Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)

 

Изобретение относится к биотехнологии. L-аминокислоты семейства L-глутаминовой кислоты получают культивированием Escherichia coli в питательной среде. После накопления L-аминокислоты выделяют из культуральной жидкости. В качестве штамма-продуцента используют штамм, в котором способность к продукции L-аминокислот семейства L-глутаминовой кислоты увеличена за счет повышения активности белка, кодируемого геном b3434. Штамм Escherichia coli 328 (pYHGN) используют как продуцент L-аргинина, а штамм Escherichia coli 702ilvA (pYHGN) - L-пролина. Изобретение позволяет получать L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 3 с. и 6 з.п.ф-лы, 4 табл., 1 ил.

Область техники Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-аминокислот методом ферментации, и, более конкретно, к генам, полученным из бактерии Escherichia coli. Указанные гены позволяют улучшить продукцию L-аминокислот, например L-аргинина и L-пролина.

Предшествующий уровень техники Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см. , например, выложенную патентную заявку Японии 56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).

С другой стороны, повышенная экскреция L-аминокислот может увеличить продуктивность штамма, продуцирующего L-аминокислоту. Описан штамм бактерии, принадлежащей к роду Corynebacterium, обладающей повышенной экспрессией гена экскреции L-лизина (ген lysE) (WO 9723597 A2). Кроме того, описаны гены, кодирующие белки, способные к секреции L-цистеина, L-цистина, N-ацетилсерина или производных триазолидина (патент США 5972633).

К настоящему времени описаны несколько генов, кодирующих, как предполагается, мембранные белки, которые увеличивают продукцию L-аминокислот. Дополнительная копия гена rhtB делает бактерию более устойчивой к L-гомосерину и увеличивает продукцию L-гомосерина, L-треонина, L-аланина, L-валина и L-изолейцина (Европейская патентная заявка ЕР 994190 А2). Дополнительная копия гена rhtC делает бактерию более устойчивой к L-гомосерину и L-треонину и увеличивает продукцию L-гомосерина, L-треонина и L-лейцина (Европейская патентная заявка ЕР 1013765 А1). Дополнительные копии генов yahN, yeaS, yfiK и yggA увеличивают продукцию L-глутаминовой кислоты, L-треонина, L-аланина, L-гистидина, L-пролина, L-аргинина, L-валина и L-изолейцина (Европейская патентная заявка ЕР 1016710 А2). И хотя нуклеотидная последовательность всего генома Escherichia coli К-12 описана (Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C. A. et al., Science, 227, 1453-1474, 1997; ftp://ftp.genetics.wisc. edu/pub/ sequence/ecolim52. seq. gz), существует множество открытых рамок считывания, функция которых остается неизвестной.

Описание изобретения Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов, продуцирующих L-аминокислоты, и предоставление способа получения L-аминокислот, например L-аргинина и L-пролина, с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем идентификации генов, кодирующих белки, которые не вовлечены в пути биосинтеза целевых L-аминокислот, но увеличивают их продукцию. Примером такого белка может являться мембранный белок, обладающий активностью, обеспечивающей экскрецию L-аминокислот. При анализе нуклеотидной последовательности полного генома Escherichia coli были отобраны белки с 4 или более предполагаемыми трансмембранными сегментами (ТМС). В результате тщательного исследования авторы настоящего изобретения идентифицировали среди них ген, такой как b3434, и тщательно изучили его. Ген b3434 был известен как предполагаемая кодирующая последовательность, которая может кодировать белок с неизвестной функцией (номера нуклеотидов с 1463 по 2056 в нуклеотидной последовательности под номером АЕ000420 U00096 в Genbank). Ген b3434 также известен как ген yhgN. Также авторы настоящего изобретения установили, что при повышении активности белка, кодируемого геном b3434, увеличивается продуктивность штаммов, продуцирующих L-аминокислоты. Таким образом было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение включает в себя следующее: 1. Бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia, в которой продукция L-аминокислоты упомянутой бактерией увеличена за счет повышения активности белков, описанных в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии: (A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3; (B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам, таким как DL-o-метилсерин, 6-диазо-5-oксо-L-норлейцин и DL-β-гидроксинорвалин, а также придающей бактерии чувствительность к S-(2-аминоэтил)цистеину.

(Здесь и далее, белки, описанные в вышеупомянутых пунктах (А) или (В), упоминаются как "белки согласно настоящему изобретению".) 2. Бактерия в соответствии с вышеупомянутой бактерией, в которой активности белков, описанных в пунктах (А) или (В), повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии нуклеотидной последовательности в хромосоме упомянутой бактерии.

3. Бактерия в соответствии с вышеупомянутой бактерией, в которой трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора.

4. Способ получения L-аминокислоты, включающий выращивание бактерии в соответствии с вышеупомянутой бактерией в питательной среде и сбор из культуральной жидкости полученной и накопленной в ней L-аминокислоты.

5. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-аргинин.

6. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов аргининового регулона.

7. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-пролин.

8. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов биосинтеза L-пролина.

Способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-аргинина с использованием бактерии-продуцента L-аргинина, в которой повышена активность белка согласно настоящему изобретению, например, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под номером 3. Также, способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-пролина с использованием бактерии-продуцента L-пролина, в которой повышена активность белка согласно настоящему изобретению, например, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под номером 3.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.

Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia, в которой продукция L-аминокислоты указанной бактерией увеличена за счет повышения активностей белков согласно настоящему изобретению в клетке бактерии.

Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia и обладающая повышенной активностью белков, которые увеличивают продукцию целевой L-аминокислоты. Конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia и обладающая повышенной активностью белков согласно настоящему изобретению. Более конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению содержит ДНК, в которой повышена экспрессия гена b3434 на хромосоме ДНК или на плазмиде в бактерии, и обладает повышенной способностью к продукции L-аминокислоты, например L-аргинина и/или L-пролина.

К белкам согласно настоящему изобретению относятся белки, описанные в следующих пунктах (А) или (В): (A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3; (B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам, таким как DL-o-метилсерин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин и DL-β-гидроксинорвалин, а также придающей бактерии чувствительность к S-(2-аминоэтил)цистеину.

Количество "нескольких" аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 20, предпочтительно от 2 до 10 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А).

Устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам означает способность бактерии к росту на минимальной питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог в концентрации, при которой штамм дикого типа или родительский штамм не может расти, или способность бактерии расти с большей скоростью на питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог, чем штамм дикого типа или родительский штамм. Примерами аналогов L-аминокислот являются DL-o-метилсерин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, DL-β-гидроксинорвалин и подобные их соединения. Упомянутая выше концентрация L-аминокислоты или ее аналога составляет обычно от 1100 до 9600 мкг/мл, предпочтительно от 3000 до 3500 мкг/мл в случае DL-o-метилсерина; обычно от 5 до 50 мкг/мл, предпочтительно от 12 до 18 мкг/мл в случае 6-диазо-5-оксо-L-норлейцина и обычно от 25 до 250 мкг/мл, предпочтительно от 70 до 90 мкг/мл в случае DL-β-гидроксинорвалина.

Чувствительность к L-аминокислотам и/или их аналогам означает способность бактерии к росту с большим временем генерации, чем родительский штамм или штамм дикого типа, на минимальной питательной среде, содержащей некоторое количество L-аминокислоты и/или ее аналога. С другой стороны, чувствительность к L-аминокислотам и/или их аналогам означает отсутствие роста бактерии на минимальной питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог в концентрации, при которой родительский штамм или штамм дикого типа обладают способностью к росту. Примером такого аналога L-аминокислоты является S-(2-аминоэтил)цистеин. Упомянутая выше концентрация составляет обычно от 0,2 до 2,0 мкг/мл, предпочтительно от 0,5 до 1,0 мкг/мл в случае S-(2-аминоэтил)цистеина.

К бактерии согласно настоящему изобретению также относятся бактерии, в которых активности белков согласно настоящему изобретению повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии последовательности указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии.

Упомянутая ДНК, использующаяся для модификации бактерии согласно настоящему изобретению, кодирует, как предполагается, мембранный белок. Конкретно, упомянутая ДНК кодирует белок с 4 или более трансмембранными сегментами. Такая ДНК может кодировать белки, обладающие активностью по экскреции L-аминокислот. Более конкретно, ген b3434 является такой ДНК. Ген b3434 может быть получен, например, с помощью ПЦР с использованием затравок с нуклеотидной последовательностью, приведенной под номерами 1 и 2.

Анализ последовательности полного генома Escherichia coli позволил выбрать гены, кодирующие белки с 4 и более предполагаемыми ТМС. Белки с известной функцией и транспортеры, описанные Paulsen I.T., Sliwinski M.I., Saier M.H. (J.Mol.Biol., 1998, 277, 573) и Linton K.J., Higgins C.F. (Molecular Microbiology, 1998, 28(1), 5), исключили из группы, подлежащей изучению. В результате тщательного отбора среди оставшихся генов были выбраны несколько генов, кодирующих, как предполагалось, мембранные экспортеры. И было обнаружено, что повышенная экспрессия гена b3434 увеличивает продукцию L-аминокислот штаммами-продуцентами L-аминокислот.

К ДНК согласно настоящему изобретению относится ДНК, кодирующая белок, включающий делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в одно или несколько положений белка (А) или (С) при условии, что они не приводят к утрате активности указанного белка. Хотя количество "нескольких" аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка, оно может быть от 2 до 20, предпочтительно от 2 до 10 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А). ДНК, кодирующая практически такой же белок, как белок, описанный в пункте (А), может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, описанный в пункте (А), с использованием сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков будут удалены, заменены, введены или добавлены. Модифицированная подобным образом ДНК может быть получена традиционными методами, использующими обработку химическими реагентами и содержание в условиях, вызывающих мутации. К подобного рода обработкам относятся обработка ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, с помощью гидроксиламина или обработка бактерии, содержащей ДНК, с помощью УФ-излучения или химического реагента, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

К ДНК согласно настоящему изобретению относятся варианты, которые могут быть найдены в различных штаммах или вариантах бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, ввиду природного разнообразия. ДНК, кодирующая подобные варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с геном b3434 или частью указанного гена в жестких условиях, и которая кодирует белок, увеличивающий продукцию L-аминокислот. Термин "жесткие условия", упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. В качестве варианта, примером жестких условий являются условия соответствующие условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 60^oС, 1xSSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1xSSC, 0,1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном b3434, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 3. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 3, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 3, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50^oС, 2xSSC и 0,1% SDS.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, с помощью традиционных методов для того, чтобы усилить экспрессию генов, кодирующих белок согласно настоящему изобретению, и повысить активность белка в клетке бактерии.

К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы многокопийные векторы. Примерами многокопийных векторов являются pBR322, pMWl19, pUC19, pET22b и подобные им.

Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем введения некоторого числа копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации или подобным.

В случае, когда добиваются усиления экспрессии двух или более генов, указанные гены могут быть расположены вместе на одной и той же плазмиде или раздельно на различных плазмидах. Также допустимо, чтобы одни из генов располагались в хромосоме, а другие гены располагались на плазмиде.

С другой стороны, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. Например, в качестве сильных промоторов известны lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_L и P_R промоторы фага лямбда. Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением числа копий гена.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты. В качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии-продуценты L-аргинина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы AJ11531 и АJ11538 (JP 56106598 A2), АJ11593 (FERM Р-5616) и АJ11594 (FERM Р-5617) (выложенная патентная заявка Японии 57-5693) или подобные. Также, в качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии-продуценты L-пролина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (Российская патентная заявка 2000124295), мутанты, содержащие плазмиды, описанные в патенте Германии DE 3127361, мутанты, содержащие плазмиды, описанные в Bloom F.R. et al. (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34) и подобные им.

В бактерии согласно настоящему изобретению в дальнейшем может быть усилена экспрессия одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-аминокислоты. Примерами таких генов являются гены аргининового регулона, предпочтительно ген, кодирующий N-ацетилглутаматсинтазу, чувствительность к ингибированию L-аргинином по типу обратной связи, в которой утрачена (Rajagopal B. S. et al. , Appl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, No.5, p. 1805-1811). Примерами таких генов для бактерии-продуцента L-пролина являются гены биосинтеза пролина, предпочтительно ген proВ, кодирующий глутаматкиназу, чувствительность к ингибированию L-пролином по типу обратной связи в которой утрачена (патент Германии DE 3127361).

К способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-аргинина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аргинина в указанной питательной среде, и сбора L-аргинина из культуральной жидкости. Также, к способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-пролина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-пролина в указанной питательной среде, и сбора L-пролина из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, сбор и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от степени ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание, ферментация с аэрацией, при температуре от 20 до 40^oС, предпочтительно от 30 до 38^oС. рН питательной среды находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть собрана и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Краткое описание чертежей
На чертеже показана схема конструирования плазмиды pΔlacZ.

Наилучший способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение более детально описано со ссылкой на примеры. В указанных примерах аминокислоты являются аминокислотами L-конфигурации, если не указано иное.

Пример 1. Клонирование гена b3434 на плазмиде pΔlacZ.

Для клонирования гена b3434 был использован вектор pΔlacZ. Вектор pΔlacZ является производным вектора pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI, USA). Вектор рЕТ- 22b(+) был обработан рестриктазами BglII и ХbaI и лигирован с фрагментом полимеразной цепной реакции (ПЦР), полученным на плазмиде рМВ9-lac (Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982), обработанным теми же рестриктазами и содержащим промотор P_lacUV5. Для амплификации с помощью ПЦР фрагмента с промотором P_lacUV5 использовались затравки, приведенные под номерами 5 и 6. В полученную плазмиду была вставлена структурная часть гена lacZ (237 пар оснований без промотора) путем клонирования SalI-BaHI фрагмента плазмиды pJEL250 (Дымакова Е. и др. Генетика, 35,2,181-186,1999). Схема конструкции вектора pΔlacZ показана на чертеже.

Исходным материалом для клонирования предполагаемой рамки считывания b3434 из Е.coli (гена b3434) был фрагмент ПЦР, полученный с использованием ДНК из штамма Е.coli TG1 в качестве матрицы. Для синтеза этого фрагмента были использованы две затравки, нуклеотидная последовательность которых приведена под номерами 1 и 2. ПЦР осуществлялась на "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400" в следующих условиях: 40 секунд при 95^oС, 40 секунд при 47^oС, 40 секунд при 72^oС, 30 циклов. Таким образом был получен линейный фрагмент ДНК длиной 647 пар оснований, содержащий ген b3434. Данный фрагмент ПЦР был обработан рестриктазами XbaI и BamHI и введен в многокопийный вектор pΔlacZ, предварительно обработанный теми же рестриктазами.

Полученная плазмида, содержащая фрагмент ПЦР, была названа как pYHGN и содержала ген b3434 под контролем лактозного промотора (P_lacUV5).

Пример 2. Влияние амплифицированного гена b3434 на устойчивость штамма Е.coli TG1 к аминокислотам и их аналогам.

Штамм Е. coli TG1 (pYHGN) и штамм Е.coli TG1, содержащий вектор без вставки (контрольный штамм), выращивались в течение ночи в среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ночные культуры всех штаммов были разбавлены в 25 раз свежей средой LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и ИПТГ (0,5 мМ), и инкубировались в течение 2 часов при 37^oС с аэрацией. Культуры в фазе логарифмического роста были разбавлены 0,9% раствором хлорида натрия и около 1000 клеток были высеяны на чашки с твердой питательной средой Адамса, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), ИПТГ (0,5 мМ) и аминокислоту или ее аналог. После 2-4 дней инкубации при 37^oС определялись различия в размере колоний или их числе между штаммом TG1, содержащим гибридную плазмиду, и контрольным штаммом TG1. Результаты экспериментов представлены в Таблице 1.

Пример 3. Продукция аргинина штаммом, содержащим плазмиду pYHGN.

Штамм 382-продуцент аргинина был трансформирован плазмидой pYHGN, содержащей ген b3434 под контролем промотора P_lacUV5. Штамм 382 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года под инвентарным номером ВКПМ В-7926.

5 колоний каждого из штаммов 382, 382 (рΔlасZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и 382 (pYHGN) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH₄)₂SO₄ - 25,0 г/л, К₂НРO₄ - 2,0 г/л, MgSO₄•7Н₂О - 1,0 г/л, тиамин - 0,2 мг/л, дрожжевой экстракт - 5,0 г/л, глюкоза - 60 г/л и ампициллин - 100 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32^oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32^oС в течение 72 часов на роторной качалке.

Состав среды для ферментации:
(NH₄)₂SO₄ - 25 г/л
К₂НРO₄ - 2,0 г/л
MgSO₄•7Н₂O - 1,0 г/л
Тиамин - 0,2 мг/л
Дрожжевой экстракт - 5,0 г/л
Глюкоза - 60 г/л
СаСО₃ - 20 г/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество аргинина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: изопропанол - 80 мл, этилацетат - 40 мл, NH₄OH (30%) - 25 мл, Н₂О - 50 мл. Результаты приведены в Таблице 2. Как видно, гибридная плазмида pYHGN увеличивала накопление аргинина штаммом 382 - продуцентом аргинина.

Пример-ссылка. Продукция L-пролина продуцентом L-пролина, дефицитным по гену ilvA.

Клетки природного штамма Е.coli К12 (ВКПМ В-7) были обработаны мутагеном, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (0,1 мг/мл), в течение 20 минут при 37^oС, отмыты и помещены на минимальную агаризованную среду М9, дополненную 1,25 мг/мл триптона, 10 мг/мл L-пролина и 0,05 мг/мл хлорида 2,3,5-трифенилтетразолина. Большинство колоний, выросших после 3 дней инкубации при 37^oС, были окрашены красным. Несколько колоний, не способных окислять L-пролин, были белыми. Одна из этих колоний была использована в качестве исходной для получения мутантов, устойчивых к аналогам пролина (3,4-дегидроксипролин и азетидин-2-карбоксилат), каждый из которых был добавлен в агаризованную среду М9 в концентрации 2 мг/мл.

Некоторые из выросших мутантов могли продуцировать L-пролин. Наилучший продуцент L-пролина 702 был обработан бактериофагом Р1, выращенным на клетках штамма TG1, в котором ген ilvA был разрушен путем вставки гена устойчивости (Cm^r) к хлорамфениколу (Cm). Один из устойчивых к Cm трансдуктантов, 702ilvA, который стал ауксотрофным по L-изолейцину, был гораздо более эффективным продуцентом L-пролина, чем исходный прототрофный по L-изолейцину штамм 702 (Таблица 3). Питательная среда для ферментации содержала 60 г/л глюкозы, 25 г/л (NH₄)₂SO₄, 2 г/л КН₂РO₄, 1 г/л MgSO₄, 0,1 мг/л тиамина, 50 мг/л L-изолейцина и 25 г/л мела (рН 7,2). Глюкоза и мел были стерилизованы раздельно. 2 мл питательной среды были помещены в пробирки и инокулированы одной петлей исследуемых микроорганизмов, затем выращивание производилось при 37^oС в течение 2 дней на качалке.

Штаммы 702 и 702ilvA были депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 25 июля 2000 под инвентарными номерами ВКПМ В-8011 и ВКПМ В-8012 соответственно.

Пример 4. Продукция пролина штаммом, содержащим плазмиду pYHGN.

Штамм E. coli 702ilvA - продуцент пролина был трансформирован плазмидой pYHGN, содержащей ген b3434 под контролем промотора P_lacUV5.

5 колоний каждого из штаммов 702ilvA, 702ilvA (pΔlacZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и 702ilvA (pYHGN) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH₄)₂SO₄ - 18 г/л, К₂НРO₄ - 1,8 г/л, MgSO₄ - 1,2 г/л, тиамин - 0,1 мг/л, дрожжевой экстракт - 0,5 г/л, глюкоза - 60 г/л, изолейцин - 50 мг/л, ампициллин - 300 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32^oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32^oС в течение 40 часов на роторной качалке.

Состав среды для ферментации:
(NH₄)₂SO₄ - 18 г/л
К₂НРO₄ - 1,8 г/л
MgSO₄ - 1,2 г/л
СаСО₃ - 20 г/л
Тиамин - 0,1 мг/л
Глюкоза - 60 г/л
Изолейцин - 50 мг/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество пролина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: этанол - 80 мл, NH₄OH (30%) - 5 мл, H₂O - 25 мл. Результаты приведены в Таблице 4. Как видно, гибридная плазмида pYHGN увеличивала накопление пролина штаммом 702ilvA - продуцентом пролина.

Формула изобретения

1. Способ получения L-аминокислоты семейства L-глутаминовой кислоты методом ферментации, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia coli - продуцента L-аминокислоты в питательной среде и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют E. coli, способность к продукции L-аминокислоты которой дополнительно увеличена за счет увеличения активности белка, описанного в пункте (А) или (В):
(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам, таким, как DL-О-метилсерин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин и DL-β-гидроксинорвалин, а также придающей бактерии чувствительность к S-(2-аминоэтил)цистеину.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активность белка повышена путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, описанный в пункте (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии последовательности указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутой L-аминокислотой является L-аргинин.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что у упомянутой бактерии дополнительно повышена экспрессия генов аргининового регулона.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутой L-аминокислотой является L-пролин.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что у упомянутой бактерии дополнительно повышена экспрессия генов биосинтеза L-пролина.

8. Штамм Escherichia coli 382(pYHGN), трансформированный плазмидой, содержащей ген b3434, кодирующий белок по п. 1, - продуцент L-аргинина.

9. Штамм Escherichia coli 702ilvA(pYHGN), трансформированный плазмидой, содержащей ген b3434, кодирующий белок по п. 1, - продуцент L-пролина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8