Способ получения ящурного антигена типа о для иммунохимических реакций

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вирус ящура типа О штамм 1734 (Приморский) 2000 выращивают в монослое клеток ВНК-21, ПСГК-30 или IB-RS-2. Полученный вирус очищают от балластных примесей хлороформом, концентрируют полиэтиленгликолем и инактивируют аминоэтилэтиленимином. При отсутствии остаточной вирулентности и активности в РСК 1:8 и выше антиген высушивают методом лиофилизации, используя при этом стабилизаторы на основе сахарозы и желатина. Способ позволяет повысить активность и специфичность препарата. 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении антигенов для диагностики и изучения эпизоотологии и иммунологии вируса ящура животных.

Размножение вируса ящура в культуре клеток - наиболее перспективный и широко применяющийся в нашей стране метод получения большого количества вируса, необходимого при изготовлении диагностикумов, в том числе антигена - одного из основных компонентов, используемого для постановки любой иммунохимической реакции.

Известно, что вирус ящура хорошо размножается в культуре клеток почек чувствительных с.-х. животных, в культуре эксплантатов эпителия языка КРС и в некоторых перевиваемых линиях клеток: ВНК-21, IBRS-2, IFFA-3, СПЭВ и др. В культуре клеток вирус размножается, как правило, с выраженным ЦПД и накапливается в титре 6,5-8,0 lg ТЦД₅₀/мл [1-3].

При ящуре часто применяются такие тесты как реакция связывания комплемента (РСК), реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция радиальной иммунодиффузии (РРИД), реакция угнетения связывания комплемента (РУСК), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция энзиммеченых антител (РЭМА), реакция иммуноферментного анализа (ИФА) и др. [1-5].

Известен способ получения антигена типа О для РДП. Антиген готовят в виде 20%-ной вирусной суспензии, которую очищают от балластных примесей хлороформом, инактивируют теплом, концентрируют сернокислым аммонием [4].

Недостатком этого способа является то, что антикомплементарность, сообщаемая антигену сернокислым аммонием, препятствует возможности его использования в РСК и РУСК.

Известен также способ получения антигена типа О для РУСК. Антиген для РУСК готовят в виде 10%-ной вирусной суспензии, которую очищают от балластных примесей хлороформом, инактивируют бетапропиолактоном и концентрируют полиэтиленгликолем [5].

Этот метод дает возможность получить активные и специфичные антигены. Однако указанный способ пригоден только для получения лабораторных образцов, так как он малопроизводителен и трудоемок.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ получения ящурного антигена типа О для иммунохимических реакций, включающий репродукцию вирусного антигена в чувствительной биологической системе, очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей хлороформом, инактивацию вируса аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ), концентрирование антигена полиэтиленгликолем (ПЭГ) с последующим высушиванием целевого продукта. В качестве вирусного антигена используют вирус ящура O₁ 194, принятый в качестве производственного [6].

Недостатки способа-прототипа состоят в том, что он не позволяет получить антиген, пригодный для диагностики изолятов вируса ящура типа О, циркулирующего в России и различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию, и имеющего антигенные отличия от производственных штаммов O₁ 194 и O₁ 1618.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа получения антигена, который обладает высокой активностью и специфичностью и пригоден для диагностики изолятов вируса ящура типа О, циркулирующего в России и различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении активности и специфичности антигена.

Указанный технический результат достигнут созданием способа получения ящурного антигена для иммунохимических реакций, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1) способ получения ящурного антигена типа О для иммунохимических реакций; 2) репродукция вирусного антигена типа О в чувствительной биологической системе; 3) в качестве вирусного антигена используют штамм 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О, взятый в эффективном количестве; 4) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток ВНК-21; 5) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток ПСГК-30; 6) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток IB-RS-2; 7) очистка вируссодержащей суспензии от балластных примесей 10-20% хлороформа; 8) концентрирование вируса 8-10% ПЭГ м.м.6000; 9) инактивация вируса АЭЭИ в концентрации 0,02-0,05%;
10) высушивание целевого продукта.

Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ получения ящурного антигена типа О для иммунохимических реакций;
2) репродукция вирусного антигена типа О в чувствительной биологической системе;
3) в качестве вирусного антигена используют штамм 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О, взятый в эффективном количестве;
4) очистка вируссодержащей суспензии от балластных примесей;
5) концентрирование вируса;
6) инактивация вируса;
7) высушивание целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток ВНК-21;
2) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток ПСГК-30;
3) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток IB-RS-2;
4) очистка вируссодержащей суспензии от балластных примесей 10-20% хлороформа;
5) концентрирование вируса 8-10% ПЭГ м.м.6000;
6) инактивация вируса АЭЭИ в концентрации 0,02-0,05%.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ получения ящурного антигена типа О для иммунохимических реакций;
2) репродукция вирусного антигена типа О в чувствительной биологической системе;
3) очистка вируссодержащей суспензии от балластных примесей;
4) концентрирование вируса;
5) инактивация вируса;
6) высушивание целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого способа является использование в качестве вирусного антигена штамма 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О, взятого в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток ВНК-21;
2) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток ПСГК-30;
3) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток IB-RS-2;
4) очистка вируссодержащей суспензии от балластных примесей 10-20% хлороформа;
5) концентрирование вируса 8-10% ПЭГ м.м.6000;
6) инактивация вируса АЭЭИ в концентрации 0,02-0,05%.

Предлагаемый способ позволяет получить антиген, который обладает высокой активностью и специфичностью. Экспериментально подтверждена возможность его использования в иммунохимических реакциях для диагностики изолятов вируса ящура типа О, циркулирующего в России и различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию.

Исходный вирус для получения штамма 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О выделен 13.04.2000 от больных свиней в хозяйстве ОПХ "Степное" (село Элитное) Уссурийского района Приморского края РФ. Производственный штамм О₁ 1734/Приморский/2000 получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм О₁ 1734 пo данным РСК и результатам секвенирования участков генома значительно отличается от производственных штаммов О₁ 194 и О₁ 1618 (R составило 40-50% соответственно, а степень нуклеотидных различий -10-12%), а также от других штаммов вируса ящура типа О, имеющихся в коллекции ВНИИЗЖ.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (ВГНКИ) 22.03.2000 г. под регистрационным 1734/Приморский/2000/ДЕП. Штамм О₁ 1734/Приморский/2000 обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих иммунохимическую диагностику изолятов вируса ящура типа О, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в России, странах Закавказья (Грузия), а также в различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на:
фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность белка VP1 штамма 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О;
фиг.2 изображена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма 1734/Приморский/2000 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Штамм О₁ 1734/Приморский/2000 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм О₁ 1734/Приморский/2000 относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура. Форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм О₁ 1734/Приморский/2000 относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА, РН. При вакцинации КРС и свиней вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным антигеном индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:100 и в ИФА в разведении 1:3000.

При определении антигенного родства штамма О₁ 1734/Приморский/2000 с производственными штаммами и полевыми изолятами вируса ящура типа О, выделенными в 1966-2000 г. на территории России, стран СНГ и ряда других государств мира, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VP1 (фиг.1). Ее сравнительный анализ показал, что данный штамм принадлежит к новой генетической линии вируса ящура типа О. Представителей этой линии выделяли в последние годы в различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию. Исследуемый штамм вируса ящура О₁ 1734/Приморский/2000 имел наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами O₁/Вьетнам/1999 и O₁/Тайвань/1999. В то же время его гомология с представителями других генетических линий вируса ящура типа О составляла всего лишь 80-90% (фиг.2).

Филогенетические взаимоотношения исследованных изолятов с ранее изученными штаммами, выделенными в разных странах мира за три и более десятилетия, указаны на дендрограмме (фиг.2). Установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от большинства выделенных ранее изолятов, в том числе и от производственных штаммов, куда относятся используемые в настоящее время для производства средств диагностики и специфической профилактики производственные штаммы О₁ 194 и О₁ 1618. Антигенное родство вируса ящура O₁ 1737/Приморский/2000 с соответствующими производственными и ранее выделенными на территории Тайваня, Монголии, Вьетнама, Армении штаммами изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что штамм О₁ 1734/Приморский/2000 значительно отличается от производственных штаммов О₁ 194 и О₁ 1618 и находится в близком родстве с другими штаммами внутри типа О. Аналогичные результаты были получены и в ИФА.

Биотехнологические характеристики
Штамм О₁ 1734/Приморский/2000 проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также изготовления инактивированных противоящурных вакцин.

Штамм вируса О₁ 1734 репродуцируется в монослойной культуре первичнотрипсинизированных клеток свиной почки (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 20-24 час инкубирования накапливался до 6,5-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 часа. После 3-5 пассажей инкубирования накапливается до 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм О₁ 1734/Приморский/2000 является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 7х10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой мол. массой 2,8х10⁸ МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеиновая оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Проведено определение первичной структуры участка генома вируса с помощью ПЦР и сиквенса. Результаты исследований представлены на фиг.1 и 2. Сравнительный анализ показал, что данный штамм О₁ 1734/Приморский/2000 принадлежит к новой генетической линии вируса ящура типа О. Представителей этой линии выделяли в последние годы в различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию. Исследуемый вирус ящура 1734 имел наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О₁/Вьетнам/1999 и О₁/Тайвань/1999. В то же время его гомология с представителями других генетических линий вируса ящура типа О составляла всего лишь 80-90%. Исследуемый штамм О₁ 1734/Приморский/2000 существенно (10-12% различий) отличается от производственных штаммов О₁ 194 и О₁ 1618.

Физические свойства
Масса вириона 8,4•10^-18г. Коэффициент седиментации -146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность-1,45 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам
Вирус штамма О₁ 1734/Приморский/2000 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др., органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, крольчат и морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм О₁ 1734/Приморский/2000 по антигенному и иммуногенному спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа О.

Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная лабораторная диагностика вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные антигенные диагностикумы.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1.

Культуру клеток ВНК-21, выращенную в монослое в матрасах емкостью 1,5 л, заражают вирусом ящура типа О, штамм О₁ 1734/Приморский/2000, адаптированным к указанным клеткам в течение 4-5 последовательных пассажей, из расчета по меньшей мере 1 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37-38^oС. После полной дегенерации монослоя, вызванной действием вируса, жидкость из матрасов сливают в общую емкость, растворяют в ней 0,2 М NaCl и 10% ПЭГ м.м. 6000, выдерживают при +4^oС 16-18 часов и центрифугируют при 3000 g в течение 80 мин, осадок ресуспендируют в 100-кратно уменьшенном объеме буферного раствора следующего состава:
0,05 М трис - 6,05 мл
0,15 М NaCl - 8,7 мл
дистиллированная вода до 1 л.

рН доводят с помощью HCl до 7,3.

Ресуспендированный концентрат очищают от балластных примесей путем суспендирования в нем 10% хлороформа с последующим центрифугированием в течение 20-30 минут при 3000 g. Осадок удаляют, а надосадочную жидкость повторно очищают хлороформом. Очищенный концентрат вируса ящура инактивируют АЭЭИ, который добавляют в вируссодержащую суспензию в концентрации 0,02-0,05%. Инактивацию проводят при +27^oС в течение 16-18 часов. Полученный инактивированный антиген проверяют на специфическую активность в РСК и отсутствие остаточной вирулентности путем инокуляции монослоя культуры клеток СП. При отсутствии остаточной вирулентности и активности в РСК 1:8 и выше антиген подвергают лиофильному высушиванию в ампулах в объеме 0,5-1 мл.

Перед сушкой к антигену добавляют 5% сахарозы и 0,25% желатина. Полученный антиген должен обладать комплементсвязывающей активностью по меньшей мере 1:32 1:64 и выше, содержать общий вирусный белок по меньшей мере 10-16 мкг/мл, в том числе 146 S по меньшей мере 7-8 мкг/мл.

Указанным способом была приготовлена 1 серия диагностического антигена, характеристика которого приведена в таблице 2. Приведенные в таблице 2 результаты исследований свидетельствуют о том, что предлагаемым способом получен диагностический антиген, специфическая активность которого соответствует требованиям (7).

Пример 2.

Культуру клеток ПСКГ-30, выращенную в монослое в матрасах емкостью 1,5 л, заражают вирусом ящура типа О, штамм О₁ 1734/Приморский/2000, адаптированный к указанным клеткам в течение 4-5 последовательных пассажей из расчета 1 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37-38^oС. Полученный вирус очищают от балластных примесей, концентрируют, инактивируют, сушат и контролируют на специфическую активность и остаточную вирулентность так, как описано в примере 1.

Указанным способом была приготовлена 1 серия диагностического антигена. Результаты проверки его активности в РСК представлены в таблице 3.

Пример 3.

Культуру клеток IB-RS-2, выращенную в монослое в матрасах емкостью 1,5 л, заражают вирусом ящура типа О, штамм О₁ 1734/Приморский/2000, адаптированным к указанным клеткам в течение 4-5 последовательных пассажей из расчета 1 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37-38^oС. Полученный вирус очищают от балластных примесей, концентрируют, инактивируют, сушат и контролируют на специфическую активность и остаточную вирулентность так, как описано в примере 1.

Указанным способом была приготовлена 1 серия диагностического антигена. Результаты проверки его активности в РСК представлены в таблице 4.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности и условий:
-способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
-для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
-антиген, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Ререр X. Ящур. Пер. с нем. Г.А. Сурковой Под ред. и с предис. канд. вет.наук П.В. Малярца. М.: Колос, 1971, 432 с.

2. Бурдов А. Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. Под ред. А.Н. Бурдова. М.: Агропромиздат, 1990, 320 с.

3. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и др. Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП, 532-548.

4. Методические указания по выделению и идентификации штаммов вируса ящура. М.: Колос, 1974, 29 с.

5. Там же, стр. 38.

6. Инструкция по изготовлению и контролю антигенов ящурных штаммоспецифических сухих для серологических реакций (РСК, РУСК, РДП, РРИД, РПГА, РЭМА). Утверждена ГУВ МСХ СССР 28.11.79 с изменениями и дополнениями от 24.02.89 (прототип).

7. ГОСТ 25384-82.

Формула изобретения

1. Способ получения ящурного антигена типа О для иммунохимических реакций, включающий репродукцию вирусного антигена в чувствительной биологической системе, очистку, концентрирование и инактивацию вируса и высушивание целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве вирусного антигена используют штамм вируса Aphtae epizooticae, ceм. Picornaviridae, род. Aphtovirus, типа О, коллекция ВГНКИ №1734/Приморский/2000/ДЕП, в эффективном количестве.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток ВНК-21.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток ПСКГ-30.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток IB-RS-2.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей 10-20% хлороформа.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный вирус концентрируют 8-10% полиэтиленгликоля м.м. 6000.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный вирус инактивируют аминоэтилэтиленимином в концентрации 0,02-0,05%.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4