Модифицированная tn5-транспозаза, набор для транспозиции, способ транспозиции, фрагмент днк и генетическая конструкция мобильной последовательности днк

 

Изобретение относится к генетической инженерии. В заявке описан набор для транспозиции in vitro, включающий ДНК-донора, которая несет мобильный генетический элемент, фланкированный парой последовательностей-повторов внешних концов бактериального транспозона Tn5, ДНК-мишень, в которую мобильный генетический элемент может быть перенесен, и модифицированную Tn5-транспозазу. Представлена модифицированная Tn5-транспозаза, которая с меньшей вероятностью по сравнению с Tn5-транспозазой дикого типа принимает неактивную многомерную формулу. Модифицированная транспозаза имеет замену в положении 54, 372 Tn5-транспозазы дикого типа и необязательно в положении 56. Для транспозиции in vitro объединяют молекулу ДНК-донора с молекулой ДНК-мишени и с модифицированной Tn5-транспозазой. Описан фрагмент ДНК, кодирующий модифицированную Tn5-транспозазу. Генетическая конструкция мобильной последовательности ДНК включает на своих 5' и 3' концах фланкирующие последовательности 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' или 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3', совместимые с модифицированной Тn5 транспозазой. Изобретение позволяет увеличить скорость реакции транспозиции и отказаться от использования внешнего высокоэнергетического источника. 5 с. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Формула изобретения

1. Модифицированная Тn5-транспозаза, которая включает замену в положении 54 Тn5-транспозазы дикого типа, которым обусловлено то, что модифицированная транспозаза связывается с большей авидностью с последовательностями-повторами внешнего конца Тn5, чем Тn5-транспозаза дикого типа, и замену в положении 372 Тn5-транспозазы дикого типа, которым обусловлено то, что модифицированная транспозаза с меньшей вероятностью по сравнению с транспозазой дикого типа принимает неактивную многомерную форму.

2. Модифицированная Тn5-транспозаза по п.1, отличающаяся тем, что замена в положении 54 представляет собой лизин.

3. Модифицированная Тn5-транспозаза по п.1 или 2, отличающаяся тем, что замена в положении 372 представляет собой пролин.

4. Модифицированная Тn5-транспозаза по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что модифицированная транспозаза дополнительно включает мутацию, характеризующуюся заменой в положении 56 транспозазы дикого типа.

5. Модифицированная Тn5-транспозаза по п.4, отличающаяся тем, что замена в положении 56 представляет собой аланин.

6. Набор для транспозиции in vitro мобильной последовательности ДНК, включающий модифицированную Тn5-транспозазу по любому из предыдущих пунктов; молекулу ДНК-донора, включающую мобильную последовательность ДНК, причем последовательность ДНК фланкирована на своих 5'- и 3'-концах последовательностями-повторами внешнего конца, совместимыми с Тn5 транспозазой, и молекулу ДНК-мишени, в которую может переноситься мобильный генетический элемент.

7. Набор по п.6, отличающийся тем, что молекула ДНК-донора фланкирована на своих 5'- и 3'-концах фланкирующей последовательностью ДНК, которая состоит из 18 или 19 пар оснований и включает нуклеотид А в положении 10, нуклеотид Т в положении 11 и нуклеотид А в положении 12.

8. Набор по п.7, отличающийся тем, что фланкирующая последовательность включает нуклеотид в положении 4, выбранный из группы, включающей А или Т; нуклеотид в положении 15, выбранный из группы, включающей G или С; нуклеотид в положении 17, выбранный из группы, включающей А или Т; нуклеотид в положении 18, выбранный из группы, включающей G или С.

9. Набор по п.7 или 8, отличающийся тем, что фланкирующая последовательность имеет последовательность 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' или 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3'.

10. Способ транспозиции in vitro, включающий объединение молекулы ДНК-донора, которая включает мобильную представляющую интерес последовательность ДНК, фланкированную на своих 5'- и 3'-концах последовательностями-повторами внешнего конца, совместимыми с Тn5 транспозазой, с молекулой ДНК-мишени и с модифицированной Тn5-транспозазой по любому из пп.1-5.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что представляющая интерес последовательность ДНК фланкирована на своих 5'- и 3'-концах фланкирующей последовательностью ДНК, которая состоит из 18 или 19 пар оснований и включает нуклеотид А в положении 10, нуклеотид Т в положении 11 и нуклеотид А в положении 12.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что фланкирующая последовательность включает нуклеотид в положении 4, выбранный из группы, включающей А или Т; нуклеотид в положении 15, выбранный из группы, включающей G или С; нуклеотид в положении 17, выбранный из группы, включающей А или Т; нуклеотид в положении 18, выбранный из группы, включающей G или С.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что фланкирующая последовательность имеет последовательность 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' или 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3'.

14. Фрагмент ДНК, кодирующий модифицированную Тn5-транспозазу по любому из пп.1-5.

15. Фрагмент ДНК по п.14, отличающийся тем, что в Тn5-транспозазе в положении 54 присутствует остаток лизина, в положении 372 - остаток пролина.

16. Фрагмент ДНК по п.15, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1.

17. Генетическая конструкция мобильной последовательности ДНК, которая включает на своих 5'- и 3'-концах фланкирующие последовательности 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' или 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3', совместимые с модифицированной Тn5 транспозазой по п.1.

Приоритет по пунктам:

09.09.1996 по пп.1-6, 10, 14-16;

02.05.1997 по пп.7-9, 11-13, 17.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66