Вакцина против ящура типа азия-1 и способ ее изготовления

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Инактивированная вакцина против ящура типа Азия-1 содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура типа Азия-1 штамма 1737/Грузия/2000, адъювант и поддерживающую среду в эффективных соотношениях. Штамм депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным 1737/Грузия/2000/ДЕП. Вирус репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве инактиванта используют аминоэтилэтиленимин в концентрации 0,025-0,05%. Для очистки суспензии антигена от балластных примесей применяют полигексаметиленгуанидин в концентрации 0,005-0,007%. Для изготовления адсорбат-вакцины из адъювантов используют гель гидроокиси алюминия и дополнительно сапонин, а эмульсионной вакцины - масляный адъювант. Для изготовления сорбированной вакцины используют антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S + 75S) компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 2,0 мкг/мл, а эмульсионной вакцины - 4,0 мкг/мл. Изобретение позволяет повысить иммуногенную активность вакцины против вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока. 2 с. и 18 з.п. ф-лы, 10 табл.

Изобретения относятся к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и могут быть использованы при изготовлении вакцины против ящура типа Азия-1.

Ящур - это острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Для обеспечения устойчивого благополучия страны по ящуру в Российской Федерации реализуется система мероприятий, приоритетными в которой являются предупреждение заноса вируса на территорию, а в районах высокой степени риска - вакцинопрофилактика. В настоящее время в Российской Федерации и странах СНГ для иммунизации крупного рогатого скота против ящура применяют, как правило, инактивированные сорбированные, а для иммунизации свиней - инактивированные эмульсионные вакцины (1).

Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты (РПЗ) или чаще в реакции перекрестной нейтрализации (РПН). Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины. Кроме того, к производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения компонентов вируса при инактивации и длительном хранении (2).

Хорошо известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов. Считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, до появления совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами (2, 3).

Известны штаммы вируса ящура типа Азия-1, которые регистрировались на территории СССР: в Армении в 1973 и 1984 гг., в Таджикистане в 1974 г., в Туркмении в 1978 г. и в Грузии в 1984 и 2000 гг.

Известен также штамм Азия-1 48, используемый на протяжении ряда лет в качестве производственного при изготовлении диагностических препаратов и противоящурных инактивированных вакцин, применявшихся в различных регионах страны (4).

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ящура типа Азия-1, содержащая авирулентный и очищенный антигенный материал из иммуногенных компонентов вируса ящура Азия-1 48, репродуцированного в чувствительной биологической системе, адъювант и поддерживающую среду (5).

Штамм Азия-1 48 выделен 19.11.64 г. от крупного рогатого скота в колхозе Ленин-Юля Дангаринского производственного управления Таджикской ССР и используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.

Штамм Азия-1 48 имеет следующие характеристики, представленные в таблице 1.

Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в 2% концентрации и последующее центрифугирование. В качестве инактиванта используют формальдегид, аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) или бинарный этиленимин (БЭИ). В качестве адъюванта - гидроокись алюминия (ГОА) с сапонином или масляный адъювант.

Недостаток вакцины - прототипа состоит в том, что она не обеспечивает удовлетворительной защиты против вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока.

Известны способы изготовления противоящурной ГОА-формолвакцины из афтозного, лапинизированного и культурального вируса типа Азия-1 (2).

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из афтозного вируса типа Азия-1 КРС, включающий изготовление вируссодержащей суспензии, очистку, концентрирование, инактивацию и сорбцию вируса на ГОА (6).

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из лапинизированного вируса типа Азия-1, включающий заражение новорожденных крольчат и репродукцию в них вируса, приготовление вируссодержащей суспензии, сорбцию вируса на ГОА, инактивацию вируса формалином и теплом, добавление сапонина (7).

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из лапинизированного вируса типа Азия-1, включающий заражение новорожденных крольчат, репродукцию в них вируса, получение вируссодержащей суспензии, ее очистку, сорбцию вируса на ГОА и инактивацию вируса формалином (8).

Известен способ приготовления вакцины против ящура типа Азия-1, включающий культивирование вируса ящура на переживающей ткани эпителия языка крупного рогатого скота со сменой питательной среды при непрерывной аэрации и перемешивании (9).

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из лапинизированного вируса типа Азия-1, включающий культивирование вируса, его очистку, инактивацию и последующее эмульгирование полученного антигена с масляным адъювантом (10).

Известен способ получения противоящурной ГОА-формолвакцины из лапинизированного вируса типа Азия-1, включающий заражение новорожденных крольчат и репродукцию в них вируса, приготовление вируссодержащей суспензии на солевом изотоническом растворе Хенкса, Эрла, Тироде или Дульбекко с добавлением 0,5% гидролизата лактальбумина или казеина, очистку вируссодержащей суспензии 5-10% хлороформа, сорбцию вируса на ГОА, инактивацию вируса формальдегидом и последующее добавление сапонина (11).

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из культурального вируса типа Азия-1, включающий заражение перевиваемой линии клеток свиных почек JB-RS-2 клон 3 и репродукцию в них вируса, очистку вируссодержащей суспензии центрифугированием или хлороформом или 3-хлорэтиленом, инактивацию вируса формалином и последующее эмульгирование полученного антигена с масляным адъювантом (12).

Основным недостатком известных способов изготовления противоящурных вакцин из вируса типа Азия-1 является то, что полученные в соответствии с ними вакцины обладают низкой иммуногенной активностью и не обеспечивают удовлетворительной защиты против вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока (Иран).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления вакцины против вируса ящура типа Азия-1, включающий репродукцию вирусного антигена в чувствительной биологической системе, очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей, инактивацию вируса, концентрирование полученного антигена и последующее соединение концентрата антигена с адъювантом (5).

Недостатком способа-прототипа является то, что полученная в соответствии с ним вакцина обладает также низкой иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты против вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока.

При возникновении заболевания вакцина из производственного штамма Азия-1 48 не обеспечивала удовлетворительной защиты иммунизированных животных. Во ВНИИЗЖ в результате лабораторных исследований афтозного материала, выделенного от больных животных, был установлен вирус типа Азия-1, имеющий антигенные отличия от штамма Азия-1 48 в реакции связывания комплемента и реакции серонейтрализации вируса. Это свидетельствует о несоответствии средств специфической профилактики ящура типа Азия-1, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Закавказья и Ближнего Востока.

В задачу создания настоящих изобретений входила разработка высокоиммуногенной вакцины против вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока, и способа ее изготовления.

Технический результат от использования предлагаемых изобретений заключается в повышении иммуногенной активности вакцины против ящура типа Азия-1, обеспечивающей защиту против вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока (Иран).

Указанный технический результат достигнут созданием группы изобретений, образующих единый изобретательский замысел. В группу включены изобретения, одно из которых предназначено для получения другого.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура типа Азия-1, охарактеризованной следующей совокупностью признаков: 1) вакцина против ящура типа Азия-1; 2) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов (146S+75S) вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000; 3) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов (146S+75S) вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 взят в эффективном количестве; 4) из инактивантов АЭЭИ; 5) полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) в качестве средства для очистки суспензии от балластных примесей; 6) из адъювантов гель ГОА; 7) сапонин в качестве дополнительного адъюванта; 8) из адъювантов масляный адъювант; 9) поддерживающая среда;
10) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, адъюванты гель ГОА и сапонин, поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - по меньшей мере 2,0
Гель ГОА - 1132,0-2108,0
Сапонин - 750,0
Поддерживающая среда - 997140,0-998116,0;
11) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, масляный адъювант и поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - По меньшей мере 4,0
Масляный адъювант - 500000,0-700000,0
Поддерживающая среда - 299996,0-499996,0
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) вакцина против ящура типа Азия-1;
2) авирулентный и очищенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000;
3) авирулентный и очищенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 взят в эффективном количестве;
4) адъювант;
5) поддерживающая среда.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) из адъювантов вакцина содержит гель ГОА;
2) из адъювантов вакцина содержит дополнительно сапонин;
3) из адъювантов вакцина содержит масляный адъювант;
4) авирулентный и очищенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, адъюванты гель ГОА и сапонин, поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - По меньшей мере 2,0
Гель ГОА - 1132,0-2108,0
Сапонин - 750,0
Поддерживающая среда - 997140,0-998116,0
5) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, масляный адъювант и поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - По меньшей мере 4,0
Масляный адъювант - 500000,0-700000,0
Поддерживающая среда - 299996,0-499996,0
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) вакцина против ящура типа Азия-1;
2) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура гомологичного штамма;
3) адъювант;
4) поддерживающая среда.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком изобретения является то, что из штаммов вакцина содержит штамм 1737/Грузия/2000 вируса ящура типа Азия-1, взятый в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) из адъювантов вакцина содержит гель ГОА;
2) из адъювантов вакцина содержит дополнительно сапонин;
3) из адъювантов вакцина содержит масляный адъювант;
4) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, адъюванты гель ГОА и сапонин, поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - По меньшей мере 2,0
Гель ГОА - 1132,0-2108,0
Сапонин - 750,0
Поддерживающая среда - 997140,0-998116,0
5) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, масляный адъювант и поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - По меньшей мере 4,0
Масляный адъювант - 500000,0-700000,0
Поддерживающая среда - 299996,0-499996,0
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает защиту против ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока (Иран).

Штамм Азия-1 1737/Грузия/2000 является новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа Азия-1.

Указанный технический результат достигнут также созданием способа изготовления вакцины против ящура типа Азия-1, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1) способ изготовления вакцины против ящура типа Азия-1;
2) вирусный антиген репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21;
3) в качестве вирусного антигена используют вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000;
4) вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 9-14 ч при 35-36,5^oС;
5) для изготовления вакцины используют суспензию вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 с титром не меньше 7,0 lgТЦД₅₀/мл и содержанием 146S+75S компонентов не меньше 0,5 мкг/мл;
6) сразу после окончания цикла репродукции вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 подвергают инактивации;
7) вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 инактивируют АЭЭИ в концентрации 0,025-0,05%;
8) вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 инактивируют АЭЭИ в течение 12-24 ч при 36-37,5^oС и рН 7,2-7,6;
9) суспензию антигена очищают от балластных примесей и возможных контаминантов добавлением в нее флокулянта-антисептика ПГМГ в концентрации 0,005-0,007%;
10) балластные примеси отделяют из суспензии антигена седиментацией с последующей декантацией;
11) для изготовления вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал в виде эффективного количества иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000;
12) для изготовления адсорбат-вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, по меньшей мере, 2,0 мкг/мл;
13) для изготовления адсорбат-вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 концентрируют сорбцией на гель ГОА, который добавляют в суспензию антигена в концентрации 2-5%;
14) для изготовления адсорбат-вакцины к концентрату антигена добавляют дополнительно адъювант сапонин в концентрации, по меньшей мере, 0,075%;
15) для изготовления эмульсионной вакцины антиген концентрируют проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем;
16) для изготовления эмульсионной вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, по меньшей мере, 4,0 мкг/мл;
17) для изготовления эмульсионной вакцины концентрат антигена соединяют с масляным адъювантом в соотношении 3:7-1:1.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ изготовления вакцины против ящура типа Азия-1;
2) вирусный антиген репродуцируют в чувствительной биологической системе;
3) в качестве вирусного антигена используют вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 в эффективном количестве;
4) инактивация вируса;
5) очистка антигена от балластных примесей;
6) концентрирование антигена;
7) соединение концентрата антигена с адъювантом.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве чувствительной биологической системы используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 9-14 ч при 35-36,5^oС;
3) сразу после окончания цикла репродукции вирус Азия-1 1737/Грузия/2000 подвергают инактивации;
4) вирус ящура Азия-1 1737 /Грузия/2000 инактивируют АЭЭИ в концентрации 0,025-0,05%;
5) вирус ящура Азия-1 1737 /Грузия/2000 инактивируют в течение 12-24 ч при 36-37,5^oС и рН 7,2-7,6;
6) суспензию антигена очищают от балластных примесей добавлением ПГМГ в концентрации 0,005-0,007%;
7) балластные примеси отделяют от суспензии антигена седиментацией с последующей декантацией;
8) для изготовления адсорбат-вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал концентрируют сорбцией на гель ГОА, который добавляют в суспензию в концентрации 2-5%;
9) для изготовления адсорбат-ввакцины используют авирулентный и очищенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, по меньшей мере, 2,0 мкг/мл;
10) для изготовления адсорбат-ввакцины к концентрату антигена добавляют дополнительно адъювант сапонин в концентрации, по меньшей мере, 0,075%;
11) для изготовления эмульсионной вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал концентрируют проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем;
12) для изготовления эмульсионной вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, по меньшей мере, 4,0 мкг/мл;
13) для изготовления эмульсионной вакцины концентрат антигена соединяют с масляным адъювантом в соотношении 3:7-1:1.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ изготовления вакцины против ящура типа Азия-1;
2) вирусный антиген репродуцируют в чувствительной биологической системе;
3) очистка вируссодержащей суспензии от балластных примесей;
4) инактивация вируса;
5) концентрирование полученного антигена;
6) соединение концентрата антигена с адъювантом. По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:
1) в качестве вирусного антигена используют штамм 1737/Грузия/2000 вируса ящура типа Азия-1;
2) вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 используют в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве чувствительной системы культивирования используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 9-14 ч при 35-36,5^oС;
3) сразу после окончания цикла репродукции вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 подвергают инактивации;
4) вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 инактивируют АЭЭИ в концентрации 0,025-0,05%;
5) вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 инактивируют в течение 12-24 ч при 36-37,5^oС и рН 7,2-7,6;
6) суспензию антигена очищают от балластных примесей добавлением ПГМГ в концентрации 0,005-0,007%;
7) балластные примеси отделяют из суспензии антигена седиментацией с последующей декантацией;
8) для изготовления адсорбат-вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, по меньшей мере, 2,0 мкг/мл;
9) для изготовления адсорбат-вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал концентрируют сорбцией на гель ГОА, который добавляют в суспензию в концентрации 2-5%;
10) для изготовления адсорбат-вакцины к концентрату антигена добавляют дополнительно адъювант сапонин в концентрации, по меньшей мере, 0,075%;
11) для изготовления эмульсионной вакцины авирулентный очищенный антигенный материал концентрируют проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем;
12) для изготовления эмульсионной вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, по меньшей мере, 4,0 мкг/мл;
13) для изготовления эмульсионной вакцины концентрат антигена соединяют с масляным адъювантом в соотношении 3:7-1:1.

Вакцина, полученная предлагаемым способом, обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает защиту животных против вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока (Иран).

Достижения технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении вакцины используют новый штамм 1737/Грузия/2000 вируса ящура Азия-1. Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается за счет того, что инактивацию вируса АЭЭИ осуществляют сразу по окончании цикла его репродукции, что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины без снижения качества инактивации вируса.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается также за счет использования флокулянта-антисептика ПГМГ для очистки суспензии антигена от балластных примесей и одновременной инактивации возможных контаминантов (13).

Исходный вирус для получения штамма 1737/Грузия/2000 вируса ящура типа Азия-1 выделен от больных коров в Богдановском районе Грузии в июле 2000 года.

Производственный штамм Азия-1 1737/Грузия/2000 получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм Азия-1 1737/Грузия/2000 по данным РСК, РН и результатам секвенирования участков генома значительно отличается от производственного штамма Азия-1 48, а также от других штаммов вируса ящура типа Азия-1, имеющихся в коллекции ВНИИЗЖ. Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации 26 января 2001 года под регистрационным 1737/Грузия/2000/ДЕП.

Штамм Азия-1 1737/Грузия/2000 обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивает получение противоящурной инактивированной вакцины, создающей защиту восприимчивых животных против вируса ящура типа Азия-1, вызывающего вспышки заболевания в странах Закавказья и Ближнего Востока.

Штамм 1737/Грузия/2000 вируса ящура типа Азия-1 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм Азия-1 1737/Грузия/2000 относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, виду Aphtae, серотипу Азия-1 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм Азия-1 1737/Грузия/2000 относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА и РН. Иммунизация КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН.

При определении антигенного соответствия штамма Азия-1 1737/Грузия/2000 с производственным штаммом и полевыми изолятами вируса ящура типа Азия-1, выделенными на протяжении 1964-2000 гг. на территории стран СНГ и ряда других государств мира, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VP1.

Биотехнологические характеристики
Штамм Азия-1 1737/Грузия/2000 проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Вирус Азия-1 1737/Грузия/2000 репродуцируется в монослойной первично-трипсинизированной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 11-16 ч инкубирования накапливается до 7,0-8,0 lg ТЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 6-8 ч. После 3-4 пассажей инкубирования накапливается до 6,0-8,0 lg ТЦД₅₀/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм Азия-1 1737/Грузия/2000 является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 7•10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой мол. массой 2,8•10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует. Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства
Масса вириона - 8,4•10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность - 1,45 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам
Вирус Азия-1 1737/Грузия/2000 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,0-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм Азия-1 1737 /Грузия/2000 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа Азия-1. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная вакцинопрофилактика вновь возникающих очагов болезни, для чего необходима высокоэффективная вакцина.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемых изобретений, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существующим признакам предлагаемых изобретений. Определение из перечня выявленных аналогов прототипов, как наиболее близких по совокупности признаков аналогов, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины и способа ее изготовления, изложенных в независимых пунктах формулы.

Следовательно, заявляемые изобретения соответствуют условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемых решений условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительные части независимых пунктов формулы. Результаты поиска показали, что предлагаемые решения не вытекают для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемых изобретений), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемых изобретений преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемые вакцина и способ ее изготовления соответствуют условию патентоспособности "изобретательский уровень". Сущность предлагаемых изобретений пояснена примерами их исполнения.

Пример 1
Для изготовления адсорбат-вакцины вирус ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,01-0,1 ТЦД₅₀ на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре 35-36,5^oС. Через 8-10 ч инкубирования проводят подсчет живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то инкубирование продолжают еще 1-3 ч. При достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S+75S компонентов. Количество 146S+75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/мл. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 ч при 36-37,5^oС и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 ч в течение 3-5 мин. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до 4-8^oС. В охлажденную суспензию добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.

Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка и 146S+75S компонентов вируса, стерильность. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем ГОД.

Расчетный объем геля ГОА 3% концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 мин. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем надосадочной жидкости или измеряют объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 мг/мл, р<0,01, n=10, a концентрация 146S+75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 2,0 мкг/мл. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации, по меньшей мере, 0,075%. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и проводят контроль стерильности по ГОСТ 28085-89.

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 мл, затем подкожно в дозе 10 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Оптимальный компонентный состав адсорбат-вакцины против ящура типа Азия-1 приведен в таблице 2. В таблицах 3, 4, 5 и 6 отражены результаты культивирования вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 и вируса Азия-1 48 в культиваторах КС-40 и КМ -2000, из которых следует, что штамм вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 имеет более короткий срок репродукции, что обусловило необходимость выбора оптимальных условий культивирования вируса и множественности дозы заражения.

В таблице 7 приведены результаты исследований влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные компоненты вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000, вируса ящура Азия-1 48. Приведенные в таблице 7 данные свидетельствуют о том, что иммуногенные компоненты нового штамма вируса ящура Азия-1 1737 /Грузия/2000 не уступает в устойчивости к инактивации и очистке в условиях производства вирусу ящура Азия-1 48. Особенно важен тот факт, что в процессе инактивации и очистки вируса Азия-1 1737/Грузия/2000 не произошло изменений в количестве 146S+75S компонентов, полученных при репродукции вируса.

Пример 2
Проведены испытания адсорбат вакцин из вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 на КРС массой 140-180 кг. Рецептура вакцин указана в таблице 8. Из результатов, представленных в таблице 8, можно заключить, что адсорбат-вакцина из штамма 1737/Грузия/2000 вируса ящура типа Азия-1 индуцирует достаточный иммунный ответ, защитивший животных от контрольного заражения. Кроме того, необходимо отметить увеличение количества ВНА в сыворотке крови КРС уже на 10 ДПВ.

Таким образом, задача создания адсорбат-вакцины на основе нового штамма вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 решена.

Пример 3
Для изготовления эмульсионной вакцины вирус ящура типа Азия-1 штамм 1737/Грузия/2000 репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивируют, очищают от балластных примесей и контролируют полученный антиген на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S+75S компонентов вируса и стерильность так, как описано в примере 1.

Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией. Для этого используют ультрафильтры БТУ 0,5-2. Фильтрование ведут под давлением 1,5 атм.

Полученный концентрат антигена хранят при 4-6^oС до момента использования в вакцине. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7-1:1 соответственно. В результате получают инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа Азия-1, которая представляет собой молокоподобную жидкость, нерастворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается в месте введения, не вызывает образования абсцессов, не вызывает общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней в дозе 1 мл, для КРС - в дозе 5 мл и для овец - в дозе 1 мл через 3-21 день после введения. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС и овцам - подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 4 мкг 146S+75S компонентов.

Полученная эмульсионная вакцина против ящура типа Азия-1 имеет оптимальный компонентный состав (мкг/мл), представленный в таблице 9.

Пример 4
Эмульсионную вакцину против ящура Азия-1 31737/Грузия/2000 готовят так, как описано в примерах 1, 2, 3. Отличие состоит в том, что необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена осаждением ПЭГ-115.

Пример 5
Проведены испытания эмульсионной вакцины против ящура типа Азия-1, изготовленной так, как описано в примере 3, и содержащей 6,8 мкг иммуногенных компонентов в прививной дозе.

Представленные в таблице 10 данные свидетельствуют о способности предлагаемой вакцины защитить всех 15 привитых свиней от контрольного заражения. Титр ВНА в сыворотке крови на 21 ДПВ составил 5,5 лог₂. Объем прививной дозы вакцины должен содержать не менее 7 ИмД₅₀. Опытная вакцина индуцировала высокий уровень гуморального иммунитета у свиней и обеспечила достижение 40 ИмД₅₀ в прививном объеме.

Следовательно, задача создания эмульсионной вакцины на основе вируса ящура Азия-1 1737/Грузия/2000 выполнена.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании группы предлагаемых изобретений следующей совокупности условий:
- вакцина против ящура типа Азия-1 и способ ее изготовления, воплощающие предлагаемые изобретения, предназначены для использования в сельском хозяйстве, а именно, в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для группы предлагаемых изобретений в том виде, как они охарактеризованы в независимых пунктах формулы изобретения, подтверждена возможность их осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемой вакцины против ящура типа Азия-1 и способа ее изготовления достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретений.

Следовательно, группа предлагаемых изобретений соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Сюрин В. Н. и др. Вирусные болезни животных. -М.-ВНИТИБП, 1998.-c. 544-547.

2. Бурдов А. Н. , Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур/Под ред. А.Н. Бурдова. -М.: Агропромиздат, 1990.-c.231-250.

3. Ререр X. Ящур /Пер. с нем. Г.А. Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. -М.: Колос, 1971.-432с.

4. Собко А.И. Идентификация штаммов вируса ящура в комплексе противоэпизоотических мероприятий. Докт. дисс., Покров, 1972 г.

5. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.91 г. (прототип).

6. Пат. ФРГ 1138509; 30h, 6; 16.05.63 г.

7. Пат. ФРГ 1161387; 30h, 6; 08.05.69 г.

8. ТУ 10-09-123-91 "Универсальная моно- и поливалентная сорбированная вакцина против ящура типов А, О, С и Азия-1.- Утверждены ГУВ МСХ СССР, 16.06.91 г.

9. Пат. СССР 352441, А 61 К 23/00, 21.09.72 г.

10. Авт. свид. СССР 411131, С 12 К 5/00, 15.01.74 г.

11. Авт. свид. СССР 561732, С 12 К 5/00, А 61 К 39/26; 15.06.77 г.

12. Пат. Франции 2088038; А 61 К 27/00, С 12 К 5/00; 07.01.72 г.

13. Пат. РФ 2054039; С 12 N 7/02, А 61 К 39/135; 10.02.96 г.

Формула изобретения

1. Вакцина против ящура типа Азия-1, содержащая авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов вируса ящура типа Азия-1 гомологичного штамма, адъювант и поддерживающую среду, отличающаяся тем, что из штаммов вакцина содержит штамм вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, вид Aphtae, тип Азия-1, коллекция ВГНКИ № 1737/Грузия/2000/ДЕП, в эффективном количестве.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит адсорбент гель гидроокиси алюминия.

3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит дополнительно сапонин.

4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит масляный адъювант.

5. Вакцина по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов вируса ящура типа Азия-1 штамма № 1737/Грузия/2000, гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду в соотношении, мкг/мл:

Антигенный материал По меньшей мере 2,0

Гель гидроокиси алюминия 1132,0 - 2108,0

Сапонин 750,0

Поддерживающая среда 997140,0 -998116,0

6. Вакцина по п.1 или 4, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов вируса ящура типа Азия-1 штамма № 1737/Грузия/2000, масляный адъювант и поддерживающую среду в соотношении, мкг/мл:

Антигенный материал По меньшей мере 4,0

Масляный адъювант 500000,0 - 700000,0

Поддерживающая среда 299996,0 - 499996,0

7. Способ изготовления вакцины против ящура типа Азия-1, включающий репродукцию вирусного антигена в чувствительной биологической системе, очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей, инактивацию вируса, концентрирование полученного антигена и последующее соединение концентрата антигена с адъювантом, отличающийся тем, что в качестве вирусного антигена используют штамм вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, вид Aphtae, тип Азия-1, коллекция ВГНКИ № 1737/Грузия/2000, в эффективном количестве.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве чувствительной биологической системы используют суспензионную культуру клеток ВНК-21.

9. Способ по п.7 или п.8, отличающийся тем, что вирус ящура типа Азия-1 № 1737/Грузия/2000 культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 8-14 ч при 35-36,5°С.

10. Способ по любому из пп.7-9, отличающийся тем, что сразу после окончания цикла репродукции вирус ящура подвергают инактивации.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что для инактивации вируса ящура используют аминоэтилэтиленимин в концентрации 0,025-0,05%.

12. Способ по п.10 или 11, отличающийся тем, что вирус ящура инактивируют в течение 12-24 ч при 36-37,5°С и рН 7,2-7,6.

13. Способ по п.7, отличающийся тем, что для очистки суспензии антигена от балластных примесей используют полигексаметиленгуанидин в концентрации 0,005-0,007%.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что балластные примеси отделяют из суспензии антигена седиментацией с последующей декантацией.

15. Способ по любому из пп.7-14, отличающийся тем, что для изготовления адсорбат-вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал концентрируют сорбцией на гель гидроокиси алюминия в концентрации 2-5%.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что для изготовления адсорбент-вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных компонентов вируса Азия-1 штамма № 1737/Грузия/2000 по меньшей мере 2,0 мкг/мл.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что для изготовления адсорбат-вакцины к концентрату антигена добавляют дополнительно адъювант-сапонин в концентрации по меньшей мере 0,075%.

18. Способ по любому из пп.7-14, отличающийся тем, что для изготовления эмульсионной вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал концентрируют проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что для изготовления эмульсионной вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных компонентов вируса ящура Азия-1 штамма № 1737/Грузия/2000 по меньшей мере 4,0 мкг/мл.

20. Способ по п.7 или 19, отличающийся тем, что для изготовления эмульсионной вакцины против ящура типа Азия-1 концентрат антигена соединяют с масляным адъювантом в соотношении 3:7-1:1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6