Способ получения баккатина и/или производных баккатина 10- гидрокситаксо-о-ацетилтрансфераза для его осуществления, способ получения этой ацетилтрансферазы и способ получения таксола и/или производных таксола

 

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения баккатина и/или производных баккатина предусматривает превращение 10-дезацетилбаккатина или производного 10-дезацетилбаккатина в присутствии 10-гидрокситаксо-О-ацетилтрансферазы и донора ацетильной группы. В качестве фермента использует ацетилтрансферазу с молекулярной массой 70-72 кДа, определяемой путем электрофореза в полиакриламидном теле в присутствии додецилсульфата натрия, которую получают из клеточных культур Taxus chinensis. Изобретение обеспечивает высокую региоспецифичность в отношении ацетилирования в положении 10, составляемую более 99%. 4 с. и 9 з.п.ф-лы, 5 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть))

Формула изобретения

1. Способ получения баккатина и/или производных баккатина, отличающийся тем, что 10-дезацетилбаккатин или производное 10-дезацетилбаккатина превращают в присутствии выделенного фермента и донора ацетильной группы, причем в качестве фермента используют 10-гидрокситаксо-О-ацетилтрансферазу, выделенную из Taxus chinensis, характеризующуюся следующими свойствами: субстратная специфичность; ацетилирует 10-дезацетилбаккатин-Ш селективно в положении 10 в присутствии донора ацетильной группы, в особенности ацетил-КоА; молекулярная масса; 70-72 кДа при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; изоэлектрическая точка; при рН 5,4 до 5,8; константа Михаэлиса-Ментена; К_м 55-65 мкМ для ацетил-КоА; рН-оптимум; от 5 до 11 (в Трис буфере при 35°С в течение 25 мин, субстрат 10-дезацитилтаксоюнаннин).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что баккатин-Ш получают из 10-дезацетилбаккатина-Ш.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что 14-гидроксибаккатин-Ш получают из 14-гидрокси-10-дезацетилбаккатина-Ш.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что таксоюнаннин С получают из 10-дезацетилтаксоюнаннина С.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что превращение осуществляют в присутствии ацетил-КоА в качестве донора ацетильной группы.

6. 10-гидрокситаксо-О-ацетилтрансфераза, выделенная из Taxus chinensis, характеризующаяся следующими свойствами: субстратная специфичность; ацетилирует 10-дезацетилбаккатин-Ш селективно в положении 10 в присутствии донора ацетильной группы, в особенности ацетил-КоА; молекулярная масса; 70-72 кДа при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; изоэлектрическая точка; при рН 5,4 до 5,8; константа Михаэлиса-Ментена; К_м 55-65 мкМ для ацетил-КоА; рН-оптимум; от 5 до 11 (в Трис буфере при 35°С в течение 25 мин, субстрат 10-дезацитилтаксоюнаннин).

7. Способ получения фермента по п.6, отличающийся тем, что его выделяют из клеточной культуры Taxus chinensis путем очистки и после каждой очистки устанавливают фракции, в которых находится фермент, добавляя 10-дезацетилбаккатин или производное 10-дезацетилбаккатина и донор ацетильной группы и обнаруживают образовавшийся продукт ацетилирования.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что способы очистки включают использование HighQ-колонки.

9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что для обнаружения содержащих фермент фракций используют 10-дезацетилбаккатин-Ш или 10-дезацетилтаксоюнаннин С.

10. Способ по любому из пп.7-9, отличающийся тем, что используют ацетил-КоА в качестве донора ацетильной группы.

11. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что обнаружение образовавшегося продукта ацетилирования осуществляют путем радиоактивного мечения.

12. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что обнаружение образовавшегося продукта ацетилирования осуществляют путем мечения с помощью тяжелого изотопа.

13. Способ получения таксола и/или производных таксола, отличающийся тем, что сначала получают баккатин или производное баккатина по любому из пп.1-5 и его путем этерификации гидроксильной группы в положении 13 производных баккатина с помощью пригодной кислоты превращают в таксол или производное таксола.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51