Штамм pimelobacter simplex, проявляющий стероид-1,2- дегидрогеназную активность

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно микробиологическому получению 1,2-кортикостероидов. Штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ас - 1632 способен вводить 1,2-двойную связь в 4-3-кетостероиды или в 5-3-гидроксистероиды прегнанового ряда с образованием кросс-сопряженной системы в кольце А стероидной молекулы. Штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 обеспечивает проведение трансформации с нагрузкой исходного стероида до 6 г/л конверсией в целевой продукт до 99% без применения солюбилизаторов. Штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 обладает широкой специфичностью и является перспективным катализатором процессов модификации стероидов. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно касается получения стероидных медицинских препаратов с использованием микроорганизмов.

Целью изобретения является получение нового эффективного штамма бактерий, способного вводить 1,2-двойную связь в 4-3-кетостероиды или в 5-3--гидроксистероиды с образованием кросс-сопряженной системы в кольце А стероидной молекулы, обеспечивающей высокую биологическую активность стероидных медицинских препаратов прегнанового и андростанового рядов, а также соединений ряда холестана, являющихся ключевыми продуктами в их синтезе.

Процессы микробиологических трансформаций стероидных соединений, как и штаммы микроорганизмов, осуществляющие эти процессы, описаны в научной и патентной литературе [1-8]. Ряд микробиологических трансформаций стероидов имеет большое практическое значение, поскольку позволяет производить лекарства стероидной структуры. К такому ряду относится 1.2- дегидрирование стероидов, приводящее к образованию 1,4-3-кетостероидов и осуществляемое, как правило, с помощью некоторых видов бактерий родов Arthrobacter, Bacillus, Bacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus [1-3]. Чаще всего для проведения 1,2-дегидрирования используют различные штаммы вида Arthrobacter simplex (синоним Pimelobacter simplex) [9].

Трансформацию 4-3-кетостероидов в 1,4-3-кетостероиды с помощью штаммов Arthrobacter simplex осуществляют, применяя либо растущие в питательной среде клетки микроорганизма-трансформатора [4, 5], либо используя сухие клетки, полученные в результате обработки микробной биомассы ацетоном, или сушкой ее в вакууме при 55oС [6-8].

Недостатком использования растущих клеток является то, что в процессе трансформации одновременно с 1,2-дегидрированием происходит и нежелательное расщепление колец стероидной молекулы. Для того, чтобы избежать потерь стероидного субстрата, связанных с этим явлением, ферментацию проводят, добавляя к питательной среде соли тяжелых металлов, например сернокислый кобальт. Его вносят в количестве 0,04-1,6 г на 1 л культуральной жидкости в зависимости от загрузки трансформируемого стероида [4, 5].

Когда для 1,2-дегидрирования берут высушенные клетки, преимущество которых перед растущими клетками показано в [8], тогда возникает необходимость в экзогенном акцепторе электронов, в качестве которого чаще всего применяют менадион (2-метил-1,4-нафтохинон). Указанный дорогостоящий акцептор электронов добавляют к реакционной смеси в количестве до 40 г на 1 кг трансформируемого стероида [6-8].

Наиболее близким по сущности к заявляемому штамму является штамм Arthrobacter simplex ATCC 6946, обладающий 1,2-дегидрогеназной активностью [8]. С помощью этого штамма выполнено превращение ряда 4-3-кетостероидов в 1,2-дегидростероиды. Процесс 1,2-дегидрирования стероидов проводят с помощью клеток, предварительно высушенных в вакууме в течение суток при температуре 55oС. Высушенные клетки хранят при температуре 5oС. Срок хранения не указан. Сухие клетки (10 г/л) суспендируют в фосфатном буфере, в который добавляют стероидный субстрат с нагрузкой до 2,5 г/л и экзогенный акцептор электронов менадион в количестве 86 мг/л. С целью эффективной эмульсификации нерастворимых в воде стероидных субстратов, их вносят в реакционную смесь в диметилформамиде.

Недостатками описанного в [8] процесса являются: - необходимость предварительного высушивания клеток в вакууме, усложняющего технологический процесс; - использование дорогостоящего экзогенного акцептора электронов, необходимого при использовании убитых нагреванием до 55oС клеток микроорганизма; - применение органического растворителя для повышения эмульсификации стероидного субстрата.

Преимущества заявляемого штамма Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 состоит в следующем: - штамм используется в виде живых клеток; - штамм не теряет 1,2-дегидрогеназную активность при замораживании клеток и хранении при температуре от -10 до -20oС в течение 1 года; - отсутствует необходимость использования экзогенного акцептора электронов; - отсутствует необходимость использования органического растворителя.

Кроме того, отличительной особенностью данного штамма бактерий Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 является способность синтезировать в процессе размножения в питательной среде экзополисахариды, которые облегчают необходимый для трансформации молекул гидроксистероидов контакт частиц указанных стероидов с клеткой бактерии-катализатора.

Указанный штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 отличается от прототипа так же широкой специфичностью и способен одинаково эффективно превращать в 1,4-3-кетостероиды стероидные соединения как с 5-3-гидроксигруппировкой, так и с 4-3-кетогруппировкой.

Таким образом, заявляемый штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 представляет интерес как перспективный катализатор процессов модификации стероидов, в частности как катализатор реакции 1,2-дегидрирования прегнанов, в результате которой получают 1,4-3-кетостероиды с кортикоидной активностью.

Для селекции высокоэффективного штамма, осуществляющего 1,2-дегидрирование 4-3-кетостероидов и 5-3-гидроксистероидов в качестве исходной родительской культуры использован выделенный из почвы штамм бактерий 39, проявляющий стероид-1,2-дегидрогеназную активность в отношении стероидов.

Исходная культура была подвергнута чередующемуся воздействию физических (УФ-облучение), химических и (нитрозогуанидин) мутагенных факторов. Селекция штамма проведена путем ступенчатого отбора индуцированных мутантов, в результате которого получен новый стероидтрансформирующий штамм с высокой 1,2-дегидрогеназной активностью.

Новый штамм идентифицирован в Центре "Биоинженерия" РАН на основании физиологических, морфологических и культуральных признаков как Pimelobacter simplex [9].

Штамм Pimelobacter simplex депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ Ас-1632 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Морфологические признаки. В молодой культуре - мелкие палочки неправильной формы 0.4-0.81.0-5.0 мкм; старые культуры представлены кокковидными клетками 0,4-0,8 мкм. Грамположительные, неподвижные, аэробные, неспорообразующие. Колонии на МПА или кукурузно-глюкозном агаре гладкие, круглые, пастообразные, желтовато-белые. Оптимальная температура для роста 25-30oС.

Культуральные признаки. Не требователен к составу среды. Разжижает желатину. Усваивает глюкозу, ацетат, сукцинат, цитрат.

Генетические особенности штамма.

Штамм является прототрофом. Штамм является непатогенным для теплокровных животных.

Штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 способен осуществлять 1,2-дегидрирование 4-3-кетостероидов и 5-3-гидроксистероидов с концентрацией 1-6 г/л с образованием целевых 1,4-3-кетостероидов в концентрации до 6 г/л.

Использование штамма Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 может быть проиллюстрировано следующими примерами.

Пример.

Культуру Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632, в возрасте 7-10 дней, полученную на твердой кукурузно-глюкозной агаровой среде, следующего состава, г/л: глюкоза - 10, кукурузный экстракт - 10, агар-агар - 25, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,0 переносят в жидкую кукурузно-глюкозную среду (без агара) и инкубируют в колбах на качалке при 30oС и перемешивании со скоростью 220 об/мин в течение 6 ч, после чего в культуральную жидкость добавляют стероидный индуктор фермента 1,2-дегидрогеназы и продолжают инкубацию в прежних условиях в течение 14-18 ч. Биомассу отделяют от культуральной жидкости, переносят в буферный раствор, к которому добавляют водную суспензию стероида (размер частиц не более 15-20 мкм). Трансформацию осуществляют при температуре 28-30oС в аэробных условиях и интенсивном перемешивании в течение 6-20 часов. Содержание продукта трансформации оценивалось по данным ВЭЖХ анализа. Данные приведены в таблице.

Источники информации 1. А.А. Ахрем, Ю.А. Титов. Стероиды и микроорганизмы. Наука, М., 1970.

2. S. B. Mahato, S. Banerjee, and S. Podder "Phytochemistry", 1989, 28. p.7.

3. W. Charney, H.L. Herzog "Microbial transformation of steroids", 1967. Academic Press, N-Y&London 4. Weber A., Kennecke M. US Pat. 4839282 C1, 435-61.

5. Weber A., Kennecke M., Muller R. US Pat. 4431732 C1, 435-61.

6. Kominek L.A., Holly J.W. US Pat. 4524134 C1, 435-61.

7. Evans T.W. US Pat. 4684610 C1, 435-61.

8. Kominek L.A., Holly J.W. US Pat. 4704358 C1, 435-61.

9. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition, Baltimore, Williams & Wilkins, A Waverly Co., v.2, P.588, 605.


Формула изобретения

Штамм бактерий Pimelobacter simpleх ВКПМ Ас-1632, проявляющий стероид-1,2-дегидрогеназную активность.

РИСУНКИ

Рисунок 1



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: -амилазы и глюкоамилазы

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения 2-хиноксалинкарбоновой кислоты

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения 2-хиноксалинкарбоновой кислоты

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения 2-хиноксалинкарбоновой кислоты

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения 2-хиноксалинкарбоновой кислоты

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения 2-хиноксалинкарбоновой кислоты

Изобретение относится к области вирусологии, а в частности к способу получения вируса краснухи, адаптированного к фибробластам эмбрионов перепела
Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей путем имплантации или трансплантации выращенных in vitro клеток из здоровых тканей или органов, способных сохранить при соответствующих условиях культивирования физиологические функции

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается нового штамма Pseudomonas putida 17, который выделен из сточных вод аэротенков биологических очистных сооружений г

Изобретение относится к биотехнологии

Изобретение относится к биотехнологии
Изобретение относится к способу выделения и очистки будесонида - высокоэффективного гормонального бронхолитического средства

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения биологически активных веществ, в частности производных 3,17-дигидрокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-она, обладающих ценными фармакологическими свойствами

Изобретение относится к области биотехнологии, точнее к методам получения витаминов, а именно к способам получения эргостерина
Наверх