики целиакии.

Система включает следующие основные компоненты (фиг.1).

1. Антиген - тканевая трансглутаминаза (ТТГ), полученная из природного источника или методами рекомбинантной ДНК. Антиген конъюгирован с окрашенным веществом, например частицами коллоидного золота или цветного латекса, и служит в качестве маркера в системе.

2. Инертный пористый носитель, куда наносится и высушивается конъюгированный антиген.

3. Мембрана из нитроцеллюлозы или нейлона с порами размером от 5 до 10 мкм, позволяющая реагентам мигрировать вдоль нее.

4. Антиген (ТТГ), иммобилизованный в "зоне реакции" нитроцеллюлозной или нейлоновой мембраны, с которой он прочно связан путем электростатических и гидрофобных взаимодействий.

5. Контрольный реагент, способный реагировать с конъюгированным антигеном (например, антитела к ТТГ или реагент, способный связываться с коллоидным золотом) и нанесенный на ту же мембрану в контрольной зоне, которая служит для контроля качества анализа.

6. Полоска фильтровальной бумаги на самом конце мембраны, соприкасающаяся с ней. Фильтровальная бумага позволяет устранять избыток реагентов после миграции.

Принцип тестирования основан на бивалентности молекул IgG и IgA человека в отношении специфического антигена. Это свойство дает возможность одной и той же молекуле антитела к ТТГ реагировать на одном участке связывания с антигеном в растворе, в данном случае с тканевой трансглутаминазой, конъюгированной с окрашенным веществом, а на другом участке связывания - с антигеном, фиксированным на нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране. Эта реакция проявляется возникновением цветного сигнала в "зоне реакции" мембраны (фиг. 2).

На практике, когда жидкий образец объемом 100-300 мкл наносят на конъюгированный антиген, который нанесен на инертный носитель, то антиген растворяется и мигрирует по мембране. Если в образце содержатся специфичные к ТТГ антитела, они реагируют с меченым антигеном, образуя стабильный иммунокомплекс. После этого иммунокомплексы мигрируют в "зону реакции", где они улавливаются тем же антигеном (трансглутаминазой), фиксированным на мембране. В результате этой реакции возникает цветной сигнал в "зоне реакции" вследствие отложения меченых иммунокомплексов в этом месте. В отрицательных по антителам к ТТГ образцах иммунокомплексы не образуются, поэтому цветной сигнал в "зоне реакции" мембраны не возникает (фиг.2).

В качестве контроля на качество анализа на ту же мембрану наносится реагент, реагирующий с конъюгированным антигеном в дальнейшей "контрольной зоне" (фиг.2). Таким образом, цветной сигнал возникает в "контрольной зоне" обоих образцов, положительного и отрицательного (фиг.2). Этот второй цветной сигнал служит в качестве контроля на функциональность теста.

Наконец, на самый конец мембраны помещается полоска фильтровальной бумаги, соприкасающаяся с ней, которая позволяет удалять избыток реагентов и способствовать прохождению жидкости (фиг.1).

ПРИМЕРЫ Пример 1. Методика
Тканевую трансглутаминазу, полученную из природного источника или методами рекомбинантной ДНК, конъюгируют с частицами коллоидного золота (диаметром от 20 до 40 мкм) согласно Oliver С. (Oliver С. 1994. Conjugation of colloidal gold to proteins. Chapter 38 In: Javois LC, Human Press Inc., ed. Method Mol Biol, 34: 303-307).

Когда образец сыворотки, плазмы или крови наносят на инертный носитель, на котором отложены конъюгаты, то специфичные к ТТГ антитела реагируют с конъюгированным антигеном с образованием иммунокомплекса (ИК), который мигрирует по нитроцеллюлозной (НЦ) мембране (ширина 4 мм, размер пор 5-10 мкм). Через несколько минут ИК реагирует с иммобилизованным антигеном (ТТГ) в "зоне реакции" НЦ мембраны, где возникает цветной сигнал. В отрицательных образцах, не содержащих специфичных к ТТГ антител, ИК не образуются и поэтому не наблюдается цветного сигнала в "зоне реакции" НЦ мембраны.

Пример 2. Контроль на качество анализа
Для оценки качества анализа на ту же самую НЦ мембрану адсорбируют моноклональное антитело к ТТГ в "контрольной зоне", расположенной выше "зоны реакции" относительно места нанесения образца. Когда оставшийся свободным конъюгированный антиген достигает этой зоны и реагирует с моноклональным антителом, возникает цветной сигнал.

В соответствии с приведенными выше двумя примерами результаты анализа можно интерпретировать путем визуального осмотра зоны реакции и контрольной зоны через 15 минут после нанесения образца. Возможны следующие результаты (фиг.3):
- Имеются два цветных сигнала. Образец положителен.

- Имеется только один цветной сигнал в "контрольной зоне". Образец отрицателен.

- Нет ни одного цветного сигнала. Результат недействителен. Повторить анализ.

Преимущества метода
1. Это одностадийный тест.

2. Анализ не требует никакого оборудования.

3. Легко интерпретировать результаты.

4. Результаты известны меньше, чем за 15 минут.

5. Обнаружение антител к ТТГ типа IgG и IgA в одном анализе.

6. Метод эффективен при диагностике целиакии у пациентов с дефицитом IgA.

7. Для анализа подходят образцы сыворотки, плазмы и крови.

ПЕРЕЧЕНЬ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Общая схема метода. Конъюгированный антиген (тканевая трансглутаминаза, конъюгированная с цветной меткой) нанесен на инертный волокнистый носитель. Тот же антиген (тканевая трансглутаминаза) адсорбирован в "зоне реакции" нитроцеллюлозной или нейлоновой мембраны. Моноклональное антитело к трансглутаминазе адсорбировано на мембране в дальнейшей "контрольной зоне". С правой стороны на самом конце находится полоска фильтровальной бумаги, которая позволяет удалять избыток реагентов после миграции. Широкая стрелка показывает направление движения. Также показана зона нанесения образца.

Фиг. 2. Принцип метода. Когда на конъюгированный носитель наносят жидкий образец, антитела к тканевой трансглутаминазе реагируют с конъюгированным антигеном, образуя иммунокомплекс, который мигрирует по полоске мембраны. Иммобилизованная в нитроцеллюлозе тканевая трансглутаминаза реагирует с иммуно-комплексами вследствие бивалентности молекул антитела, вызывая появление цветного сигнала в "зоне реакции". Оставшиеся свободными конъюгированные антитела и иммунокомплексы продолжают мигрировать и наконец реагируют с моноклональным антителом к ТТГ, вызывая появление второго цветного сигнала на полоске. Положительный результат, указывающий на присутствие антител к ТТГ, проявляется в виде двух находящихся рядом визуально наблюдаемых сигналов на полоске. При отрицательном анализе проявляется только один цветной сигнал в "контрольной зоне", так как иммунокомплексы не образуются.

Фиг. 3. Интерпретация результатов. Через 15 минут после нанесения образца. Только один цветной сигнал в контрольной зоне означает отрицательный результат.Два цветных сигнала означают положительный результат.

Отсутствие цветных сигналов означает, что результат недействителен, так что анализ следует повторить.

Формула изобретения

1. Способ обнаружения антител к изотипам IgA и IgG в жидких биологических образцах с помощью трансглутаминазного антигена, включающий: а) формирование иммунокомплекса между антителами в образце и антигеном - тканевой трансглутаминазой, полученной из природного источника или технологией рекомбинантной ДНК, причем антиген конъюгирован с красящим веществом и нанесен на инертный носитель, позволяющий определить высвобождение конъюгата при контакте с жидким образцом, б) взаимодействие этих иммунокомплексов с тем же антигеном - тканевой трансглутаминазой, адсорбированной на мембране в зоне реакции, что вызывает их локализацию в этой зоне.

2. Способ обнаружения антител по п.1, в котором адсорбированный антиген фиксирован на нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране с порами размером от 5 до 10 мкм, позволяющей реагентам проходить по ней.

3. Способ по п.1, в котором красящим веществом, конъюгированным с антигеном, являются частицы коллоидного золота или цветного латекса.

4. Способ по п.1, в котором оставшийся свободным конъюгированный антиген реагирует с реагентом, адсорбированным в другой зоне той же самой мембраны, вызывая появление второго цветного сигнала, который может применяться для проверки качества анализа.

5. Способ по п.1, в котором обнаружение антител к трансглутаминазе типа IgA и IgG в образцах сыворотки, плазмы или крови проводят в одну стадию.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3